Stollingstesten
Websites
Primaire hemostase
Plaatjesaggregatiemetingen (LTA)
Achtergrond
Wanneer een patiënt een objectief vastgestelde bloedingsneiging heeft zonder dat deze verklaard kan worden door een verlaagd bloedplaatjes aantal zijn aggregatie studies nog steeds de beste optie om de aard van de afwijking op te sporen. Na afname van het bloed moet dan eerst plaatjes-rijk plasma (PRP) bereid worden. Centrifugatie van het bloed (10 minuten, 200 g) verwijdert rode en witte bloedcellen terwijl de meeste (circa 85%) van de bloedplaatjes achterblijven in het plasma. Plaatjes aggregatie studies worden uitgevoerd in een aggregometer. In principe bestaat een aggregometer uit een cuvet waarin plaatjesrijk plasma (PRP) aanwezig is. Het minimale bloedplaatjesaantal in PRP nodig voor een goede aggregatie hangt af van de stimulus. Voor de meest gebruikte stimuli als collageen, ADP of ristocetine is minimaal 75.000 plaatjes/μL nodig. De bloedplaatjes worden continu geroerd. Door de cuvet gaat een lichtbundel en het doorvallend licht wordt gemeten. Vervolgens wordt een activator voor de aggregatie toegevoegd, bijv. ADP, collageen of arachidonzuur. De plaatjes gaan nu aggregeren en zullen samenklonteren tot een bloedplaatjesprop die door het roeren blijft zweven in het plasma. Hierdoor zal het resterende plasma in de cuvet meer licht doorlaten. Dit doorvallend licht wordt gemeten en continu geregistreerd. De optische weergave van de aggregatie (verandering van de lichtdoorlaatbaarheid van het PRP) bevat veel informatie over het functioneren van het bloedplaatje. De optische aggregatie curve kan verdeeld worden in drie fasen. Tijdens de shape change (fase 1) veranderen de bloedplaatjes van vorm, ze vormen lange uitlopers (pseudopodia) waarmee ze aan elkaar kunnen verkleven. Tijdens de primaire aggregatie verkleven de plaatjes met elkaar zonder dat de inhoud van hun granula naar buiten komt (fase 2). Wanneer de inhoud van de granula wordt uitgescheiden (release reactie) vindt de secundaire aggregatie plaats (fase 3).
Bloedplaatjes reageren verschillend op de diverse stimulatoren. ADP is een zwakke stimulator, bij 1 μM ADP is de aggregatie reversibel en is er geen secretie, bij 2-3 μM treedt er bifasische aggregatie op met secretie en bij >5 μM ADP is de aggregatie monofasisch.
Voor de interpretatie van de aggregatiecurven zijn twee mechanismen essentieel die beide vooral werken op de secundaire aggregatie, de secretie van o.a. ADP uit de dense bodies en de vorming van tromboxaan A2. Wanneer er te weinig ADP is in de dense bodies, ontbreekt de secundaire aggregatie na ADP en adrenaline stimulatie. De aggregatie door collageen en arachidonzuur zijn verminderd. Bij afwezigheid van de vorming van tromboxaan A2 is het beeld vergelijkbaar, alleen is er geen enkele response na arachidonzuur. Bij erfelijke afwijkingen in de fibrinogeenreceptor aIIbb3 (ziekte van Glanzmann) ontbreken alle aggregaties (behalve de agglutinatie onder invloed van ristocetine).
Aangezien ADP vooral in de dense bodies opgeslagen is, wordt bij storage pool disease een verhoogde ATP/ADP ratio gezien.
Bron: Stollingsklapper
Voorbeelden
Platelet Function Analyzer (PFA)
Algemeen
De closure time (CT) van de PFA-100® is bijzonder gevoelig voor congenitale en verworven trombocytopenieën, met name bij ernstige trombocytopathie, maar geeft een wisselend beeld bij mildere trombocytopathiën
Beneden 100x10^9 plaatjes/l is de CT omgekeerd evenredig met het plaatjesaantal.
Bij een hematocriet lager dan 25% is de CT verlengd.
De CT is zeer gevoelig voor afwijkingen van VWF. De CT is verlengd bij ernstige trombocytopathieën. Afwijkingen in stollingsfactoren beïnvloeden de PFA-100® niet.
Voordelen: snel (<10 minuten per cartridge), weinig bloed nodig (900 microliter/cartridge), geen littekens, leeftijdsonafhankelijk, zeer gevoelig voor afwijkingen van VWF
Nadelen: matige reproduceerbaarheid, interpretatie nodig, slechte correlatie defecten bloedplaatjesfunctie, gevoelig voor anemie en trombopenie
Bloedingstijd
De bloedingstijd is de tijd tussen het aanbrengen van een gestandaardiseerd wondje op de onderarm en het moment dat de bloeding stopt. Met het bepalen van de bloedingstijd wordt de tijd gemeten die nodig is voor de in vivo vorming van een hemostatische prop in de huid. De bloedingstijd wordt tegenwoordig vaak beschouwd als een obsolete screeningstest voor het evalueren van de primaire hemostase. De bloedingstijd is inderdaad niet geschikt voor het voorspellen van een bloedingsrisico bij een invasieve ingreep. Het dient dan ook niet gebruikt te worden als pre-operatieve screening. De bloedingstijd is wel een goede test voor het meten van de primaire hemostase in de huid maar geeft geen of onvoldoende informatie over de hemostase in andere organen. De bloedingstijd is wel geschikt om de functie van bloedplaatjes te onderzoeken bij een patiënt met een objectief vastgestelde bloedingsneiging. Het gebruik van de bloedingstijd als screeningstest wordt steeds meer ontmoedigd, omdat de test belastend is voor de patiënt. Er zijn tegenwoordig alternatieve en voor de patiënt minder belastende testen op de markt als globale bloedplaatjesfunctie test. Deze testen hebben echter hetzelfde probleem als de bloedingstijd, ze zijn niet geschikt voor het voorspellen van een bloedingsrisico bij een invasieve ingreep.
ROTEM
ROTEM is tromboelastografie om op basis van citraat volbloed in korte tijd een globaal beeld van de stolling te krijgen
Vooral geschikt in spoedeisende situaties als POCT, bv. peri-operatief, trauma of op IC
De sensor pin beweegt heen en weer ten opzichte van de cuvette. Naarmate de viscositeit toeneemt, wordt de uitslag minder. Dit signaal wordt omgezet naar een trombolastogram. Hoe groter de amplitude, hoe groter de viscositeit.
Niet gedetecteerd door ROTEM
vWF deficiëntie of dysfunctie
Flow-afhankelijke trombocytenfunctie
Trombocytopathie
Aanwezigheid trombocytenaggregatieremmers, DOACs, VKA of LMWH
Effect acidose
Effect hypothermie
Parameters ROTEM
Parameters
Clotting time (CT): tijd start test tot stolselvorming (in seconden); is een weergave van 'initiation fase'
Clot formation time (CFT): tijd start stolselvorming tot amplitude van 20 mm (in seconden); is een weergave van 'propagation fase'
Maximum clot formation (MCF): maximale amplitude (in mm); weergave van sterkte van het stolsel
A5 en A10: amplitude na 5 en 10 minuten; voorspellend voor MCF, dus kunnen gebruikt worden om al eerder uitspraak te doen over sterke van stolsel
Maximum lysis (ML): afname van MCF in procenten na 60 minuten; weergave van fibrinolyse
Lysis onset time: tijdstip waarop er een afname is van MCF van 15%
De test bestaat uit vier onderdelen (APTEM wordt vaak niet gedaan)
EXTEM (extrinsiek tromboelastogram):
Stollingsactivatie door weefselfactor (tromboplastine) analoog aan PT.
Afhankelijk van: stollingsfactoren (VII, X, V, II), fibrinogeen, trombocyten en fibrinolyse
Interpretatie: CT, CFT, MCF (en A5/A10) en ML
INTEM (intrinsiek tromboelastogram):
Stollingsactivatie door ellaginezuur analoog aan aPTT en ACT.
Afhankelijk van: stollingsfactoren (XII, XI, IX, VIII, X, V, II), trombocyten, fibrinogeen en fibrinolyse.
Gevoelig voor heparine (verlenging CT). INTEM wordt vrijwel in praktijk alleen gebruikt voor aantonen van heparine-effect.
Interpretatie: CT
FIBTEM (fibrinogeen tromboelastogram):
Stollingsactivatie door ellanginezuur (zoals bij INTEM)
Toevoeging cytochalasine D om effect trombocyten volledig te blokkeren.
Amplitude die overblijft is een directe weeergave van hoeveelheid en functie van fibrinogeen.
Interpretatie: MCF (en A5/A10)
HEPTEM (heparine tromboelastogram):
Stollingsactivatie door ellanginezuur (zoals bij INTEM)
Toevoeging heparinase om heparine te degraderen.
Interpretatie: CT
Indien CT verlengd bij INTEM en normaal bij HEPTEM, dan bevestigt dat heparine-effect.
APTEM (aprotinine tromboelastogram):
Stollingsactiviteit door weefselfactor (zoals bij EXTEM)
Toevoeging van aprotinine om fibrinolyse te remmen.
APTEM is een controlest voor EXTEM: door vergelijking kan hyperfibrinolyse geëvalueerd worden.
Interpretatie: indien bij EXTEM afname van amplitude wordt gezien na 10-20 minuten en bij APTEM niet, dan is sprake van hyperfibrinolyse
Referentiewaarden ROTEM
Interpretatie ROTEM
Casuistiek ROTEM
Normale stolling
Fibrinogeen tekort
Lage A10/MCF
Trombopenie
Verlaagde A10/MCF EXTEM
Normale A10/MCF FIBTEM
Hyperfibrinolyse
Afname amplitude EXTEM 10-20 min en ML
Normale amplitude en ML APTEM
Heparine
Verlengde CT INTEM
Normale CT HEPTEM
Stollingsfactoren deficiëntie
Verlengde CT/CFT
Secundaire hemostase
Stollingscascade
- Anti-trombotisch in zeer lage concentraties (met name activatie van proteine C via trombomoduline)
- Pro-trombotisch in hogere concentraties (met name omzetting van fibrinogeen, activatie van factor V/VIII/XI en activatie van bloedplaatjes
- Anti-fibrinolytisch in nog hogere concentraties (activatie van TAFI en FXIII, en inactivatie van urokinase)
Fibrinolyse
Trombomoduline-trombine-proteine C systeem op endotheel
PT & aPTT
PT: toevoegen weefselfactor (tromboplastine) aan citraatplasma waarna activatie van FVII plaatsvindt
aPTT: toevoegen fosfolipiden en elanginezuur waarna activatie van FXII plaatsvindt
Algoritme PT + aPTT
Fibrinogeen en trombinetijd
Zowel de fibrinogeenbepaling volgens Claus als de trombinetijd zijn gebaseerd op de toevoeging van trombine aan het plasma waarna de snelheid van vorming van het fibrinestolsel wordt bepaald
Fibrinogeen wordt standaard gemeten middels de Claus methode. Hierbij wordt trombine toegevoegd in hoge concentratie (50 IE/mL) aan platelet-poor plasma waardoor de stoltijd alleen afhankelijk is van de fibrinogeen concentratie en functie. Dit is in essentie dus een functionele meting. De fibrinogeenconcentratie wordt bepaald door vergelijking met een referentiecurve o.b.v. gestandardiseerd platetel-poor plasma.
De trombinetijd wordt verricht met een lage concentratie trombine (3 IE/mL) waardoor de test óók gevoelig is voor remmers van trombine in plasma (bv. heparine, dabigatran of splijtproducten).
Factoractiviteit: chromogene en one-stage assays
Chromogene assay
One-stage assay
2. Het principe is dat gekeken wordt naar mate van de aPTT correctie wanneer patiëntenplasma 1:1 wordt gemengd met plasma dat deficiënt is voor de te meten factor (concentratie <1 IU/dL) maar normale concentraties heeft voor alle andere factoren.3. De aPTT van het patiëntenplasma (patiëntenplasma gemengd met deficiënt plasma) en referentieplasma (pooled plasma gemengd met deficiënt plasma) wordt gemeten in verschillende verdunningen, waarbij een 1/10 verdunning gemarkeerd wordt als het 100% (1.0 IU/mL) referentiepunt4. Het verschil tussen de aPTTs wordt volledig verklaard door de factorconcentratie (bv. FVIII) uit het patiëntenplasma. Afgelezen op een log-lineaire lijn kan het factorpercentage berekend worden.
Emicizumab
Plasmaconcentratie wordt gemeten met modified one-stage assay met specifieke calibratoren
aPTT wordt significant verkort door emicizumab
Indien noodzaak tot monitoring factor VIII tijdens emicizumab: gebruik bovine (non-human) eiwitten (factor IX en X in chromogene assay) in reagens
Bethesda assay (remmer)
FVIII remmers zijn tijdsafhankelijk (i.t.t. FIX remmers). Sommige remmers hebben niet een direct effect. Daarom is incubatie gedurende 2 uur nodig.
1 Bethesda unit/ml remmer inactiveert 50% van de factor-VIII-activiteit in 1 mL plasma na twee uur incubatie met het verdunde plasma bij 37 °C. 100% residual FVIII = 0 Bu/mL remmer en 50% residual FVIII = 1 Bu/mL remmer
Nijmegen modificatie: De verdunningen van patiëntenplasma worden gedaan met FVIII deficiënt plasma
Remmermeting door patiëntenplasma in oplopende verdunning te mengen met normaal plasma en vervolgens de factor-VIII-concentratie in het mengsel gemeten middels aPTT
Indien FVIII activiteit bij patiënt >5 IU/dL, verhit dan eerst patiëntenplasma naar 56 graden gedurende 30 minuten om resterende FVIII te neutraliseren.
Meng patiëntenplasma (waarin geen FVIII meer zit maar wél de eventuele remmer) 1:1 met pool plasma (zodat alle FVIII uit de mix afkomstig is van pool plasma, wat ongeveer FVIII 100 IU/dL bevat). Maak een reeks verdunningen, en incubeer gedurende 2 uur op 37 graden.
Meng pool plasma (met dus FVIII concentratie 100 IU/dL) 1:1 met buffer (originele Bethesda assay) of FVIII deficiënt plasma (Nijmegen modificatie, verbetert stabiliteit van assay met lagere variatie dus met name aan te bevelen bij lage titer remmer <2 Bu/mL). Deze 1:1 mix bevat dus FVIII 50 IU/dL. Maak een reeks verdunningen, en incubeer gedurende 2 uur op 37 graden.
Meet residuele factor VIII activiteit met one-stage assay in gemengde patiëntplasma en gemengde pool plasma. Bereken de ratio van residuele FVIII activiteit in patiëntplasma vs. pool plasma. Als er géén remmer is, dan is de ratio 1. Er is een remmer aanwezig indien ratio <0.66.
Lees de remmerconcentratie af van een grafiek met logaritmische y-as (residuale factor VIII activiteit) vs remmer units (x-as). De remmertiter is de verdunning waarbij nog ongeveer 50 IU/dL residuele FVIII activiteit aanwezig is. Dus: als de verdunning van 1:50 een residuele FVIII activiteit geeft van ~50 IU/dL, dan is de remmertiter 50 Bu/mL.
Activated clotting time (ACT)
Volbloed stollingstest voor monitoren heparine-effect ten tijde van cardiale chirurgie, arteriële vaatchirurgie, PCI en ECMO
Een activator van de intrinsieke stollingscascade wordt toegevoegd aan volbloed waarna de tijd tot stolselvorming wordt gemeten in seconden
Betere sensitiviteit dan aPTT voor zeer hoge heparinedoseringen
Verlenging door: heparine, antifosfolipiden antistoffen, factordeficiënties, hypothermie na cardiopulmonale bypass, hemodilutie
Lupus anticoagulans
LAC zijn antistoffen (IgM, IgG, IgA) gericht tegen fosfolipiden of eiwitten die binden aan fosfolipiden (zoals β2-glycoproteïne I en protrombine). Door binding van de antistof wordt de affiniteit van β2-glycoproteïne I of protrombine voor fosfolipiden verhoogd. Hierdoor kan het eiwit-antistofcomplex competeren met stollingsfactoren voor de beschikbare katalytische fosfolipiden en worden de stollingstests verlengd.
Guidance van SSC is hier te vinden (2020)
Stap 1 = screening: uitvoeren van twee fosfolipidenafhankdelijke screeningstesten
Dilute Russell's viper venom time: gif afkomstig van slang (Russell's viper) activeert factor V en factor X door enzymen RVV-V en RVV-X. In de dRVVT assay wordt een lage, rate-limiting hoeveelheid fosfolipiden en gif toegevoegd waardoor de normale stoltijd ongeveer 30-40 seconden is. De aanwezigheid van antifosfolipiden antistoffen interfereert met coagulante rol van de fosfolipiden waardoor de dRVVT verlengt. Een normalied LAC ratio van >1.20 is afwijkend (zie onder).
Geoptimaliseerde / LAC-sensitieve aPTT (silica als activator en heel weinig fosfolipiden; silica clotting time, SCT). De aanwezigheid van antifosfolipiden antistoffen interfereert met coagulante rol van de fosfolipiden waardoor de SCT verlengt.
Indien DOAC aanwezig: toevoegen van DOAC remove. Indien VKA aanwezig: test alleen betrouwbaar bij INR <1.5-2.0
Stap 2 = mixing (alleen bij verlengde dRVVT of LAC-sensitieve aPTT): aantonen van een remmer door middel van een mengproef
Mengproef met toevoegen van pool plasma (1:1 ratio). Indien sprake is van een factordeficiëntie, dan normaliseert de dRVVT of SCT (ratio <1.20). In afwezigheid van antifosfolipiden antistoffen blijft de dRVVT of SCT verlengd. (ratio >1.20).
Stap 3 = confirmation: aantonen van fosfolipidenafhankelijkheid (ook verrichten indien negatieve mengproef, omdat de confirmatietest toch nuttig kan zijn in de interpretatie, zie sectie 3.4)
Toevoegen van overmaat fosfolipiden. Hierdoor verkort of normaliseert de verlengde screeningstest waarmee fosfolipidenafhankelijkheid aangetoond wordt (ratio >1.20).
Afkapwaarde: 99e percentiel van de lokale normale populatie
Interferentie / valkuilen
Vals-negatieve LAC:
Hoog factor VIII (acute fase) door verkorting/interferentie aPTT
Acute trombose: binding van APLA aan vers trombus
Zwangerschap (zowel fout-positief als fout-negatieve LAC). Mogelijk in eerste trimester wel betrouwbaar resultaat (bron). Ten minste 6 weken na zwangerschap testen, en bij voorkeur zelfs 3 maanden na zwangerschap.
Vals-positieve LAC
Antistolling (zie hier)
DOAC: vals-positieve bevindingen voorkomen door DOAC remove toevoegen. Indien geen DOAC remove beschikbaar: test ten minte 48 uur na laatste dosis (indien normale nierfunctie)
VKA: LAC niet te bepalen, tenzij INR laag is. Mixen met normaal plasma is niet aanbevolgen door zowel risico op vals negatieven (verdunning APLA) en vals positieven (onvoldoende correctie INR).
UFH: LAC niet te bepalen
LMWH (enkel bij supratherapeutische dosering): meet LAC bij voorkeur ten minste 12 uur na laatste gift, en zo dicht mogelijk op volgende gift; meet ook anti-factor Xa activiteit tegelijkertijd (om supratherapeutische dosis uit te sluiten)
Hoog CRP door binding aan fosfolipiden in reagens waardoor verlenging van fosfolipidenafhankelijke assays
Zwangerschap (zowel fout-positief als fout-negatieve LAC). Mogelijk in eerste trimester wel betrouwbaar resultaat (bron). Ten minste 6 weken na zwangerschap testen, en bij voorkeur zelfs 3 maanden na zwangerschap.
Normalized LAC ratio
Trombinegeneratie assay
Trombine heeft verschillende functies:
Procoagulant: omzetting fibrinogeen naar fibrine, activatie factor V, VIII en XI, plaatjesactivatie
Anticoagulant: binding aan trombomoduline op endotheel leidt tot activatie van proteine C
Trombinegeneratie assay
Pre-analytische voorwaarden: directe venepunctie, niet via buizenpost versturen, verwerk <1 uur, platelet-poor-plasma door 2x afdraaien (2500 g gedurende 15 min), toevoegen remmer contactactivatie aan citraatbuis (CTI) niet standaard nodig, invriezen -80 waarna 2 jaar te gebruiken (bron)
Toevoegen van tissue factor en fosfolipiden in verschillende concentratie
Zeer laag TF/zeer laag PL: analyse bloedingen / hypocoagulabiliteit (bv. hemofilie)
Hoger TF/zeer laag PL: analyse hypercoagulabiliteit (bv. factor V Leiden, roken, orale anticonceptiva)
Hoger TF/hoger PL: analyse patiënten op antistolling
'Typisch' experiment: 80 microliter plaatjesvrij plasma, 1 of 5 pM tissue factor met 4 microM 20 mol%, fosfatidylserine, 20 mol% fosfatidylethanolamine en 60 mol% fosfatidylcholine
Toevoegen van flurogenic substraat (ZGGR-AMC) (sensitiever dan chromogeen substraat) voor trombine met continue meting
Genereren van curve die de eerste afgeleide is van de fluorescentie curve
Beperkingen: ongewilde contactactivatie bij lage concentraties tissue factor (evt te verhelpen door toevoegen CTI)
D-dimeer
Degradatie fibrinePlasminogeen wordt onder invloed van tissue plasminogen activator (t-PA) omgezet in plasmine. Plasmine knipt fibrine waarna fibrin degradation products (FDP) van verschillende molecuulgrootte (hoog, intermediair en laag-moleculair gewicht) ontstaan. Het uiteindelijke product zijn D-dimeer/fragment E complexen (DD/E) die twee (door FXIIIa) gebonden D-domeinen en een E-domein bevat. Dit kan een enkele 228 kDa DD/E complex zijn. maar ook X-oligomeren van enkele duizenden kDA. D-dimeer verwijst dus naar een heterogene groep peptide framgnenten die gevormd worden door de afbraak van cross-linked fibrine door plasmine. De halfwaarde tijd van D-dimeer is ongeveer 8 uur.
Analyse AMC
INNOVANCE D-dimeer op Sysmex CS-2500
Centrifugeer de buizen 5 min. op 4193 g (5000 rpm)
Latex partikels gecoat met monoklonale antilichamen tegen het D-Dimeer eiwit vormen samen met het in het monster aanwezige D-Dimeer een antigeen/antilichaam complex.
De agglutinatie zorgt voor een lichtverstrooiing die wordt gemeten als een vermindering in optische dichtheid.
De verandering in optische dichtheid wordt afgelezen op een kalibratie curve en dit is een maat voor de concentratie D-Dimeer in het plasma.
Detectiegrenzen: 0,2 – 35,2 mg/L.
Directe orale anticoagulantia
Meting effect overwegen bij:
extreem overgewicht (BMI >50 kg/m2);
patiënten met een (toegenomen) nierinsufficiëntie (GFR <30 mL/min), ontstaan in het beloop van de behandeling;
vermoeden van overdosering;
trombose tijdens therapie;
twijfel aan therapietrouw;
reden tot couperen van antistollingstherapie, zoals bij een ernstige bloeding of een noodzaak tot een acute interventie/ chirurgische ingreep;
DOACs
Dabigatran
PT: normale waarde sluit gebruik niet uit
aPTT: normale aPTT = lage dabigatran spiegel (<50 mcg/L)
Trombinetijd: normale TT = zeer lage dabigatranspiegel (<30 mcg/L)
Gecalibreerde diluted TT
Rivaroxaban, edoxaban en apixaban
PT en aPTT correleren in enige mate met spiegels, maar normale PT en aPTT sluit therapeutische spiegel niet uit
Alternatief: anti-Xa metingen (zie onder)
Anti-factor Xa activiteit
Principe
Plasma wordt gemengd met een vaste overmaat substraat (CBS 52.44) en factor Xa
Bij LMWH/UFH vinden er tegelijkertijd twee reacties plaats
Aanwezige heparine-antitrombine complexen binden aan factor Xa
Overgebleven factor Xa knipt het substraat in tripeptide + para-Nitro-Aniline (pNA)
Bij rivaroxaban, apixaban of edoxaban vinden er twee reacties plaats
Aanwezig DOAC bindt aan factor Xa
Overgebleven factor Xa knipt het substraat in tripeptide + para-Nitro-Aniline (pNA)
De vrijgekomen hoeveelheid pNA is omgekeerd evenredig met de oorspronkelijke aanwezige hoeveelheid gefractioneerde of ongefractioneerde heparine (in IE/mL) of DOAC (in ng/mL).
Plasmaspiegels DOACs
Bepalingsfrequentie AMC voor rivaroxaban, apixaban, edoxaban: tweewekelijks op donderdag (even weken) uitgevoerdBron