Karel is vastbesloten zijn voorvaderlijk bezit terug te winnen, wat hem uiteindelijk in 1514 lukt, als hij als laatste stad Arnhem herovert. Hierna verplaatst de strijd zich naar andere gewesten. In Friesland, Groningen en de Ommelanden, Drenthe, Overijssel en tot slot het sticht Utrecht, gaat hij de strijd aan met de Habsburgers en hun handlangers. Er staat hem daarbij niet zozeer gebiedsuitbreiding voor ogen, als wel de erkenning van de rechtmatigheid van zijn bestuur in Gelre en Zutphen door zijn grote opponent, de Duitse keizer Karel V.

Na aanvankelijke successen worden de Gelderse troepen - aangevoerd door roemruchte veldheren als Maarten van Rossum en Bernt van Hackfort - overal door de Habsburgers verdreven. In 1528 gaat Utrecht verloren, terwijl in 1536 de stad Groningen en ook Drenthe opgegeven moeten worden. Karel van Egmond weet zijn doel te bereiken wat betreft de erkenning door Karel V van zijn rechten in Gelre en Zutphen. Bij ieder vredestractaat wordt echter gesteld, dat Gelre en Zutphen aan Karel V zullen vervallen, indien Karel van Egmond kinderloos overlijdt. Zijn huwelijk met Elizabeth van Brunswijk Blijfr kinderloos. Men zoekt dan naarstig naar een opvolger. Karel van Egmond wil dat zijn bezittingen aan de koning van Frankrijk, zijn bondgenoot, toevallen. De steden en ridderschappen zien liever Willem van Kleef, Gulik, Berg en Mark als opvolger. Omdat Karel van Egmond zich halsstarrig blijft opstellen, wordt hij in december 1537 afgezet, om een half jaar later als een verbitterd man te sterven. Erg lang heeft zijn opvolger Willem II niet van zijn Gelderse bezit kunnen genieten. In 1543 komt Karel V het opeisen.

Bij het Verdrag van Venlo (7 september 1543) worden Gelre en Zutphen geïntegreerd in de Habsburgse bezittingen. De rechten en privileges van steden en standen worden bij het Tractaat van Venlo (12 september 1543) erkend en gegarandeerd. De praktijk pakt echter anders uit, omdat de Habsburgse vorsten Karel V en Filips II (na 1555) centralisatie en modernisering van het bestuur voorstaan. De instelling van centrale bestuursorganen, zoals het Hof van Gelre en de Gelderse Rekenkamer, leidt weldra tot grote problemen. De stadhouder en het Hof krijgen de regeringsmacht opgedragen, waardoor de invloed van de statenvergaderingen van de vier Kwartieren drastisch wordt ingeperkt. Ondertussen is ook in Gelderland de Reformatie, eerst de Lutheraanse, later de Calvinistische, doorgedrongen. De nieuwe leer slaat in het Gelderse niet zo aan, terwijl Karel van Egmond al geruime tijd een fel bestrijder van de ketterij is geweest. Zijn opvolger Willem II is weliswaar een sympathisant van de Reformatie, maar regeert te kort in Gelre en Zutphen om invloed op de ontwikkelingen te kunnen uitoefenen. De Habsburgse vorsten, kampioenen van het katholieke geloof,scherpen de vervolging aan. De instelling van de inquisitie en de centralisatie-politiek onder Filips II veroorzaken niet alleen in Gelderland, maar in de gehele Nederlanden onrust en leiden in 1572 tot het begin van de opstand. Dit is voor Gelderland, dat al te lijden had van economische achteruitgang, het begin van zware tijden. Koning Filips II zendt al snel troepen om de opstand de kop in te drukken. Zo wordt de rebellerende stad Zutphen in 1572 ingenomen en de bevolking nagenoeg uitgemoord. Gelre en Zutphen worden echter niet volledig onder koninklijk gezag teruggebracht. De in 1578 door de Gelderse Staten benoemde stadhouder Jan van Nassau, broer van Willem van Oranje, speelt hierin een belangrijke rol. Als fervent aanhanger van de protestantse leer bevordert hij de Reformatie in Gelderland. Hij weert katholieken uit bestuursfuncties en benoemt protestanten in hun plaats. Rond 1595 heeft het protestantisme een overheersende plaats verworven in maatschappij en bestuur. Er blijft echter een omvangrijke katholieke minderheid bestaan, in de eerste plaats omdat het nog lang duurt voordat de Spanjaarden definitief uit heel Gelderland verdreven zijn en in de tweede plaats omdat een aanzienlijk deel van de Gelderse adel het katholieke geloof trouw blijft. In 1579 sluiten de zeven noordelijke gewesten zich aaneen in de Unie van Utrecht om het hoofd te bieden aan de dwingelandij van hun landsheer Filips II.