Azul de dimetilmetileno


Azul de dimetilmetileno, mais corretamente azul de 1,9-dimetilmetileno (abreviado na literatura como DMB ou DMMB, de 1,9-dimethylmethylene blue), e seu relacionado método (ou teste) do azul de dimetilmetileno (dimethyl methylene blue method) é o corante usado no o rastreio da mucopolissacaridose, em alternativa ao método pelo azul de alcian, pela determinação de mucopolisacáridos e glicosaminoglicanos.[1][2][3][4]  


DMMB é um corante catiônico que liga-se especificamente a glicosaminoglicanos sulfatados (sGAG, sulfated glycosaminoglycans) com uma absorbância a ~525 nm. Tem sido usado para quantificar glicosaminoglicans tais como sulfato de condroitina, sulfato de queratina e sulfato de heparano e cadeias de sGAG em proteoglicanos. Uma limitação a este método é que o complexo de sGAG-DMMB é instável em solução e pode precipitar. A precipitação do complexo mostra melhora da estabilidade.[5]

Pode ser utilizado para a precipitação específica e quantitativa de glicosaminoglicanos sulfatados bem como proteoglicanos a partir dos extratos de cartilagem articular. O consumo do corante DMMB permite determinar a quantidade de proteoglicanos presentes no extrato, medindo a diminuição da absorção a 595 nm. O complexo precipitado de DMMB e proteoglicanos é utilizado para investigações qualitativas sobre a mobilidade eletroforética dos diferentes proteoglicanos em gel de placa de agarose e sua caracterização imunológica após transferência. Devido à sua maior sensibilidade e maior simplicidade, o método é uma alternativa promissora ao procedimento baseado no azul alcian.[6]


Possui aplicações em Medicina como permitir, por exemplo, a quantificação da concentração de glicosaminoglicanas sulfatadas (GAGs) em cartilagens e líquido sinovial.[7][8]



A substância


PubChem CID: 123898


1,9-dimethylmethylene blue - pubchem.ncbi.nlm.nih.gov


Nome IUPAC:

[7-(dimethylamino)-1,9-dimethylphenothiazin-3-ylidene]-dimethylazanium;chloride


Sinônimos:

3,7-Bis(dimethylamino)-1,9-dimethylphenothiazin-5-ium chloride


Phenothiazin-5-ium, 3,7-bis(dimethylamino)-1,9-dimethyl-, chloride


1,9-dimethyl MB


Taylor's Blue (azul de Taylor)


Número CAS: 23481-50-7

Número EC: 245-683-8


EINECS 245-683-8


CBNumber: CB62463522 - www.chemicalbook.com


InChI=1S/C18H22N3S.ClH/c1-11-7-13(20(3)4)9-15-17(11)19-18-12(2)8-14(21(5)6)10-16(18)22-15;/h7-10H,1-6H3;1H/q+1;/p-1


InChI Key: MKLBAKXCEQNMBC-UHFFFAOYSA-J


SMILES: CC1=CC(=CC2=C1N=C3C(=CC(=[N+](C)C)C=C3S2)C)N(C)C.[Cl-]


Fórmula molecular:

C18H22ClN3S


Massa molar: 347.905 g/mol


Apresenta-se como um sólido em pó, sendo comercializado com um tanto de umidade e certas impurezas inertes às técnicas em que é até 20% em massa, incluindo o cloreto de zinco. Possui ponto de fusão de 250 °C (dec.).[5]

Possui absorção máxima variando, com proporções da solução aquosa na qual seja feita a medição, de:[5]

243-249 nm, H2O ≥10000

285-291 nm, H2O ≥18000

594-600 nm, H2O ≥25000



Representações estruturais


1



2



3



Segurança


É considerada uma substância IRRITANTE.



O método [9]

Princípios


Glicosaminoglicanos (GAGs) são polissacáridos longos não ramificados que consistem em unidades dissacáridas repetidas, constituídas por uma hexosamina (glucosamina ou galactosamina) e um ácido hexurônico (ácido glucurônico ou idurônico). Dependendo da unidade de dissacarídeo, os GAGs podem ser organizados em cinco grupos: sulfato de condroitina, sulfato de dermatano, sulfato de heparano, sulfato de queratano e ácido hialurônico. Os GAGs são moléculas heterogêneas com grande variabilidade na massa molecular e na densidade e no teste padrão da sulfatação. Os ensaios espectrofotométricos para medir o conteúdo de GAG ​​em fluidos biológicos e extratos de tecidos/células são ferramentas valiosas. O corante azul de 1,9-dimetilmetileno é um agente cromotrópico de tiazina que apresenta uma alteração no espectro de absorção devido à indução de metacromasia quando ligado a GAGs sulfatados permitindo a rápida detecção de GAGs em solução (Whitley et al., 1989; Chandrasekhar et al., 1987; Farndale et al., 1982). Além disso, existe uma janela na qual pode ser desenhada uma curva linear (aproximadamente entre 0,5-5 μg de GAG) permitindo a quantificação de GAGs em solução.


Solução reagente de DMMB


1.Dissolver 16 mg de DMMB, 3.04 g de glicina, 1.6 g de cloreto de sódio e 95 ml de ácido acético 0,1 M e complete o volume a 1 L.

2.Filtrar (recomendação de filtro de 0,45 μm, como papel filtro Whattman® 3MM, ou similar).

3.Envase em recipiente protegido da luz.
Nota: O pH desta solução é aproximadamente 3,0.

Alerta: Não use se precipitado estiver presente na solução.

Procedimento


1.Prepare o reagente de DMMB.

2.Prepare uma solução padrão de sulfato de condroitina (500 µg/ml em H2O). Prepare curva padrão como estabelecido na tabela abaixo.

3.Pipete a solução estoque padrão e complete o volume a 20 µl com H2O em uma microplaca de 96 poços.

4.Pipete 20 µl de cada amostra na microplaca.

5.Adicione 200 µl de reagente de DMMB para cada amostra e agite a placa em um vibrador de placa or 5 segundos.

6.Leia a absorbância usando um leitor de placa a 525 nm imediatamente.



Padrão (µg/ml)

Vol (µl) de 500 µg/ml padrão

vol H2O (µl)

vol DMMB (µl)

0

0

20

200

1.25

2.5

17.5

200

2.5

5

15

200

5

10

10

200

7.5

15

5

200

10

20

0

200



Notas


  1. O teste de DMMB pode normalmente ser realizado em amostras com altas concentrações de detergente e sais, entretanto a curva padrão devem ser preparadas na mesma solução.

  2. Evite realizar o teste sobre amostras com alta concentração de albumina ou soro (sérum, plasma sanguíneo sem fibrinogênio) os quais interferem com o teste (Warren, 2000).

  3. Alguns relatos de práticas apresentam a interferência de DNA no teste de DMMB, entretanto, o decaimento do pH a aproximadamente 3 e aumento das concentrações salinas fazem a interferência do DNA negligenciável.

  4. DMMB requer o comprimento de cadeia de glicosaminoglicano ser supeior a tetrasacárido.

  5. DMMB reage com o grupo sulfato da cadeia de GAG e consequentemente são funcionam com GAGs não-sulfatados tais como ácido hialurônico.

  6. Podem ser obtidas informações adicionais através da reação de carbazol (sensibilidade de 1 a 20 μg) para testar os grupos carboxila do ácido urônico para reação de sulfato de heparina, sulfato de condroitina e sulfato de dermatano e/ou antrona para testar o grupo hexose para sulfato de queratina (Mort and Roughley, 2007).

  7. O DMMB pode também ser muito eficiente quando realiza cromatografia para teste rápido para frações contendo GAGs (Burton-Wurster et al., 2003).

  8. O complexo DMMB-GAG que é formado resulta na imediata formação de turbidez, entretanto este complexo começa a precipitar dentro de 10 min, portanto a medição da absorbância deverá ser realizada imediatamente.



Referências  


1.Aranzadi, E; Miramar, M. D; Cesar, M. A; Escanero, J. F.; Evaluación del test del azul de dimetilmetileno (DMB) en el screening de las mucopolisacaridosis y su comparación con la prueba del cetilpiridinio (CPC) / Dimethylmethylene (DMB) test in the screening of mucopolysaccharidosis compared with cetylpiridinium choloride (CPC) technique; Rev. diagn. biol; 55(1): 17-21, ene.-mar. 2006. - pesquisa.bvsalud.org


2.E. Aranzadi, M.D. Miramar, E. Leiva, E. Relaño, J.F. Escanero; Modificación de la técnica de determinación de mucopolisacáridos que utiliza azul de dimetilmetileno; Rev Diagn Biol vol.51 no.1  ene./mar. 2002; versión impresa ISSN 0034-7973. - Scielo


3.Jussara Kiya Huaranga Fernandes; Caracterização dos glicosaminoglicanos da prostata ventral, glandula de coagulação e vesicula seminal de ratos : efeitos da castração; Universidade Estadual de Campinas. Instituto de Biologia; Dissertação (mestrado) - www.bibliotecadigital.unicamp.br


4.Stone JE, Akhtar N, Botchway S, Pennock CA. Interaction of 1,9-dimethylmethylene blue with glycosaminoglycans. Ann Clin Biochem. 1994 Mar;31 ( Pt 2):147-52. - www.ncbi.nlm.nih.gov


5.1,9-Dimethyl-Methylene Blue zinc chloride double salt - www.sigmaaldrich.com


6.G. Müller & M. Hanschke; Quantitative and Qualitative Analyses of Proteoglycans in Cartilage Extracts by Precipitation with 1,9-Dimethylmethylene Blue; Connective Tissue Research; Volume 33, 1996 - Issue 4 - www.tandfonline.com


7.MATTIELLO-ROSA, SMG et al. Perda de glicosaminoglicanas da cartilagem após ruptura do ligamento cruzado anterior: influência do tempo de ruptura e da lesão condral. Rev. bras. fisioter. [online]. 2008, vol.12, n.1, pp.64-69. ISSN 1413-3555. - Scielo


8.P. Sabiston.; Automation of 1,9-dimethylmethylene blue dye-binding assay for sulfated glycosaminoglycans with application to cartilage microcultures; Analytical Biochemistry; Volume 149, Issue 2, September 1985, Pages 543-548 - www.sciencedirect.com


9.Coulson-Thomas, V. . and Gesteira, T. F. (2014). Dimethylmethylene Blue Assay (DMMB). Bio-protocol 4(18): e1236. DOI: 10.21769/BioProtoc.1236. - www.bio-protocol.org

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Anwari, K., Webb, C. T., Poggio, S., Perry, A. J., Belousoff, M., Celik, N., Ramm, G., Lovering, A., Sockett, R. E., Smit, J., Jacobs-Wagner, C. and Lithgow, T. (2012). The evolution of new lipoprotein subunits of the bacterial outer membrane BAM complex. Mol Microbiol 84(5): 832-844.


Burton-Wurster, N., Liu, W., Matthews, G. L., Lust, G., Roughley, P. J., Glant, T. T. and Cs-Szabo, G. (2003). TGF beta 1 and biglycan, decorin, and fibromodulin metabolism in canine cartilage. Osteoarthritis Cartilage 11(3): 167-176.


Chandrasekhar, S., Esterman, M. A. and Hoffman, H. A. (1987). Microdetermination of proteoglycans and glycosaminoglycans in the presence of guanidine hydrochloride. Anal Biochem 161(1): 103-108.


Farndale, R. W., Sayers, C. A. and Barrett, A. J. (1982). A direct spectrophotometric microassay for sulfated glycosaminoglycans in cartilage cultures. Connect Tissue Res 9(4): 247-248.


Mort, J. S. and Roughley, P. J. (2007). Measurement of glycosaminoglycan release from cartilage explants.Methods Mol Med 135: 201-209.


Warren, S. (2000). A critical analysis of the 1, 9-dimethylmethylene blue assay for sulfated glycosaminoglycans in Synovial fluid. University of Guelph.


Whitley, C., Ridnour, M., Draper, K., Dutton, C. and Neglia, J. (1989). Diagnostic test for mucopolysaccharidosis. I. direct method for quantifying excessive urinary glycosaminoglycan excretion. Clin Chem 35(3): 374-379.


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