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Verde alcian, verde de alcian, em inglês alcian green e em alemão Alciangrüna é um corante da família das ftalocianinas.
Tecido verde alcian corando cartilagem. - Cytogenetyka
Possui fórmula molecular C56H32CuN8 e massa molecular 880,4529.
Quimicamente (UIPAC) 2,10,16,24-tetraphenylphthalocyanine-29,31-diide
( 2,10,16,24-tetrafenilftalocaanina-29,31-diido ).
SMILES: C1=CC=C(C=C1)C2=CC3=C(C=C2)C4=NC5=NC(=NC6=NC(=NC7=C8C=CC(=CC8=C([N-]7)N=C3[N-]4)C9=CC=CC=C9)C1=C6C=C(C=C1)C1=CC=CC=C1)C1=C5C=CC(=C1)C1=CC=CC=C1.[Cu+2]
Possui ainda como sinônimos C.I. Ingrain Green 2 (Color Index verde ingrain 2), alcian greencopper (2+) (verde-cobre alcian ou verde alcian cobre com número de oxidação 2+), alcian green 2GX (verde alcian 2GX).
Observação: existe a variação da molécula 3BX, mas não há significativa diferença em propriedades e aplicações.
Cartilagens de embriões de aves 6
Método análogo ao do azul de alcian para mucinas e mucopolissacarídeos 7
Receita: Como fazer Tintura-Mãe 14
Classificações
Classificações
É classificado com o número CAS 37370-50-6 , PubChem CID 17748682, variedade 3BX CB9448830, variedade 2GX CB7334159.
InChI InChI=1/C56H32N8.Cu/c1-5-13-33(14-6-1)37-21-25-41-45(29-37)53-59-49(41)57-50-43-27-23-39(35-17-9-3-10-18-35)31-47(43)55(61-50)64-56-48-32-40(36-19-11-4-12-20-36)24-28-44(48)52(62-56)58-51-42-26-22-38(34-15-7-2-8-16-34)30-46(42)54(60-51)63-53;/h1-32H;/q-2;+2
Aplicações
Aplicações
É um corante que se presta à diversas aplicações morfologia e histoquímica. [Krutsay 1984]
Uma relação das colorações obtidas inclui:[Cytogenetyka]
Núcleos: azul
Tecido conjuntivo: verde
Queratina: vermelho
Mucopolissacáridos: verde
Entre suas aplicações destacadas em uma rápida revisão, podemos apresentar aplicações:
Em aplicações em embriologia, por ligar-se à cartilagens, mas não a ossos descalcificados, o que permite estudar o desenvolvimento de membros e outras estruturas e diferenças em sua formação, como na pesquisa para a coloração de estruturas ósseas e cartilaginosas de peixes e anfíbios.[Ahmed][Graw][Mishima][Sinsch][UMD][Tickle][Zeller] Encontra aplicação na diferenciação de tecidos ósseos e musculares.[Josefowitz]
O exame de estruturas por meio do verde alcian e o azul de alcian, permite o relacionamento evolutivo entre peixes cartilaginosos e ósseos e outros animais, como o domínio distal de membros.[Edmunds][Freitas][Krausa]
Especificamente em coloração para a exibição de cartilagem hialina. [Lebensmittelhistologie]
Na coloração de mucopolissacarídeos.[Cohrs] Na coloração de mucinas.[Bourne][Putt] Na coloração de colágeno, incluindo exames relacionados com cânceres de determinadas estruturas, como ossos, pálpebras e pulmões.[Boynton][FERON][Fornasier] [Gospodarowicz][Lee] Encontra aplicação no exame de necrose avascular da tala, [Pearce] , aplicações no exame de mixedema e neoplasia mista da tireóide.[JOHNSON] e diagnóstico histopatológico de osteonecrose.[MELONI]
Observação: o verde alcian tem ganho ganho alguma popularidade como substituinte do azul alcian 8GX, para demonstrar mucopolissacarídeos ácidos e o corante amarelo alcian tem sido sugerido, especialmente em um método para demonstrar Helicobacter, ambos sendo usados para mucopolissacarídeos ácidos da mesma forma. Eles não têm nenhuma vantagem particular para demonstrar a mucina em relação ao azul de alcian. De acordo com o Merck Index, os grupos marcados X se separaram durante a coloração.[Culling][StainsFile]
Variações das moléculas e variações da coloração obtida em mucinas:[Shariff]
Verde alcian 2GX - verde brilhante.
Verde alcian 3GX - azul esverdeado
Amarelo de alcian - amarelo
Na coloração de glicosaminoglicanos, os diversos corantes ftalocianinas, como o azul alcian 8GS e o 8GX, o verde alcian 2GX e o 3BX, assim como o azul astra, equivalem-se, apresentando nuances de coloração, e o mecanismo de coloração não é plenamente entendido, mas depende do pH de aplicação, sendo limitado genericamente a pH 2 e limitado pelos grupos sulfônicos se o pH situa-se em 1. As colorações são resistentes à ação de descolorantes ácidos e alcalinos. As soluções aquosas puras são insatisfatórias, sendo recomendado o uso de corante na faixa de 0,1% em soluções ácidas, especialmente de ácido clorídrico, a 0,6 a 0,7% na solução, para aplicações genéricas.[Parwaresch] Recomendações de soluções de até 1% do corante são feitas, mas com pH na faixa de 2,5, para coloração de mucinas e mucopolissacarídeos ácidos.[Nigam]
Com a solução alcoólica de ácido clorídrico de verde alciano, sem qualquer pré-tratamento, tanto os proteoglicanos sulfatados como os carboxilados podem ser demonstrados. Após uma sulfatação indireta (por exemplo, por pré-tratamento periódico com ácido-bissulfito), o glicogênio e as glicoproteínas, e após uma oxidação com permanganato de potássio acidificado, as proteínas contendo alta cistina também podem ser coradas. Como contra-coloração, uma solução de ácido pícrico-vermelho Sírius demonstra ser eficiente.[Krutsay 1986]
No diagnóstico de dermatoses, especialmente ficomicoses subcutâneas.[Stüttgen]
O verde alcian permite técnicas semi-microscópicas (como a estéreo-microscopia) para exame da morfologia da superfície mucosa no reto em biópsias.[AZZOPARDI][Poulsen] Determinados metabolismos nos intestinos também podem ser acompanhados, [Hashizume], assim como certos quadros patológicos, como colite.[KRUININGEN] A mineralização em células condrogênicas, pela característica de ser trópico quanto a tecidos não mineralizados pode ser acompanhada.[Chang]
Técnicas
Técnicas
Desenvolvimentos de membros
Desenvolvimentos de membros
Protocolo sugerido para preparação de espécimes para estudo de desenvolvimentos de membros:[UMD]
1.Remova os membros em estudo da membrana corioalantóica e fixe-os em solução de formalina a 10% em solução PBS por 1 a 2 horas è temperatura ambiente.
2.Lavar 3 vezes com solução PBS, 20 a 30 minutos cada vez, e o tecido poderá ser estocado para posteriores exames em geladeira a 4°C.
3.Mergulhar em solução de corante verde alcian “ácido-etanol” por 4 horas com leve agitação (isto visa manter a concentração de corante próximo dos substratos a serem corados a mais alta possível).
4.Lavar 3 vezes com etanol 70% aquoso.
5.Lavar em uma sequência de etanol a 85%, 95% aquoso e 100% (absoluto).
6.Limpar os membros em exame 1 a 3 vezes com salicilato de metila.
Soluções
Soluções
Solução de corante verde alcian “ácido-etanol” (100 mL)
Verde alcian 0,1%
Etanol absoluto (100%) 70 mL
Ácido clorídrico concentrado 1 mL
Água destilada 29 mL
Solução PBS Estoque ( phosphate-buffered saline, solução salina tamponada de fosfato )
Fosfato diácido de sódio (NaH2PO4) 0,222 g
Fosfato monoácido de sódio (Na2HPO4) 1,190 g
Cloreto de sódio 8,770 g
Cloreto de potássio 0,200 g
a.Dissolver os sais em 90 mL de água destilada ou deionizada.
b.Ajuste o pH a 7,4 gota a gota com solução 1M de ácido clorídrico ou hidróxido de sódio.
c.Ajuste o volume a 100 mL com água destilada ou deionizada.
d.Armazene a 4°C.
Solução PBS para uso
Misture 1 parte de solução PBS estoque, por exemplo, 10 mL, com 9 partes, nesse exemplo 90 mL de água destilada. Ajuste o pH a 7,4 novamente com gotas de solução 1M de ácido clorídrico ou hidróxido de sódio.
Solução fixadora 10 % de formalina em solução PBS
Atenção: Recomenda-se fazer a preparação em capela, devido aos vapores de formaldeído.
Formalina (formaldeído a 35 a 37% em água) 1 parte (por exemplo, 10 mL)
Água destilada 8 partes (nesse exemplo, 80 mL)
Solução PBS para uso 1 partes (nesse exemplo, 10 mL)
Numa variação para membros de aves o passo 1 substituiu a solução de formalina a 10% por solução de TCA a 5% aquoso (ácido tricloroacético aquoso) por uma hora a temperatura ambiente.[swarthmore.edu][Tuan]
Cartilagens de embriões de aves
Cartilagens de embriões de aves
Na coloração de cartilagens de embriões de aves, é também sugerida a seguinte técnica:[Bronner-Fraser][WEDDEN]
1.Fixe o embrião em solução de parafolmaldeído 4% aquoso.
2.Lave duas vezes em água.
3.Core por uma noite mergulhando em solução alcoólica-ácida de verde alcian (ou azul alcian) a 0,075%.
4.Enxague uma vez em solução de álcool ácido por poucos minutos e mergulhe em outra cota de álcool ácido por 1 a 2 horas.
5.Retire e escorra o álcool ácido e mergulhe em etanol absoluto (100%) por duas vezes de 1 hora cada.
6.Clareie o tecido por mergulhá-lo em uma série graduada de soluções de salicilato de metila em álcool (2 partes de etanol para 1 de salicilato; 1 parte de etanol para 2 de salicilato) e finalmente, em salicilato puro.
Soluções
Álcool ácido
Etanol absoluto 75% em volume
Ácido acético 25% em volume
Solução alcoólica-ácida de verde alcian (ou azul alcian) a 0,075%.
75 mg de corante verde alcian dissolvido em 100 mL de álcool ácido conforme fórmula anterior.
As ftalocianinas, tais como o azul alcian, o verde alcian, o amarelo alcian e a azul astra podem substituir a para-rosanilina na técnica de para-rosanilina-diparaldeído, que é um corante geral que faz possível detectar a presença de todos os ânions independente de sua natureza. De acordo com a técnica de Gomori, este corante é obtido pela reação de solução a 0,5% de cloridrato de para-rosanilina em etanol 70% aquoso com 1 mL de ácido clorídrico concentrado por 2 a 3 dias. A cor do sistema muda para violeta pelo resultado da formação de um novo corante. Ele mantém-se estável somente por 8 dias. O método de Gabe de preparação é normalmente preferido. Ele ua uma solução aquosa de cloridrato de para-rosanilina, ao invés de uma etanólica, e acrescenta-lhe cloreto de potássio. Dado que o novo corante produzido é insolúvel em água. deve ser precipitado e isolado, preferencialmente por decantação cuidadosa, lavado com água e estocado seco (por exemplo, após estufa à baixa temperatura, 40-45 °C com exaustão permanente da umidade). A solução deste corante mantém-se bem conservada se produzida a 0,125% de para-rosanilina-diparaldeído em 70% de etanol acrescido de 1 mL de ácido acético glacial. Aplica-se por mergulho dos espécimes na solução por 5 minutos, enxagua-se com água rapidamente, trata-se por 10 a 20 segundos com etanol a 96% contendo 0,5 % de ácido clorídrico concentrado (um álcool ácido específico). Lava-se com água novamente, desidrata-se e monta-se sob resina (meio de montagem sintético). Estes corantes produzem uma intensa cor violeta. A para-rosanilina-diparaldeído e as variantes ftalocianinas podem ser substituída por tionina-paraldeído.[Locquin]
Método análogo ao do azul de alcian para mucinas e mucopolissacarídeos
Método análogo ao do azul de alcian para mucinas e mucopolissacarídeos
Aplicação para mucinas e mucopolissacarídeos, as quais, com o azul de alcian, são coloridas de azul.
Solução corante de azul de alcian 8GS ou verde alcian 3BX ou 2GS a 0,1% em ácido acético aquoso a 3%. Recomenda-se o uso de água destilada. A concentração de corante nessa solução, a depender da aplicação, pode ser aumentada até 1%. Em determinadas situações, pode se recorrer à soluções aquosas de corante, em concentrações de até 1%, sem a acidificação com ácido acético, mas é recomendado o acréscimo de timol (2-isopropil-5-metil-fenol) como conservante, que deve ser preparado previamente em solução aquosa saturada timol-água (aproximadamente 0.9 g/L a 20 °C) onde se dissolverá o corante. Esta solução permite a conservação da solução de corante por algumas semanas após a preparação mas exige a filtração antes do uso.[Bisen]
Protocolo
Protocolo
1.Fixar as seções preparadas em criostato por 5 minutos em fixador picrato-formalina.
2.Passar as seções por graduações de álcool para água (por recomendação, etanol 100%, 70%, 50% e água pura).
3.Mergulhar em solução de corante em ácido acético por 20 minutos.
4.Mergulhar na solução aquosa do corante por 2 minutos.
5.Lavar em água corrente.
6.Desidratar.
7.Montar com meio de montagem adequado á técnica a ser usada.
Nota da literatura: Tomando as seções da lavagem de água e colocando-as em solução alcoólica (etanol 80%) de borato de sódio (bórax) a 0,5%, e mantendo o banho por 2 horas, o corante,no caso do azul alcian, é convertido, pelo etanol alcalinizado, a azul monastral, extremamente insolúvel.[Bisen]
Para polissacarídeos, e´usada também a chamada “coloração de Attwood” consiste de um procedimento de coloração com verde alcian (ou azul de alcian 8GX), a pH 2,5, seguido pelo procedimento de floxina-tartrazina de de Lendrum.[Hewlett] A técnica de Attwood é recomendada também para uso em seções de ossos descalcificados.[Putris]
Método WHO
Método WHO
Método recomendado pela Organização Mundial de Saúde, adequado à queratina e substâncias tais como a mucina em embolismo de fluido amniótico.[Saukko]
Protocolo
Protocolo
1.Colocar as seções em água.
2.Colorir com a sequência corante de Mayer e azul celestina. Enxaguar.
3.Propiciar a diferenciação or imersão em álcool ácido (ácido a 0,5%). É citado que há tendência à cor azul da preparação.
4.Colorir com solução de eritrosina aquosa a 1%.
5.Propiciar nova diferenciação em álcool etílico a 95%.
6.Colorir com solução de verde alcian para WHO por 5 minutos.
7.Enxaguar, quando a preparação deve tender a leve coloração rosa.
8.Tratar novamente com álcool etílico a 95%.
9.Colorir com tintura alcoólica de açafrão por 5 minutos.
10.Secar e montar com meio de montagem adequado.
A solução de verde alcian para WHO é preparada misturando 50 mL de solução aquosa a 1% de verde alcian com 50 mL de solução aquosa de ácido acético a 1% e então adicionando 20 mg de timol, homogeneizando e filtrando.
A tintura alcoólica de açafrão é produzida por maceração e extração de pistilos e flores de açafrão (normalmente a forma encontrada no comércio) em álcool etílico 85% até o completo esgotamento da matéria-prima e a saturação do álcool, que se dá normalmente com coloração amarelo profunda.
Tecidos vegetais
Tecidos vegetais
Para tecidos vegetais, é recomendada a ação simultânea de safranina e azul alcian (ou verde). As principais vantagens deste método são a sua simplicidade e a ausência de processos de diferenciação. Seções recém-obtidas, congeladas e em parafina podem ser coradas com esta técnica. As seções são colocadas em hipoclorito de sódio a 10% durante 1-5 minutos, lavadas em ácido acético a 5% e coradas durante 10 min. As seções são então lavadas em água destilada durante 1 min, lavadas em água destilada durante 5 min e montadas.[Tolivia][VAN WYK]
Referências
Referências
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