Imprimarea DoD s-a dovedit a fi un proces de micro-fabricare promițător pentru aplicații micro și bio-RP, care deține rezoluție înaltă și controlabilitatea deosebit de bună a orientării fibrelor. Este relativ ușor și rentabil de configurat. Tehnica arată fezabilitatea fabricării de microstructuri 3D complicate cu fibre ultrafine, arătând aplicațiile sale potențiale în fabricarea de dispozitive optice, senzori, livrare de medicamente, schelete de țesut etc.

Fabricarea de schelete folosind fibre orientate cu E-jetted

Setare experimentală

O configurație experimentală a sistemului E-jetting este demonstrată în Fig. 4. Presiunea pozitivă variind de la 0 la 6 bari este asigurată de sistemul pneumatic cu 5 canale controlat de PC, menținând suplimentul suficient de soluție. Fiind material biocompatibil aprobat de Food and Drug Administration, policaprolactona (PCL) este folosită ca demonstrație pentru imprimarea cu fibre. Amplificatorul de înaltă tensiune, care este componenta critică a întregului sistem, este aplicat între o duză și substrat, pentru a genera tensiunea DC înaltă (- 3,25 kV ~ + 3,25 kV) pentru încărcarea soluției. Capul de imprimare realizat în-casă este adaptabil la diferite duze, cu un diametru interior variază de la 80 la 510 μm. Substratul de siliciu este plasat sub duză cu un interstițiu foarte mic (mai puțin de 2 mm). Pentru a orienta fibrele în timpul E-jetting, se aplică un etaj XYZ precis. Este controlat de software și controler prin semnale TTL pentru a se deplasa pe calea predefinită.

Schelete ejectate pentru regenerarea țesuturilor

Cu o bună controlabilitate a orientării fibrelor, tehnica E-jetting este aplicată pentru a crea schelete tridimensionale (3D). Pentru procesul convențional de E-spinning, fibrele rezultate sunt depuse aleatoriu fără capacitatea de a defini dimensiunea porilor. Spre deosebire de asta, este avantajul semnificativ al tehnicii E-jetting de a construi structuri 3D cu dimensiunea porilor controlată. Este necesar ca scheletele să aibă pori cuprinși între 100 și 500 μm pentru creșterea țesuturilor și îmbunătățirea fixării protezei. Însă, porii mai mici, mai mici de 300, prezintă de obicei porozitate scăzută, limitând creșterea celulară și penetrarea nutrienților. În acest studiu, scheletele cu diferite dimensiuni ale porilor date de 500, 400 și 300 μm sunt fabricate (Fig. 5), constând din fibre uniforme depuse strat cu strat.

După cum se ilustrează din imaginea mărită a scheletelui cu dimensiunea porilor de 500 μm, diametrul fibrelor este mai mic de 20 μm, în timp ce distanța dintre fibrele adiacente este de 500 μm, ceea ce înseamnă că raportul de zveltețe este de 25:1. Este o provocare pentru astfel de fibre fine să se susțină fără a se îndoi în structura de lungă durată. În timp ce pentru scheletul cu pori diminuați de 400 μm se realizează și fibre uniforme cu diametrul de 20 μm. Cu o reducere suplimentară a dimensiunii porilor până la 300 μm, se ilustrează din imaginile mărite că fibrele E-jetted sunt uniforme, oferind o bună interconectivitate a structurilor 3D. Cu fibre ultrafine orientate, scheletele dețin dimensiunea dorită a porilor și conectivitatea, manifestând superioritate pentru aplicațiile de inginerie tisulară.

Imprimarea DoD a acoperirii bioactive multistrat

În funcție de proprietățile fluidelor ale materialelor de distribuire și de cerințele pentru aplicații specifice, diferite micro-dozatoare sunt selectate de diferiți cercetători. Walter şi colab. (2005) au folosit atât distribuitoare de lichide bazate pe piezo, cât și pe bază de supapă cu solenoid pentru a imprima teste biologice în miniatură. Pentru a construi un țesut 3D, Chang și colab. (2008b) au folosit patru tipuri de duze, adică duză acționată de solenoid, duză capilară din sticlă piezoelectrică, duză pneumatică pentru seringă și duză de pulverizare pentru a depune hidrogeluri specificate cu diferite vâscozități.

Setare experimentală

Într-un sistem DoD de micro-distribuire propus (Sun et al. 2012), pentru fabricarea bio-acoperirii este utilizată o micro-valvă de acționare cu solenoid, care funcționează pe baza comenzilor de control trimise de la un PC. Sistemul de distribuire cu microvalve acționat de solenoid constă dintr-o microvalvă și driverul acesteia și un controler pneumatic.

Figura 6a prezintă o diagramă schematică a micro-valvei cu solenoid. Această microvalvă funcționează printr-un sistem cu piston magnetic pentru a deschide sau închide supapa. Durata de deschidere este garantată de prima tensiune de vârf de 24 V pentru a activa supapa și apoi de 3 V pentru a menține starea deschisă (prezentată în Fig. 6b). Perioada de timp totală, incluzând starea de vârf și de menținere, este definită ca fiind timp on operațional (OOT = operational on time), care este parametrul cheie pentru controlul volumului de distribuire a picăturilor. Figura 6c prezintă micro-dozatorul asamblat cu un rezervor, o sită de filtru, o țeavă de teflon, micro-valvă și o duză.

Figura 7 ilustrează sistemul de distribuire propus atât din vedere frontală, cât și din vedere laterală izometrică, incluzând un etaj de precizie XYZ de la Aerotech (http://www.aerotech.com/), un controler de etaj, două unități de distribuire și driverele acestora, un controler pneumatic, și un controler de întărire. Cele două unități de dozare sunt atașate pe etajul axei-Z cu o structură de montare. Placa de substrat este montată pe etajul X care se deplasează pe etajul Y. Când etajul ajunge la poziția dată, controlerul de etaj va emite semnale de declanșare TTL pentru a activa driverul corespunzător al unității de distribuire, iar apoi micro-dozatorul va finaliza ejectarea picăturilor. Controlerul de întărire este pentru a regla temperatura de încălzire, accelerând astfel solidificarea picăturilor depuse pe substrat, cu limite de 60^oC. Controlerul pneumatic oferă ieșiri pozitive independente pentru diferite dozatoare. Când supapa este deschisă, această presiune împinge lichidul de-a lungul camerei către duză. Cu o presiune adecvată și OOT, lichidul poate forma o picătură la vârful duzei.

Morfologia suprafeței

După procesul de fabricație, morfologia suprafeței de acoperire și aria secțiunii transversale sunt observate folosind microscopul electronic cu scanare (SEM = scanning electron microscope). Tensiunea de accelerare și curentul fasciculului sunt setate la 15 kV și, respectiv, 12 μA. Analiza elementară este obținută prin spectroscopie cu raze X cu dispersie de energie (EDS = energy-dispersive X-ray spectroscopy) cuplată cu detectorul EDS încorporat al SEM. Rezultatele demonstrează distribuția elementară a unei anumite zone în procent de greutate. Figura 8a și b arată observarea morfologiei suprafeței acoperirii cu hidroxiapatită (HA) pură și, respectiv, structurii de acoperire cu 4 straturi HA/colagen (Col). Această structură este formată în mare parte din materiale care au afinitate chimică pentru țesutul natural al corpului, cum ar fi hidroxiapatita (HA) și colagenul. Se așteaptă că această acoperire compozită va induce o tranziție continuă de la țesut la suprafața implantului, promovând astfel regenerarea osoasă. După cum se observă în Fig. 8, există o diferență semnificativă în ceea ce privește morfologia suprafeței între cele două tipuri de acoperire. În Fig. 8a, suprafața acoperirii cu HA pur arată relativ „aspră”. Pentru acoperirea HA/Col, colagenul este absorbit fizic de stratul de HA, care umezește și netezește suprafața de acoperire cea mai de sus, ca în Fig. 8b. Această caracteristică poate tinde să îmbunătățească osteointegrarea cu osul în comparație cu o suprafață mai netedă (Nakashima și colab. 1997). Structura HA/Col cu ​​4 straturi a fost fabricată pe baza conceptului de structură de acoperire multistrat. După cum se arată în Fig. 9, structura prezintă o acoperire uniformă de către materialele de distribuire pe suprafața de titan, iar prin analiza distribuției elementare prin EDS, C și Ca/P apar în pozițiile dorite conform structurilor de acoperire stratificate proiectate.

Imprimare celulară DoD

Până în prezent, diferite tipuri de celule au fost imprimate cu succes, iar viabilitatea lor a fost verificată (Chen et al. 2006, 2008c; Xu et al. 2004, 2005, 2006; Barron et al. 2005; Nakamura et al. 2005; Saunders; et al. 2008; Takahashi şi Tomikawa 2003). Unul dintre studiile cuprinzătoare a fost realizat de Saunders et al. (2008), care a folosit o imprimantă de birou comercială pentru a distribui celule fibroblaste umane, pentru investigarea relației dintre supraviețuirea celulelor și parametrii de imprimare cu jet de cerneală. Studiul lor a susținut afirmațiile anterioare (Xu și colab. 2004, 2005, 2006; Nakamura și colab. 2005) că supraviețuirea celulelor nu a fost afectată semnificativ de procesul de imprimare, deoarece ratele de supraviețuire a celulelor au scăzut doar de la 98% la 94% în cazul lor, când impulsul de excitație a fost crescut de la 40 la 80 V. Însă, în studiul lor, procesul de imprimare a fost realizat folosind o imprimantă comercială modificată, limitându-și astfel experimentele la un diametru fix al duzei (60 μm) și o gamă mică de viteze de picătură (mai mică de 1,0 m/s). Aceste limitări pot fi importante, deoarece tensiunile de forfecare, care sunt de așteptat să fie principalul factor în distrugerea celulelor în timpul procesului de imprimare, sunt proporționale cu gradienții de viteză din duză.

Setare experimentală

Un sistem experimental DoD de imprimare celule dezvoltat (Li 2010) va fi folosit ca exemplu pentru a ilustra fezabilitatea acestuia. Experimentele de imprimare au fost efectuate utilizând sistemul de imprimare cu jet de cerneală piezoelectric în mod de presare auto-dezvoltat. Configurația este compusă dintr-un compresor, un regulator de presiune, un rezervor, un cap de imprimare acționat piezo, un driver piezo, o lampă Arrisun-5 și o cameră Photron FASTCAM SA1 (cameră video de mare viteză), așa cum se arată în Fig. 10. Prezentul model al capului de imprimare este o mare îmbunătățire față de capetele de imprimare convenționale, deoarece permite utilizarea duzelor interschimbabile, pentru același traductor piezoelectric. Modelul cu duze interschimbabile permite curățarea sau schimbarea cu ușurință a duzei înfundate sau deteriorate.

Procesul cu jet de cerneală este foarte periodic. Fig. 11a prezintă procesul de formare a picăturilor în secvență de timp. Viteza picăturii poate fi calculată împărțind distanța dintre două picături la diferența lor de timp. Fig. 11b prezintă imagini cu câteva celule din interiorul duzei. Lichidul utilizat a fost soluţie apoasă 1,0 % (g/v) de alginat de sodiu. Viteza picăturii este de 0,74 m/s.

Pentru studiul ratelor de supraviețuire a celulelor, suspensiile de celule fibroblaste de șobolan L929 au fost imprimate prin orificii de trei diametre diferite (119, 81 și 36 μm) pe plăci de cavitate (Costars) care conțineau soluția de test viu-mort. Prepararea soluției de test viu-mort va fi introdusă mai târziu. Impulsurile electrice care s-au utilizat să acționeze traductorul piezoelectric au fost în intervalul 52-140 V. Fiecare probă a fost imprimată timp de aproximativ 20 s cu o frecvență de acționare de 1,5 kHz pentru capul de imprimare. Înainte de procesul de imprimare, o suspensie de celule de 15 μl a fost depusă într-o placă de cavități în același mediu cu sistemul de imprimare, pentru a acționa ca un control.

Teste de supraviețuire

Un kit de viabilitate/citotoxicitate LIVE/DEAD (L3224, Molecular Probes, Invitrogen) a fost utilizat pentru a evalua supraviețuirea celulelor după imprimare. Fiolele congelate care conţin testul au fost dezgheţate şi centrifugate pentru scurt timp înainte de utilizare. 20 μl din soluția furnizată de 2 mM EthD-1 și 5 μl din soluția furnizată de calceină 4 mM s-au adăugat în 10 ml de soluție de 1 DMEM și s-au amestecat bine, ceea ce a dat o soluţie de lucru de aproximativ 4 μM EthD-1 și 2 μM de calceină AM. Celulele au fost distribuite direct în plăci cu cavități care au conținut fiecare 100 μl de amestec de analiză, apoi au fost incubate timp de 30 de minute. Pentru fiecare condiție de imprimare, celulele au fost distribuite în cinci plăci Petri separate, pentru a studia variația ratelor de supraviețuire. Controalele au fost luate direct din cerneala celulară înainte de imprimare și puse pe un set de vase Petri separate, parcurgând același mediu și procedură. Probele colorate au fost apoi parțial transferate pe lamele de microscop și observate la microscop cu fluorescență. Au fost capturate șase imagini din fiecare vas Petri pentru numărarea celulelor. Celulele care au rămas în viață după imprimare au fost colorate în verde, iar celulele deteriorate au fost colorate în roșu. Numărul de celule vii și moarte pentru fiecare probă a fost calculat în raport cu cel al controlului care a fost prelevat înainte de imprimare.

Figura 12 prezintă efectele amplitudinii impulsului de excitație asupra ratei medii de supraviețuire a celulei, pentru duza de 36 μm cu amplitudine a impulsului de excitație de la 60 la 130 V, la o frecvență de 1,5 kHz și cu timpi de creștere și coborâre de 3 μs. Se arată că rata de supraviețuire scade de la 95% la 78% pe măsură ce impulsul de excitație crește de la 60 la 130 V, iar cea mai mică rată de supraviețuire de 76% este observată atunci când se apropie de cea mai mare tensiune. Amplitudinea impulsului de excitație reprezintă puterea dispozitivului piezoelectric de a distribui picăturile, iar această putere afectează direct viteza picăturilor și, prin urmare, efortul de forfecare în lichid. În Fig. 13, ratele medii de supraviețuire a celulelor față de amplitudinea impulsului de excitație pentru toate cele trei orificii diferite sunt trasate împreună pentru a compara efectele diferitelor dimensiuni ale orificiilor asupra supraviețuirii celulei. Eșantioanele au fost imprimate prin orificii cu diametrul de 36, 81 și 119 μm, cu amplitudine a impulsului de excitație de la 52 la 140 V, la frecvența de 1,5 kHz, cu timpi de creștere și coborâre de 3 μs. Comparând cele trei linii de tendință diferite din Fig. 13, concluzionăm că nu puterea câmpului electric afectează direct rata de supraviețuire a celulei; mai degrabă este solicitarea de forfecare al fluidului.