Verschillende manieren van bepalen tumorload
Variant Allel Frequency (VAF): wordt meestal gebruikt wanneer genomisch DNA (gDNA) wordt getest zoals in de NGS. Wanneer er alleen maar tumorcellen aanwezig zijn is de maximale VAF waarde in principe 50%: elke cel heeft 2 allelen. Bij de somatische varianten is in de regel 1 van de 2 allelen afwijkend.
Als we 100 cellen analyseren, zijn er dus 200 allelen waarvan 100 gemuteerd > 100/200*100%=50%.
Ratio’s
Meest gebruikt = RNA/cDNA (copyDNA), maar ook voor gDNA.
Bij gDNA wordt dan gekeken naar de verhouding tussen mutant en wildtype. Als we bovenstaand voorbeeld gebruiken van de VAF wordt de berekening dan mut/wt*100% 100/100*100%=100%. Voor zover ik van het AUMC lab heb begrepen gebruikt men deze waarde voor de NPM1 in het beenmerg aan het einde van de therapie en als FU na de transplantatie. Ander voorbeeld is de FLT3-ITD en FLT3-TKD ratio’s die gebruikt werden in de guidelines.
Alternatief = fusietranscript van interesse/huishoudgen.
Omdat je naar de expressie kijkt is niet 1 op 1 de link met het aantal cellen te leggen. Sommige genen komen hoog tot expressie, andere lager. Goed voorbeeld van gebruik van deze ratio is de BCR::ABL1. Volgens de internationale standaard komen BCR::ABL1 en ABL1 op dezelfde wijze tot expressie en is er ook weinig spreiding tussen patienten. De rapportage is #BCR::ABL fusietranscripten/#ABL1 transcripten *100%. Bij Sanquin gebruiken we echter GUS als huishoudgen ipv ABL1, maar we hebben vastgesteld hoe GUS en ABL zich ten opzichte van elkaar verhouden. Uitslagen zijn dus echt te vergelijken met bijvoorbeeld de Ceheid methgode die op het AUMC wordt gebruikt. Gezien de incidentie van CML is het mogelijk geweest om een internationale standaard vast te stellen. Voor veel andere fusietranscripten is de verhouding in expressie lastiger vast te stellen. Bij de NPM1 assay op cDNA (dus na 2 inductiekuren) wordt deze methode ook gebruikt.
NB. De conclusie 2% = 10-4 is in de werkgroep gecommuniceerd vanuit Rotterdam. Als ik naar de vergelijkingsdata van onszelf kijk tijdens de validatie waarbij we NPM1 positieve diagnoses hebben verdund komt de 2% overeen met een 10-3 verdunning dus een 3 logreductie.
Logreductie is echter een onafhankelijk rapportage en wordt vastgesteld ten opzichte van een (fictieve) diagnose. De diagnose wordt op 100% of factor 1 gesteld en een follow-up wordt ten opzichte van materiaal berekend. Het makkelijkst is dit te vergelijken met de flowcytometrische MRD: het percentage afwijkende blasten is je MRD waarde. 0.1% blasten is een 10-3 of 3 logreductie, 0.01% blasten een 10-4 of 4 logreductie.
We hebben zelf bij de validatie van de NPM1 3 methodes vergeleken en bleek de logreductie onafhankelijk te zijn van de gebruikte methode.
Tenslotte de gevoeligheid van de bepaling. De feno als voorbeeld. Als ik een 10-4 of 4 logreductie wil aantonen wil ik 1 afwijkende cel aantonen in 10.000 andere cellen. Heb ik maar 1000 cellen dan kan ik nooit aan de voorwaarden van de 10-4 voldoen. De gevoeligheid is dan 10-3. Dit gaat ook op voor de moleculaire bepalingen. We hebben vastgesteld dat we meestal 1 kopie mutant kunnen aantonen, ongeacht de techniek. Op basis van aantal wildtype allelen of huishoudgen kan vastgesteld worden hoeveel celequivalenten getest zijn en welke gevoeligheid aangehouden moet worden voor het specifieke sample. Om deze reden varieert de gevoeligheid die we vanuit Sanquin rapporteren per monster/afname.
Achtergrond
NPM1 gedreven consolidatie: als MRD negatief na cyclus 2, krijgt alsnog 25% vd patienten een recidief (mgl te verklaren doordat een deel van deze ptn toch positief is maar onder de detectiegrens)
Methode van NPM1 bepalen;
Na C2: uitslag wordt gerapporteerd als #NPM1mut transcripten tov het #ABL transcripten *100% met als cut-off waarde 2%. Bij diagnose kan deze waarde ruim boven de 100% uitkomen. De logreductie zal worden blijven vermeld, met name om deze uitslag te laten blijven verhouden tot de logreducties bij de andere MRD’s. MRD negatief na C2 betekent dan dus: NPM1 <10-4, wat gelijk staat als <2%.
Na consolidatie ihkv follow-up: NPM1 wordt bepaald met een genomisch DNA (waarom is dat verschillend?). NB. Follow-up NPM1 na consolidatie: elke 3mnd op BM of elke 4-6wk op PB