En aquella época, las oportunidades para que las mujeres trabajaran en el ámbito académico eran extremadamente limitadas. Aún así en 1748 se hizo cargo de los cursos de su padre en la prestigiosa Universidad de Bolonia, demostrando así su capacidad para enseñar y su dominio de las matemáticas. Posteriormente, en 1750, el Papa Benedicto XIV la nombró profesora honoraria de Matemáticas y Filosofía Natural en la misma universidad. Tras la muerte de su padre en 1752, decidió abandonar la vida académica y dedicarse a obras de caridad y a la vida religiosa como monja de la congregación durante sus 47 años restantes.

Su tiempo como profesora en Bolonia fue relativamente corto, lo que limitó su interacción con los estudiantes, y por ello no tuvo alumnado directo relevante en la historia de las matemáticas.

Su principal contribución fue la creación de " Instituzioni analítiche". Este libro, publicado en 1748, se convirtió en una referencia fundamental para el estudio del cálculo durante varias décadas. Esta edición la tuvo que costear, la imprenta acabó estando en su propia mansión y ella estaba a cargo y dirigía los trabajos. Sabemos que Vincenzo Ricatti leyó la versión final de las Instituzioni por sugerencia de su padre y además contribuyó con su propio material. El primer tomo trataba del conocimiento contemporáneo en álgebra y geometría analítica, magnitudes finitas, y el segundo tomo del análisis infinitesimal, los conocimientos en cálculo diferencial e integral que se habían desarrollado hasta entonces, los cuales Agnesi logró reunir y organizar de manera coherente, siendo el primer libro en tratar estos temas. Algunos temas del libro son fundamentos y aplicaciones del cálculo, curvas y superficies y ecuaciones diferenciales. Incluía muchos ejemplos y problemas cuidadosamente seleccionados para ilustrar las ideas, métodos originales y generalizaciones lo que hacía que resaltara por ser claro y conciso. Más tarde, la edición francesa corrigió la falta de funciones trigonométricas.