TP transgénèse  ( YFP)

Principe général de la transgénèse des levures

La transgénèse est une technique qui permet l’insertion d’un ou plusieurs gènes dans un organisme, cettetechnique est utilisée dans de nombreux domaines de la biotechnologie comme l’agriculture (résistance contre le gel, sècheresse, parasites...), la protection de l’environnement, ou encore en médecine (thérapie génique). Au cours de ce TP, nous allons réaliser une transformation de levures. Celle - ci consiste en l’introduction d’un nouveau fragment de matériel génétique (ADN) au sein des levures (ici le gène codant pour la GFP). Si cetADN est correctement exprimé, alors l’organisme sera pourvu d’un nouveau caractère identifiable (ici la capacité à émettre une lueur verte fluorescente, visible sous lampe UV). En se divisant, les levures formerontune colonie dont toutes les levures seront transformées. L’organisme hôte utilisé ici est une levure Saccharomyces cerevisiae BY4709 qui présente une mutation dans la chaine de synthèse de l’uracile, donc elle est incapable de se développer sur un milieu sans uracile (URA-).

La transgénèse sera réalisée en utilisant un vecteur appelé plasmide (ADN circulaire de petite taille) qui est présent de façon naturelle dans certaines levures et les bactéries. Ce plasmide a été préparé artificiellement en laboratoire et porte le gène de la GFP issue de la méduse, ainsi qu’un gène codantpour l’uracile. Ainsi, le plasmide apporte 2 caractères nouveaux, la levure devient apte à synthétiser l’uracile et exprime la protéine GFP. L’introduction du plasmide s’effectue sur des levures fraîches. Le taux de transformation étant relativement faible, il est nécessaire de distinguer les levures ayant été transformées des autres; pour cela, on «crible» spécifiquement les cellules transformées à l’aide d’une culture sur un milieu sélectif URA- (milieu ne contenant pas d’uracile).