TP OGM

Matériel biologique et principe de l’expérience.

Il s’agit de transformer des bactéries de la souche Escherichia Coli par le plasmide pUC18 en utilisant la méthode du choc thermique.

Une bactérie transformée est une bactérie génétiquement modifiée (OGM) dans laquelle a été inséré un fragment d’ADN étranger.

Un plasmide est un ADN circulaire bactérien qui existe à l’état naturel et que les bactéries sont capables de se transmettre. Les plasmides contiennent plusieurs gènes parmi lesquels figurent fréquemment des gènes de résistance. Ils se répliquent de façon autonome et sont transmis à la descendance cellulaire au cours des mitoses.

Grâce aux enzymes de restriction il est très facile d’insérer des séquences d’ADN choisies dans les plasmides. Voir schéma p 128. En incorporant le plasmide la bactérie deviendra capable d’exprimer dans son phénotype l’ensemble des gènes du plasmide dont celui ajouté .(Technique utilisée pour la production pharmaceutique d’insuline humaine ou d’hormones de croissance.

Le plasmide pUC18 utilisé ici contient naturellement le gène de résistance à un antibiotique, l’ampicilline.

Matériel à disposition :

- 1 microtube marqué pUC+, contenant 200 microlitres de chlorure de Ca 50 mM et 10 microlitres de pUC18

-1 microtube marqué pUC-, contenant 200 microlitres de chlorure de Ca 50 mM et 10 microlitres d’eau distillée

-1 microtube marqué LB contenant 500 microlitres de milieu LB

- 2 boites de pétri marquée « Amp - »contenant un milieu sans ampicilline et 4/5 billes de verre stériles

- 2 boites de pétri c marquées « Amp + »contenant un milieu avec ampicilline et 4/5 billes de verre stériles

- Des boites de pétri contenant des colonies d’Echérichia Coli

- Deux ensemenceurs stériles

- Des liquipettes dont 1 goutte = 25 microlitres

Protocole à réaliser.

Ce TP doit être réalisé dans les conditions les plus stériles possibles.

- Commencer par s’équiper de blouse, gants, lunettes, et masque et attacher les cheveux. Se laver scrupuleuseemnt les mains.

-Nettoyer la paillasse à l’eau de javel

-Allumer la lampe à alcool.

- Prélever à l’aide de l’ensemenceur 3 ou 4 colonies de bactéries et les insérer dans le tube pUC +

- Prélever à l’aide d’un autre ensemenceur 3 ou 4 colonies de bactéries et les insérer dans le tube pUC –

- Agiter chacun des tubes par retournement pendant 2 à 3 minutes.

- Disposer les 2 tubes dans la glace pendant 10 min minimum

- Puis placer les 2 tubes dans le bain marie à 42°C pendant exactement 90 secondes.exactement

- Remettre 10 minutes dans la glace

- A l’aide d’une liquipette ajouter 200 microlitres environ de LB dans chacun des tubes. Sans toucher la solution déjà présente dans les tubes

- Ensemencer les boites de pétri à l’aide de 2 liquipettes en disposant :

- 100 microlitres du tube pUC+ dans une boite à ampicilline

- 100 microlitres du tube pUC+ dans une boite sans ampicilline

- 100 microlitres du tube pUC- dans une boite à ampicilline

- 100 microlitres du tube pUC- dans une boite sans ampicilline

- Faire rouler les billes sur la gélose pour étaler la suspension bactérienne puis éliminer les billes , en retourant le boite , puis laisser les boites retournées.

- Emballer sous papier cellophane les boites et les laisser incuber pendant 24 h couvercle en bas à 37°C

Interprétation

- Prévoyez les résultats que l’on devrait obtenir

- Justifiez et interprétez ces résultats.

- A l’aide du doc expliquer les différents procédés permettant le transfert de gène dans des cellules eucaryotes.