Изучение региональной специфичности астроцитов с помощью
оптогенетических методов
Планируемое содержание работы
Введение
Глава 1. Литературный обзор:
1.1. Морфология и функции астроцитов
1.2. Астроциты и нейросигналинг
1.3. Применение оптогенетики для исследований нервной ткани
Глава 2. Материал и методы исследования
2.1. Технология приготовления органотипических срезов коры, ствола и гиппокампа головного мозга крысы
2.2. Технология приготовления острых срезов коры ствола и гиппокампа головного мозга крысы
2.3. Методические вопросы оптогенетики
2.4. Протокол исследования
2.5. Методы статистической обработки данных
Глава 3. Результаты
Глава 4. Обсуждение результатов
Выводы
ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
(за год до защиты),
Актуальность. Проблема
Астроциты играют важную роль в функционировании головного мозга, однако ясности в их морфологии и функционировании на сегодняшний день не существует. Это связано, в первую очередь с методическими сложностями в визуализации астроцитов, в чистом разделении нейроглии на астро- и микроглию.
Оптогенетика уже хорошо зарекомендовала себя в качестве метода изучения особенностей работы нейронных сетей.
В основе оптогенетики лежит сочетание методов оптики, генетики и биоинженерии. В результате внедрения в клетку генетических конструкций она начинает синтезировать особые фоточувствительные белки из семейства опсинов. Воздействие на такие клетки световым излучением с определенной длиной волны позволяет исследователям во-первых, визуализировать клетки, во-вторых, контролировать активность этих клеток (Deisseroth et al., 2006; Мамонтов, 2014; Черч, Юсте, 2014).
Мы предполагаем, что использование этого методического подхода позволит выявить морфологическую и функциональную специфичность астроглии в разных отделах мозга модельных животных (кора, ствол, гиппокамп).
Степень разработанности проблемы. Необходимо обратить внимание
Несмотря на относительную молодость метода оптогенетики (первые публикации 2005 год), на сегодняшний день он широко используется в исследованиях функциональных особенностей нейронов и нейроглии различных отделов мозга лабораторных животных.
Первоначально создается генная конструкция, которая содержит промотор и ген, кодирующий необходимый опсин. Данная конструкция путем трансфекции вводится в интересующую исследователей группу клеток, например в определенную зону мозга. Как правило, для трансфекции используются ленти-вирусы или адено-ассоциированные вирусы (Yao et al., 2012). Особенности используемой генетической конструкции обеспечивают избирательность экспрессии опсина только в определенной популяции клеток.
Клетки, получившие вирус, начинают синтезировать опсин, который встраивается в наружную мембрану нейрона или астроцита (в зависимости от задачи), где выполняет функции ионного канала. После этого на голове животного устанавливается оптоволоконная система доставки пучка света к исследуемой области.
При освещении светом определенной длины волны белковые каналы изменяют свою структуру, и, в зависимости от того, какой белок экспрессируется, клетки проявляют ту или иную реакцию. На современном этапе этих белков существует довольно много, и каждый из них вызывает специфический ответ.
Использование оптогенетических методов позволило существенно расширить представления о функциях глиальных клеток, которые длительное время рассматривались только как пассивные элементы нервной ткани, обеспечивающие питание и механическую поддержку нейронов. Последние исследования на основе оптогенетических подходов убедительно доказали, что глиальные клетки играют важную роль в процессах активации нейронов, то есть в процессах восприятия, переработки и передачи информации нейронами (Figueiredo et al., 2011).
Астроциты являются наиболее многочисленными глиальными клетками в мозге, которые образуют тесные контакты с кровеносными сосудами и нейронами. Отдельные астроциты могут образовывать многочисленные синапсы, таким образом, обладая потенциальными возможностями регулировать активность нейронов и синаптическую передачу.
Астроциты не способны генерировать потенциал действия и вступать во взаимодействия путем распространяющегося электрического сигнала. Вместо этого они отвечают на стимуляцию резким увеличением (или волной) уровня внутриклеточных ионов кальция. Это явление получило название кальциевая «возбудимость» и было описано in vivo и in vitro с использованием стандартных химических индикаторов ионов кальция (Figueiredo et al., 2011).
Однако использование классических подходов и маркеров внутриклеточного кальция позволяют оценить только общий выброс кальция в популяции астроцитов, тогда как оптогенетические подходы позволяют визуализировать выброс кальция не только в отдельных астроцитах, но и в их отдельных субклеточных доменах, например, ассоциированных с плазматической мембраной.
На сегодняшний день с помощью оптогенетики показан эффект основного «нейрогормона» из ангиотензинового семейства – ангиотензина на кальциевую осцилляцию астроцитов в культуре. Более того было показано, что ангиотензин активирует астроциты, не оказывая эффекта на нейроны. В серии других экспериментов, проводимых в условиях in vivo, также была показана специфическая хемочувствительность к ангиотензину особой популяции астроцитов, локализованной на вентральной поверхности продолговатого мозга (medulla oblongata) (Figueiredo et al., 2011). Полученные данные в дальнейшем, возможно, позволят глубже понять центральные механизмы развития гипертонической болезни, так как ангиотензин является одним из основных сососудосуживающих веществ.
Также с помощью оптогенетики изучена роль астроцитов (in vitro), локализованных в области ретротрапезоидного ядра, в процессах передачи сигналов нейронам. Это ядро локализовано в нижней части ствола мозга и участвует в процессах центральной хемочувствительности, важной для регуляции дыхательной активности. Исследователи предположили, что хемочувствительные астроциты в этой области могут быть способны возбуждать нейроны путем выделения АТФ. Было обнаружено, что локальная оптогенетическая активация астроцитов приводила к последующей деполяризации нейронов. При этом присутствие блокатора рецепторов АТФ препятствовало развитию этой деполяризации, что доказывало центральную роль АТФ в этих процессах.
In vivo оптогенетику использовали, чтобы проверить может ли стимуляция астроцитов служить триггером для запуска хеморецепторной реакции. Эксперименты проводили на анестезированных, ваготомированных крысах, находящихся на искусственной вентиляции. За 7-10 дней до эксперимента крысам вводили вектор. После этого односторонняя оптическая стимуляция (с длиной волны 445 нм) вызывала резкое усиление респираторной активности. Использование блокатора рецепторов АТФ обратимо ингибировало этот дыхательный эффект, подтверждая вовлеченность в эти механизмы АТФ (Figueiredo et al., 2011).
Реализованные и планируемые варианты решений проблемы.
Таким образом, проблема заключается в том, что структурно-функциональное картирование астроцитов на сегодняшний день не произведено. Классические методы визуализации имеют ограничения. Исследования выполняются в основном в культурах астроцитов, что, как известно не всегда отражает поведение клеток in vivo.
Мы предполагаем, что с помощью оптогенетики удастся установить структурную и функциональную специфичность астроцитов в различных отделах мозга. Причем исследование будет проводиться на острых и органотипических срезах, что приближает нас к понимаю того, как клетка работает в естественных условиях.
Цель и задачи исследования.
Цель: провести структурно-функциональное картирование астроглии мозга крысы.
Задачи (не работы, а на ближайшие полгода):
1. Освоить методики приготовления срезов и оптогенетических исследований.
2. Установить региональную специфичность астроцитов коры, гиппокампа и ствола мозга крысы.
Научная новизна
Будут выявлены функции астроцитов в различных отделах мозга.
Основные положения, которые планирую доказать в работе и выносить на защиту.
Астроглия имеет региональную структурно-функциональную специфичность. Какую именно будет установлено экспериментально.
Апробация работы.
Англоязычные журналы по нейронаукам.
Литература (пока только то, что прочитано)
1. Мамонтов Д. Засветить прямо в мозг [Электронный ресурс]. Дата размещения 05.2014. – URL: http://www.popmech.ru/science/15794-zasvetit-pryamo-v-mozg/#full.
2. Попов В. Светлая голова [Электронный ресурс]. Дата размещения 10.11.2014. – URL: http://biomolecula.ru/content/1494.
3. Черч Дж, Юсте Р. Новая эра в изучении мозга // В мире науки. – 2014. -№5. – С. 6—12.
4. Deisseroth K., Feng G., Majewska A.K., Miesenbock G., Ting A., Schnitzer M.J. Next-generation optical technologies for illuminating genetically targeted brain circuits. J. Neurosci. 2006. Vol. 26. P. 10380–10386.
5. Fenno L., Yizhar O., Deisseroth K. The development and application of optogenetics. Annu. Rev. Neurosci. 2011. Vol. 34. P. 389-412.
6. Nagel G., Ollig D., Fuhrmann M., Kateriya S., Musti A.M., Bamberg E., Hegemann P. Channelrhodopsin-1: a light-gated proton channel in green algae. Science. 2002. Vol. 296. P. 2395–2398.
7. Oesterhelt D., Stoeckenius W. Rhodopsin-like protein from the purple membrane of Halobacterium halobium. Nat. New. Biol. 1971. Vol. 233. P. 149–152.
8. Optogeneticswiki [Электронный ресурс]. – URL: http://www.openoptogenetics.org/index.php?title=Channelrhodopsins. Дата обращения 26.12.2014.
9. Rein M.L., Deussing J.M. The optogenetic (r)evolution. Mol. Genet. Genomics. 2012. Vol. 287. P. 95-109.
10. Yao J.P., Hou W.S., Yin Z.Q. Optogenetics: a novel optical manipulation tool for medical investigation. Int. J. Ophthalmol. 2012. Vol. 4. P. 517-522.
11. Wang D., Bordey A. The Astrocyte Odyssey. Prog Neurobiol. 2008 December ; 86(4): 342–367
12. Teschemachera A.G., Patonb J.F.R., Kasparov S. Imaging living central neurones using viral gene transfer. Advanced Drug Delivery Reviews 57 (2005) 79–93
13. Yusuke Ota, Alexander T. Zanetti, and Robert M. Hallock. The Role of Astrocytes in the Regulation of Synaptic Plasticity and Memory Formation. Neural Plasticity Volume 2013, Article ID 185463
14. Nancy Ann Oberheim, Steven A. Goldman, and Maiken Nedergaard. Heterogeneity of Astrocytic Form and Function. Methods Mol Biol. 2012 ; 814: 23–45. doi:10.1007/978-1-61779-452-0_3