gRNA design
CRISPR/Cas9 guide RNA の設計 20170515 aoki
1. KOしたい遺伝子の名前、種名を調べておく
ヒトなら Homo sapiens
マウスなら Mus musculus
ラットなら Rattus norvegicus
犬なら Canis lupus familiaris
2. NCBIのgeneで検索
eg. MMP14 Canis Familiaris だと以下のようなものが出る。いくつか候補がある場合は適当なものを選ぶ
3. ちょっと下がってGenomic regions, transcripts, and productsを見る
4. KOするときは、大体 1st exon を狙うので、1st exonのあたりを拡大する。
* KOするところは別に1st exonでなくても良いと思いますが、私たちは今のところ1st exonを狙っていることが多いです。
** Splicing variantsがいっぱいある場合は共通の exon を狙います。
5. テキストツールで配列を選んで、benchling に保存。大体100 bpくらいあれば十分 gRNA の候補を取ってくることができる。
6. CRISPR/Cas9のgRNAを選ぶ。
* Genomeのところは off target score を検索するときに必要なので、対象とする生き物のゲノムを選ぶこと。
7. 左のチェックボタンを押して(2セット選ぶ)、Assembleを押す
8. Vectorを選んで、Next
例えば、lentiCRISPRv2 や pX459v2 など。
9. 名前は、
lentiCRISPR-dMMP14-1,
lentiCRISPR-dMMP14-2
とかにすると分かりやすい。
保存先のFolderを選ぶ。
新しく名前を付けたプラスミドができる(lentiCRISPR-dMMP14-1とか)。
ここに、自動でプラスミドとFWD、REVのプライマーを設計してくれている(制限酵素のoverhangも考慮して)ので、そのOligo DNAを発注する。
10. qPCRチェック用プライマーの設計
mRNAの配列をNCBI, Geneでとってくる。
Benchilingに登録する。cDNAを取ってくること。
右端のPrimers > Create Primers > Wizard
TaskをqPCR (intercalating Dyes)
Primer
Tm 55 - 60 - 65
Size 20 - 20 - 20
Amplicon
min 200, opt 300, max 500
上のGenerate Primersを押す
Primer resultsが出る。
適当そうなものを選んで右側にEditボタンがある
プライマーをコピペしてPrimer Blastをかける
https://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/index.cgi?LINK_LOC=BlastHome
Organismsを犬ならCanis lupus familiaris (taxid:9615)
待つ
目的のもの以外にもいくつか候補がでるが、相補性が低そうならOK
BenchlingにもどってEditからプライマーに名前を付けてフォルダに保存。
dMMP14-qPCR-F, dMMP14-qPCR-Rとか