Oligo DNAのannealingとLigationのプロトコル。
shRNAやgRNAの配列のサブクローニングなどに使えます。
準備 10 x Oligo アニーリングバッファー
100 mM Tris-HCl, pH 8.0
10 mM EDTA, pH 8.0
1 M NaCl
オリゴDNA Forward （乾燥品を注文する）
オリゴDNA Reverse （乾燥品を注文する）
ヒートブロックを95度に温めておく
1 オリゴDNA Forward, Reverse を 200 uM になるようにDDWで溶かす。 よくVortexする。
2 以下の様にエッペンチューブに混ぜる
チューブA
200 uM Oligo F 5ul
200 uM Oligo R 5ul
10x Oligo annealing B 2 ul
DDW 8 ul
Total 20 ul
3 混ぜたエッペンチューブを95度に温めたヒートブロックに入れて4分温める
4 ヒートブロックから外して、スピンダウンする
5 室温で冷えるまで待つ（10分くらい） この液は保存可能
6 このAnnealingしたOligo DNAを 1 x Oligo annealing buffer で 500 倍希釈する。
この液は保存不可能
7 500倍希釈したOligo DNA普通にライゲーションに用いる。Oligoのリン酸化は必要ない（Vectorがself ligationしない場合）。
Insert (annealed oligo DNA) 1.5 uL
Vector 0.5 uL
2x Ligation High ver2 2.0 uL
Total 4.0 uL
16度、30分。
全量、Transformする。
コロニーをピックアップして、制限酵素チェック、シークエンス。
かなりの割合でちゃんとLigationされている。