AAV精製

Triton X114法

Triton X114は20-30度で曇点（Cloud point）になり相分離（aqueous phaseとdetergent phase）を起こす。

遠心により簡単にdetergentを除くことができる。

20150117 少し改変。

1. O-MEM+1% Triton X114(x100) を作る。冷やしておくこと。DNase処理をするならここに2 mM MgCl2 (x500) と200U DNase I (20 uL/1mL)を加える。
2. トランスフェクションから2-3日後、冷やしたPBSで細胞を2回wash.
3. O-MEM + 1% Triton X114を加えて、細胞を溶かす。
4. 細胞溶解液をファルコンチューブに移して、Vortex
5. 37度、1時間（DNaseを入れる場合は、処理も兼ねる）
6. エッペンチューブに移して、遠心 30度、13,000 rpm, 5 min
7. 上清を回収。ストックは-80度で保存。

AAVはFreeze and thawに強い。

大体、30-100 uL/35 mm dishでほぼ100%感染する。

Freeze and thaw法(これが一般的。取れるときと取れないときがある)

1. トランスフェクションから2-3日後、0.5 MのEDTAを 200 uL (最終濃度10 mM) になるように培地に添加し、3-5分室温でインキュベート
2. ピペッティングで細胞をはがし、全ての培地と細胞をファルコンチューブに移す
3. 遠心 1000 rpm, 3 min
4. 上清を除き、新しい培地 1 mL で懸濁し、エッペンチューブに移す
5. Freeze and thawを4回繰り返す。-80度に15分くらいで凍る。
6. 最後に、遠心して上清を回収する。ストックは-80度で保存。

AAVはFreeze and thawに強い。

大体、30-100 uL/35 mm dishでほぼ100%感染する。