Cinétique michaélienne

Lors d'une étude enzymologique ou étude cinétique d'une enzyme michaélienne (dont les paramètres cinétiques (Vm et Km) répondent à l'équation de Michaelis-Menten), il est possible de retrouver les paramètres cinétiques de cette enzyme par linéarisation en double-inverse ou linéarisation de Lineweaver-Burk.

L'exemple ci-dessous d'étude enzymologique réalisée avec le logiciel R project parlera mieux.

Détermination des paramètres cinétiques d'une enzyme michaélienne avec le logiciel R project

Etude cinétique réalisée avec le logiciel R project

Ces 2 graphiques correspondent à l'ensemble d'une étude cinétique permettant de retrouver la vitesse maximale (Vm) d'une enzyme ainsi que sa constante de Michaelis (Km) qui correspondant à la concentration en substrat permettant d'avoir la moitié de Vm.

Télécharger le script complet ici.

Entrer dans R les valeurs récupérer lors de l'étude - ici les absorbances des produits formés pour différentes concentrations initiales en substrat

# Valeurs Absorbances

a5=c(0,.015,.031,.047,.062,.079,.092,.104,.114,.128)

a10=c(0,.032,.049,.071,.093,.115,.137,.157,.175,.198)

a15=c(0,.033,.065,.095,.131,.157,.185,.209,.234,.256)

a30=c(0,.034,.071,.107,.140,.176,.205,.24,.267,.295)

a50= c(0,.036,.079,.12,.158,.198,.232,.268,.3,.333)

# Valeurs Temps

tps = c(0,15,30,45,60,75,90,105,120,135)

2. Calculer les vitesses initiales

# Calcule des vitesses initiales sur les zones de corrélation maximale

vitesse_i = function(temps,vector,intervalle=2, duree="all") { # cette fonction recherche l'intervalle présentant la plus grande variation

if (duree=="all") {duree = length(vector)} # si intervalle = 3 recherche de l'intervalle sur 3 valeurs entre n-1 et n+1

cori = 0 # si durée = 5 : recherche de l'intervalle le plus grand sur les 5 premoiers points

for (i in rev(c(1:(duree - intervalle)))) { # l'intervalle conservée n'est en réalité pas le plus grand mais celui retenu sur la zone de corrélation maximale.

l1 = vector[i:(i+intervalle)]

l2 = temps[i:(i+intervalle)]

cor_temp = cor(l1,l2)

if (cor_temp>cori) {cori = cor_temp;vi = (vector[i+intervalle]-vector[i])/(temps[i+intervalle]-temps[i])}

return(vi)

vi =c(vitesse_i(tps,a50,duree=5),vitesse_i(tps,a30,duree=5),vitesse_i(tps,a15,duree=5),vitesse_i(tps,a10,duree=5),vitesse_i(tps,a5,duree=5))

3. Tracer le premier graphique exprimant la formation du produit en fonction du temps et pour différentes concentrations initiales en substrat

ylab= expression(A[500]) # permet de mettre la longueur d'onde en indice

plot(tps,a50,pch=16,col="orange",type="o",xlab="Temps (en s)",ylab=ylab,main="TITRE 1 à ADAPTER\nFormation du produit en fonction du temps\npour différentes concentrations en substrat") # courbe 1

# ATTENTION : xlab, ylab et main dépendent des conditions expérimentales.

points(tps,a10,col="red",pch=16,type="o") # points : ajoute une courbe

points(tps,a15, col="green",pch=16,type="o")

points(tps,a30,col="blue",pch=16,type="o")

points(tps,a5,col="black",pch=16,type="o")

# Legend

legend(x="topleft",legend=c("5 mM","10 mM","15 mM","30 mM","50 mM"),lty=1,pch=16,col=c("black","red","green","blue","orange"))

4. Tracer le deuxième graphique ou linéarisation en double inverse présentant l'inverses des vitesses initiales en fonction de l'inverse des concentrations en substrat

s = c(50,30,15,10,5)

inv_v = 1/vi

inv_s = 1/s

x_y0 = -(lm(inv_v~inv_s)$coefficients[1])/(lm(inv_v~inv_s)$coefficients[2])

xlab = expression(1/S~~(L.mmol^-1)) # la fonction expression et ^permet de mettre en exposant

ylab = expression(1/V~~(s.*Delta*A^-1))

main = "TITRE 2 à ADAPTER\nReprésentation en double inverse de\nLineweaver et Burk" #\n retour à la ligne

plot(inv_s,inv_v,pch=16,type="p",col="red",ylim=c(0,max(inv_v)),xlim=c(x_y0,max(inv_s)),xlab = xlab,,ylab=ylab,main=main)

cat("Attention : xlab, ylab et main dépendent des conditions expérimentales - à modifier.\n")

abline(h=0,v=0) # Tracer des traits verticaux et horizontaux à x = 0 et y = 0

abline(lm(inv_v~inv_s)$coefficients,col="red",lty=3)  # régression linéaire

5. Annoter ce dernier graphique pour indiquer les valeurs de -1/Km et 1/Vm qui permettent de retrouver les paramètres cinétiques

# Ajouter des flèches de légende

# Km

arrows(x0 = x_y0,y0 =(max(inv_v)/100*20) ,x1 = x_y0,y1 = (max(inv_v)/100*2))

text_km = signif(x_y0,2)

cat("L'opposé de l'inverse de Km vaut ",x_y0,".\n")

text_km = bquote(bold(frac(-1,Km)==~.(text_km)~(L.mmol^-1)))

text(x_y0, (max(inv_v)/100*20), text_km,adj=c(0,0),font=2,cex=0.7)

# Vm

arrows(x0 = (x_y0/100*22),y0 =((lm(inv_v~inv_s)$coefficients[1])+(max(inv_v)/100*20)) ,x1 = (x_y0/100*2),y1 = (lm(inv_v~inv_s)$coefficients[1]))

cat("L'inverse de Vm vaut ",(lm(inv_v~inv_s)$coefficients[1]),".\n")

text_vm = round((lm(inv_v~inv_s)$coefficients[1]),0)

delta = bquote(Delta)

text_vm = bquote(bold(frac(1,Vm)==~.(text_vm)~(s.*.(delta)*A^-1))) # si on veut des s/Delta(A)

#text_vm = bquote(bold(frac(1,Vm)==~.(text_vm)~(mL.min.µmol^-1))) # avec les unités comme sur l'image (min.mL/µmol)

text((x_y0/100*22),((lm(inv_v~inv_s)$coefficients[1])+(max(inv_v)/100*20)), text_vm,adj=c(0.5,0),font=2,cex=0.7)