平成21年度

【平成21年度】

4-2-11 生殖･細胞医療研究部（生殖細胞機能研究室、生殖技術研究室）

[原著論文：査読付（Reviewed Paper）]

0. 著者（，著者，著者，・・・）：∪題名．∪雑誌名∪西暦発行年；巻：起頁‐終頁

（※注 ∪は1スペースを意味します）

1. Nagata S，Toyoda M，Yamaguchi S，Hirano K，Makino H，Nishino K，Miyagawa Y，Okita H，Kiyokawa N，Nakagawa M，Yamanaka S，Akutsu H，Umezawa A，Tada T： Efficient reprogramming of human and mouse primary extra-embryonic cells to pluripotent stem cells． Genes Cells 2009；14：1395-1404

2. Ichida JK，Blanchard J，Lam K，Son EY，Chung JE，Egli D，Loh KM，Carter AC，Di Giorgio FP，Koszka K，Huangfu D，Akutsu H，Liu DR，Rubin LL，Eggan K： A small-molecule inhibitor of tgf-Beta signaling replaces sox2 in reprogramming by inducing nanog． Cell Stem Cell 2009；5：491-503

3. Yamatoya K，Yoshida K，Ito C，Maekawa M，Yanagida M，Takamori K，Ogawa H，Araki Y，Miyado K，Toyama Y，Toshimori K： Equatorin: Identification and Characterization of the Epitope of the MN9 Antibody in the Mouse． Biol Reprod 2009；81：889-897

4. Takahashi H，Toyoda M，Birumachi J，Horie A，Uyama T，Miyado K，Matsumoto K，Saito H，Umezawa A： Shortening of human cell life span by induction of p16ink4a through the platelet-derived growth factor receptor beta． J Cell Physiol 2009；221：335-342

5. Makino H，Toyoda M，Matsumoto K，Saito H，Nishino K，Fukawatase Y，Machida M，Akutsu H，Uyama T，Miyagawa Y，Okita H，Kiyokawa N，Fujino T，Ishikawa Y，Nakamura T，Umezawa A： Mesenchymal to embryonic incomplete transition of human cells by chimeric OCT4/3 (POU5F1) with physiological co-activator EWS． Exp Cell Res 2009；315：2727-2740

6. Ito C，Akutsu H，Yao R，Kyono K，Suzuki-Toyota F，Toyama Y，Maekawa M，Noda T，Toshimori K： Oocyte activation ability correlates with head flatness and presence of perinuclear theca substance in human and mouse sperm． Hum Reprod 2009；24：2588-2595

7. Akutsu H，Miura T，Machida M，Birumachi JI，Hamada A，Yamada M，Sullivan S，Miyado K，Umezawa A： Maintenance of pluripotency and self-renewal ability of mouse embryonic stem cells in the absence of tetraspanin CD9． Differentiation 2009；78：137-142

8. Yazawa T，Inanoka Y，Mizutani T，Kuribayashi M，Umezawa A，Miyamoto K： Liver receptor homolog-1 regulates the transcription of steroidogenic enzymes and induces the differentiation of mesenchymal stem cells into steroidogenic cells． Endocrinology 2009；150：3885-3893

9. Katsube K，Ichikawa S，Katsuki Y，Kihara T，Terai M，Lau LF，Tamamura Y，Takeda S，Umezawa A，Sakamoto K，Yamaguchi A： CCN3 and bone marrow cells. J Cell Commun Signal． 2009；3：135-145

10. Segawa Y，Muneta T，Makino H，Nimura A，Mochizuki T，Ju YJ，Ezura Y，Umezawa A，Sekiya I： Mesenchymal stem cells derived from synovium, meniscus, anterior cruciate ligament, and articular chondrocytes share similar gene expression profiles． J Orthop Res 2009；27：435-441

11. Chen AE，Egli D，Niakan K，Deng J，Akutsu H，Yamaki M，Cowan C，Fitz-Gerald C，Zhang K，Melton DA，Eggan K： Optimal timing of inner cell mass isolation increases the efficiency of human embryonic stem cell derivation and allows generation of sibling cell lines． Cell Stem Cell 2009；4：103-106

12. Miyagawa Y，Okita H，Itagaki M，Toyoda M，Katagiri YU，Fujimoto J，Hata J，Umezawa A，Kiyokawa N： EWS/ETS regulates the expression of the Dickkopf family in Ewing family tumor cells． PLoS One 2009；4:e4634

[総説] （欧文、和文の順に）

0. 著者（，著者，著者，・・・）：∪題名．∪雑誌名∪西暦発行年；巻：起頁‐終頁

1. 梅澤明弘： 間葉系幹細胞の将来． 分子心血管病 2009；10：48-53

2. 梅澤明弘，大喜多肇： 小児成育疾患に対する幹細胞医療． 病理と臨床 2009；27：333-337

3. 梅澤明弘，大喜多肇： 再生医療と病理． 病理と臨床 2009；27：355-360

4. 梅澤明弘，水谷光音： 細胞医療Up Date． 医学のあゆみ 2009；229：663

5. 梅澤明弘：間葉系幹細胞． 医学のあゆみ 2009；229：681-685

6. 梅澤明弘：月経血に由来する幹細胞． Hormone Frontier 2009；16：221-226

[学会発表] （国際学会、国内学会の順に）

0. 発表者：∪題名．∪学会名，∪開催地名，∪発表西暦年月日（学会開催期間ではない）

1. Toyoda M, Itakura Y, Kuno A, Takahashi Y, Akutsu H, Narimatsu H, Hirabayashi J, Umezawa A. International Society for Stem Cell Research (ISSCR) 7th Annual Meeting, Barcelona, 2009.7.9

2. Miyado K： CD9 action in the egg and on the sperm of mice. Cell-Cell Fusion Gordon Research Conference, New London, 2009.7.19

3. Umezawa A： Defining Human Stem Cell by Glycomics. The 1st ACGG Conference, Tsukuba, 2009.10.30

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［ 活動状況 ］

当研究部では、以下の研究プロジェクトを進めている。

1.) 受精の膜融合を制御する分子メカニズムの解明と不妊治療への応用

2.) 卵の老化と胚発生メカニズムの解明から生殖医療への応用

3.) ES細胞及びiPSの樹立に関わる技術の確立と機能解析

4.) ヒト幹細胞の分化と細胞移植法の開発

5.) 先天代謝異常に対する幹細胞治療法の開発に関する研究

6.) 成育バイオリソース～ヒト臍帯血・子宮内膜・月経血・胎盤・軟骨・骨髄・眼球由来幹細胞～の単離技術の開発、多分化能の解析

7.) 安全で高品質な細胞提供技術の開発と臨床応用

1. 研究目的

当研究部では、受精からヒトとして成長する過程で生じる疾患の成立機序の解明とその予防、診断・治療法の開発研究を行っている。卵、精子、幹細 胞を主な研究対象としており、さらに、生殖腺、胎盤、心臓、神経系、骨、軟骨、脂肪組織を研究対象に加え、幹細胞の機能を調節する分子機構の解明と臨床応 用をめざした一連の研究を展開している。これらの基盤的研究をさらに臨床研究に進展させることにより、生殖医療ならびに再生医療に貢献することが当研究部 の使命であると考える。

1.1 「いのちの萌芽(受精)」のエビデンスに基づいた考え方の提示

受精の膜融合過程は、精子の卵細胞膜への接着、融合、多精拒否からなる一連の現象である。本研究ではその分子メカニズムの解明に挑戦するため、 膜融合過程に関わる因子群を明らかにし、その挙動を可視化することにより、受精における膜融複合体が、時間的・空間的にどのように形成されるのかを解析し てきた。この研究から、不妊治療への道が開かれるとともに、受精以外の膜融合にも新しい概念を提案することができると考えている。

1.2 ヒト胚性幹細胞の樹立

国立成育医療センターでは、ヒトES細胞に関する医学研究が、生命倫理及び医の倫理に基づき、「ヒトES細胞の樹立及び使用に関する指針」（平 成19年5月23日改正文部科学省告示第87号；以下「指針」）を遵守して、医学的、社会的にも適正に行なわれるよう、外部委員も含めたヒトES細胞研究 倫理審査委員会（以下「倫理審査委員会」）を設置している。当研究部が行ってきた幹細胞研究を基盤として「ヒトES細胞の樹立」研究計画を策定し、研究所 内のヒト幹(ESを含む)細胞プロジェクト推進委員会での審議を経て倫理審査委員会による全8回の慎重な審議の結果承認を頂き、最終的に平成19年3月5 日付けで文部科学大臣による確認を頂いた。今後は国の指針を遵守し、我々の研究がヒト生命の萌芽の滅失の上に成り立っていることを常に認識し厳粛にヒト ES細胞研究を行っていく。

1.3 細胞治療・再生医療

ヒト組織幹細胞を生体外で培養することで増殖させることに成功しており，その分離・同定をする。細胞の生体外における培養技術とそれによる細胞数の確保とそれに続く分離技術は、再現性の高い生物実験系に基づいた細胞の基盤解明によってのみ可能となるものである。

1.4 成育バイオリソースの構築

国立成育医療センターでは、病院内の整形外科、産婦人科、眼科、形成外科と研究所の連携により、骨髄、臍帯血、胎盤、子宮内膜を細胞供給源とし て研究を遂行している。臨床研究を前提としたad hoc委員会を設立し、臨床試験研究への具体的なロードマップの作製、医療に提供できる新たなヒト細胞の分離・培養法の開発、ヒト血清ならびにヒト液性因 子のみからなる培養法の開発を行っている。

2. 研究活動の概要

2.1 受精の膜融合を制御する分子メカニズムの解明と不妊治療への応用

受精は2つの生殖細胞、すなわち精子と卵子が“細胞融合”することよって新しいゲノムの組み合わせを持った次世代が誕生する最初の過程であ る。そのため、受精メカニズムの破綻は単なる細胞の機能不全を超えて、生物種の存続にかかわる問題になってしまう。一方、受精の基礎研究には長い歴史があ るにもかかわらず、連続した複雑な過程を経ることからいまだに全容解明には至っていない。特に、精子と卵子の接着から膜融合に至る過程については、今まで 考えられていた概念が完全に否定されてしまったため、卵子の細胞膜に存在すると仮定される精子レセプターも不明のままである。受精のメカニズムを解明する ことは、ひとの「いのち」について考えるきっかけとなる。また、受精は、2つの細胞間で起こるシンプルな細胞融合であるため、他の細胞融合（筋線維の形 成、骨形成、感染症など）の分子メカニズムを解明するためのモデル系にもなりうる。

2.2 卵の老化と胚発生メカニズムの解明→生殖の営みへの理解

生物には寿命がある。哺乳動物は、その寿命内でも次世代へつなぐ生殖期間は限られている。現在わが国は、出生率（合計特殊出生率）が1.3を 下回り、「超少子化国家」と位置づけられている。一方で、不妊症治療特に生殖補助医療（ART）享受による出生児数は総出生児数の1.5%を超え着実に増 加している。一方女性の就業意欲と労働力率は上昇し、この社会・経済の変化は晩婚化などのライフスタイルの変化を来している昨今、加齢による生殖機能の不 可逆的低下に早急に対応する必要が出てきた。その原因の一端に加齢による卵子の質の低下と強く関連していることが示唆されている。女性は限られた生殖期間 があり、つまり“生殖寿命”は卵細胞が加齢することでもある。これらの事象を分子レベルで解明することは、これまで対象が卵子という微量のサンプルのため 基礎研究システムを構築することが大きな問題であったが、我々は実験動物マウスを用いES細胞と連関させて解析する新規的なアプローチをこの分野に持ち込 み有用な知見を得てきている。近年、米国NIHでは、卵子の質と出生児の健康に関する大規模臨床研究と基礎研究プロジェクトが進行している。本領域は、国 際的にも重要課題とされている。

2.3 ES細胞及びiPSの樹立に関わる技術の確立と機能解析

ヒトES細胞は、体を構成するすべての細胞へと分化できる多能性を保持し、増殖し続けることができる極めてユニークな細胞であり、細胞移植の 有用なソースとして再生医療への応用が期待されている。しかしながら、ヒトES細胞の樹立及び培養維持には異種由来の物質を含むため、安全な次世代医療と してのヒトES細胞には異種由来物質を排除した完全ヒト型培養システムの構築が不可欠である。霊長類ES細胞を使用し、基礎研究を進めハーバード大学の協 力のもと着実に進めている。ヒトES細胞樹立研究では、「胚の滅失」が不可欠な行為であるため、常に生命の萌芽について深く認識し慎重に研究を遂行してい く。

胚以外の細胞よりヒトES細胞と類似の性質をもつ人工多分化能性（iPS）細胞が樹立されることが報告され、世界的にも生命科学領域のブレイ クスルーとして大きな注目を集めている。ヒト多能性幹細胞の再生医療や創薬への応用を目指し、ヒトiPS細胞の基盤研究を推進する。

2.4 ヒト幹細胞の分化と再生医療

現在、ヒト幹細胞を用いた心不全に対する細胞治療が臨床で始動しているが、間葉系細胞の心筋分化のメカニズムは不明であり、骨髄細胞を用いる ことがベストな方法であるか疑問の余地がある。我々の研究室では、骨髄細胞に比べ心筋に高率に分化するヒト幹細胞を有し、共培養系を用いることで、生理的 に機能する心筋をin vitroで誘導させる技術を有する。本研究は、細胞治療に用いる細胞源となる組織の選択、細胞の調整という臨床に即した課題と、心筋分化のメカニズムに 迫るものであり、基礎・臨床を包括するまさにトランスレーショナルリサーチといえる。今後も大きな資源が投入されるであろう再生医療分野において、我が国 の知的財産を確立する上でも重要な役割を果たす可能性を有する。

2.5 先天代謝異常に対する幹細胞治療法の開発に関する研究

ムコ多糖症(mucopolysaccharidosis: MPS)は、ムコ多糖を分解するライソゾーム酵素の先天的欠損により、全身にグリコサミノグリカンが蓄積し、ガルゴイ様顔貌、骨変形、肝脾腫、呼吸障害、 心臓弁膜症、角膜混濁、難聴、精神運動発達遅滞などの多彩な症状を呈する遺伝性疾患である。欠損している酵素によりI型からVII型の病型に分類される。 症状は進行性で、早いもので10歳頃までに死亡する予後不良な疾患である。治療法として骨髄移植、酵素補充療法があるが、骨髄移植では重篤な副作用 （GVHDや生着不全に伴う重症感染症）が問題となる。酵素補充療法は効果が一過性であるため頻回投与せざるを得ず、莫大な費用がかかり、定期的な通院を 一生涯続ける必要がある上、角膜や脳や軟骨などのように血流を介する方法では到達できない場所がある。そのため、安全で有効な新規治療法の開発が急務であ る。我々の研究室ではVII型の酵素であるβグルクロニダーゼが欠損しているマウス（MPS-VII型マウス）を有しており、幹細胞移植を用いた治療法の 開発研究を行っている。

2.6 成育バイオリソース～ヒト臍帯血・子宮内膜・月経血・胎盤・軟骨・骨髄・眼球由来幹細胞～の単離技術の開発、多分化能の同定

ヒト由来組織（成育バイオリソース：月経血、臍帯血、末梢血、胎盤、子宮内膜、指、眼球、軟骨等）のヒト間葉系細胞についての維持管理・品質管 理・保存に関する技術革新を行う。我々の樹立した細胞株を日本国内の公的細胞バンク（独立行政法人 医薬基盤研究所）に登録し、他の研究施設より要請が あった場合に高い安全性を有し、標準化された培養システムによって増殖する間葉系細胞を提供できる体制を構築する。また、バンク化された細胞自身が多分化 能を保持しており、細胞の遺伝子発現データベース・分化形質・ゲノム情報を伴った提供システム構築ならびに技術革新は、再生医療、がん、循環器疾病への基 盤資源となり、科学立国を目指す社会への貢献度は極めて高い。再生医療、細胞移植に関し、現在「ヒト幹細胞等を用いる臨床研究に関する指針(平成18年9 月)」に関する議論が厚生労働省科学技術部会ヒト幹細胞を用いた臨床研究のあり方に関する専門委員会およびヒト幹細胞治療臨床研究指針の策定に関するワー キンググループで進められている。細胞移植が具体的な治療法として確立されつつあるが、実験的な治療が日常的な治療法の選択肢となるためには、治療に用い る細胞に関して再現性を保証するための基準がぜひとも必要である。現在、ヒト細胞の明確なバリデーション方法は、国内外で模索されており、一定のコンセン サスは得られていない。細胞自体を生体内マイクロデバイスとして利用する新たな治療戦略を現実するために必要なステップとして、1) 細胞の分離培養技術の確立、2) 細胞のカタログ化、3) 細胞品質管理の標準化がある。世界に向けて有用な細胞のを発信してゆくことは重要であり、本研究成果は日本国内のみならず世界標準（ゴールデン・スタン ダード）となる可能性が高い。

2.7 安全で高品質な細胞提供技術の開発

再生医療、細胞移植に関し、現在「ヒト幹細胞等を用いる臨床研究に関する指針(平成18年9月)」に関する議論が厚生労働省科学技術部会ヒト 幹細胞を用いた臨床研究のあり方に関する専門委員会およびヒト幹細胞治療臨床研究指針の策定に関するワーキンググループで進められている。細胞移植が具体 的な治療法として確立されつつあるが、実験的な治療が日常的な治療法の選択肢となるためには、治療に用いる細胞に関して再現性を保証するための基準がぜひ とも必要である。現在、ヒト細胞の明確なバリデーション方法は、国内外で模索されており、一定のコンセンサスは得られていない。細胞自体を生体内マイクロ デバイスとして利用する新たな治療戦略を現実するために必要なステップとして、1)細胞の分離培養技術の確立、2)細胞のカタログ化、3)細胞品質管理の 標準化がある。世界に向けて有用なヒト幹細胞を発信してゆくことは重要である。国立成育医療センター研究所の施設に有する機関内細胞プロセッシング・セン ターにおいて、日本国内の研究施設より要請があった場合に高い安全性を有し、標準化された培養システムによって増殖する間葉系細胞を提供する。間葉系細胞 を用いた細胞治療に関する倫理性および安全性のdue processを提示することになり、この提示された過程に従い、提供医療施設を増やしていくことになる。現在の間葉系細胞培養に使用されている条件は、 ウシ血清、ウシ胎児血清、ならびに動物細胞、大腸菌等で作製されたヒト増殖因子が利用されており、外来種由来感染源の混入は否定できない。このため治療法 としての安全性、有効性の基準の確立は急務である。

3. 教育活動

梅澤 明弘：慶應義塾大学医学部（非常勤講師）

東京農業大学（客員教授）

熊本大学医学部（非常勤講師）

宮戸 健二：東京農業大学（客員准教授）

東京医科歯科大学（非常勤講師）

阿久津英憲：東京農業大学（客員准教授）

東京医科歯科大学（非常勤講師）

4. 社会貢献・その他

4.1 社会貢献・情報発信

研究成果等の公表のための、Webページを更新した。http://www.nch.go.jp/reproduction/index.html

5.2 広報活動

1) 2009年（平成21年）2月 血液を大切にする会ニュースレターNo.4