EATの実験計画

  1. ヒトEC細胞よりEATを免沈してきて，アルリルアミドの濃度を決める．即ち，ビスとアクリルアミドの比を変化させることによって，バンドが明確に２本でるようにする．例としてアクリルアミド30gとビス0.4g, 0.8g, 2.0gとする．だんだん減らす．

  2. 一番最初にやる実験（アクリルアミドの条件を決めてからではある）は，EATをヒトEC細胞か ら免沈してきて，フォスファターゼ処理をして，泳動する．このときは，いつも４レーンを１セットとする．即ち，第Ｉ，２のレーンには，EC細胞のレチノイ ン酸処理前後，そして第３，４レーンには，心筋虚血の前後でやる．だけど，ラットのEATないしはマウスのEATが，われわれが保持している抗体で免沈さ れるかどうかは佐野君に聞く．ダメなときはヒトEC細胞だけで取りあえず行う．ここでの目的は，細胞の問題は関係なく，ただEATがリン酸化されるかどう かを検討するだけである．まず用いるフォスファターゼは，CIP, Potate Acid phosphatase, Tomato acid (alkali?) phosphataseである（コントロール実験）．後に論文にするためには，PP2A (Serine, Threonine特異的）とLAR (Y045: Tyrosine特異的）で行うことが必須である．CIP, PAP, TAPはinhibitorで阻害されないが，PP2A, LARはinhibitorで阻害される．長くなるが，この後，リン酸化がとれて，バンドが下がったものを活性型JNKで再びバンドの高さを上昇させるこ とが大事である．できれば，EC細胞のレチノイン酸処理前後と心筋虚血前後を４レーンをセットとする．

  3. in vitroの実験として，GST-EATのセリン残基とスレオニン残基をアラニンに変えてから，活性型！JNKとγ-32P-ATPを用いてリン酸化す る．泳動して場所を見ればリン酸化したかどうか分かる．GST-EATとフラッグEATでは，GST-EATの方が安くて（アフィニティカラムが安い）い い．

  4. 活性型JNKを抽出するには，NBEで活性型JNK-GST fusion（細菌で作らせたJNK-GSTをMAPKKで活性型に変えたもの）を購入するのがひとつの手である．別の方法は，Jurkatt細胞に対し てsorbitolかNaClをかけて（浸透圧ショック）JNKを活性型にする．UVも悪くはないが，Jurkatt細胞にはUVをかけにくい．医科歯科 では，EATと(JNKまたはp38)とASK1をco-transfectionするのは活性型のJNKを得るのにASK1を用いた．

  5. ゲル内リン酸化法は，in vivoの中でJNKが主たるEATキナーゼかどうかを検討するのに適切である．だから，EC細胞，心筋虚血モデル，また受精卵の発生過程でこれらの実験 を行うのは大変意義がある．ある細胞ではEATキナーゼはJNKかもしれないし，それが虚血や分化や初期発生の過程で変化するかもしれない．

  6. EC細胞に対するin vivoの実験としては，ただ一次元電気泳動するだけだったら，10 mCiか下手すれば1 mCiくらいで実験ができる．ペプチドマップのためには絶対10 mCi orthophosphateが必要だが，後に言うマススペクトルでできればいいので余りin vivoのペプチドマップは考えない方が「とりあえず」いい．

  7. 一番最後に行う実験をして，ペプチドマップ（in vivo）の代わりにTOF-MSがある．受託でやっているそうで，Sawadyなどで行っているという記憶が松田先生にはある．

  8. 話がずれるが，c-jun mRNAはJNK(MAPK)で安定化するという事実はある．JNKはEATに対しても同様の作用（EATのmRNAを安定化する作用）があるかもしれない．だって，心筋虚血の際には，JNKは核に移行するということが知られている．