Despues de pasearse por los recuerdos de Altaïr Ibn-La'Ahad, Desmond Miles logra salir de las instalaciones de Abstergo y llevado a un lugar seguro donde conoce a dos miembros de la Orden de los Asesinos, Shaun y Rebecca, pero tiene que hacer lo mismo que hacia en Abstergo: Conectarse a un Animus para vivir los recuerdos de un antepasado.

De esta manera, Desmond se mete en la piel de Ezio Auditore, el hijo mediano de una de las familias nobles de la República de Florencia. Es 1476 y la ciudad toscana es el centro neuralgico del Renacimiento bajo el gobierno de Lorenzo de Medici. Pero lo que para Ezio parecia ser una vida de vino, mujeres y rosas acaba bruscamente cuando los miembros varones de su familia son ejecutados con cargos falsos. Con eso, Ezio se ve obligado a convertirse en un Asesino e ir desbaratando los planes de los Templarios, liderados por el cardenal Rodrigo Borgia. Y en esta aventura contara con aliados de la talla de Lorenzo el Magnifico , Nicolas de Maquiavelo o Leonardo Da Vinci.