¿Qué es CRISPR? ¿Cómo funciona?
Sistema inmunológico de las bacterias
Como hemos dicho antes, esta técnica se basa en el sistema inmunitario de las bacterias que les protegen contra los virus, destruyendo su material genético. Se trata de una inmunidad adquirida o adaptativa, que recuerda las secuencias de ADN de los patógenos de ataques anteriores y corta su ADN en caso de nueva infección.
Bien, pues se encontró que una zona determinada del genoma de muchos microorganismos, sobre todo arqueas, estaba llena de repeticiones palindrómicas (que se leen igual al derecho y al revés) sin ninguna función aparente.
Estas repeticiones (CRISPR) estaban separadas entre sí mediante unas secuencias denominadas «espaciadores» que se parecían a otras de virus y plásmidos.
Cuando un virus infecta una bacteria, inserta en su interior su material genético que servirá, aprovechándose de toda la maquinaria de la célula, para replicar copias de este virus que posteriormente serán expulsadas al exterior para poder infectar a muchas más células, destruyendo así a la bacteria.
Algunas veces, cuando esta bacteria sobrevive al ataque del virus, coge un fragmento de ese ADN del virus y se lo guarda en su propio ADN (espaciadores). Estos fragmentos de ADN vírico que se guardan, son los que se encontraban en estas secuencias repetitivas del ADN bacteriano llamadas CRISPR: la maquinaria que utilizaba la bacteria para defenderse del ataque de nuevos virus.
O dicho de otro modo: Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats, o Repeticiones Palindrómicas Cortas Agrupadas y Regularmente Espaciadas.
Así cuando un nuevo virus se atreva a volver a infectar a la bacteria, esta va a ir al ADN vírico que se había guardado en esas secuencias repetitivas y va a hacer una copia en ARN, lo va a armar junto a una proteína endonucleasa que se llama Cas9 que va a ser muy importante en esta historia. Así este ARN va a guiar a la proteína Cas9 por toda la célula buscando una secuencia que sea complementaria a este ARN. Cuando se encuentren con el material genético del nuevo virus, las cadenas de ADN y ARN se van a juntar y la proteína Cas9 se activará cortando el ADN vírico, dejándolo así totalmente inútil y quedando así a salvo de el ataque del virus, de ahí CRISPR-Cas9, que es el nombre completo de esta técnica.
Por eso se le llama comúnmente a esta técnica: tijeras moleculares, por la enzima Cas9.
Después del corte, se confía en los mecanismos naturales de reparación de la célula, los cuales se ponen en marcha de forma espontánea.
Si en ese momento solo las dos partes del genoma se hallan separadas, interviene un mecanismo de reparación celular que las vuelve a conectar, aunque a menudo resulta impreciso y produce los llamados indel (inserción-deleción) , pequeños fragmentos de ADN que se insertan o eliminan en el punto de corte y que pueden inutilizar los genes implicados. Sin embargo, cuando el ADN flota libremente en la célula con los dos cabos sueltos, interviene otro sistema más preciso, denominado reparación por recombinación homóloga (HDR), que los vuelve a conectar y da lugar a cambios específicos en el genoma.
CRISPR en el laboratorio
Se continuó investigando este mecanismo de defensa durante años hasta que en 2012 se dio el paso clave para convertir este descubrimiento, esta observación biológica en una herramienta molecular útil en el laboratorio.
Emmanuelle Charpentier de la Universidad de Umeå y
Jennifer Doudna, de la Universidad de California en Berkeley
Este año un equipo de investigadores dirigido por las doctoras Emmanuelle Charpentier en la Universidad de Umeå y Jennifer Doudna, en la Universidad de California en Berkeley, publicó un artículo en la revista Science que les otorgó el premio Nobel de Química de 2020 el que se demostraba cómo convertir esa maquinaria natural en una herramienta de edición «programable», que servía para cortar cualquier cadena de ADN in vitro. Es decir, lograban programar el sistema para que se dirigiera a una posición específica de un ADN cualquiera (no solo vírico) y lo cortaran.
Otro importante científico que investiga la técnica CRISPR-Cas9 es Feng Zhang, que junto a su equipo, sigue desarrollando este descubrimiento.
Procedimiento
El proceso de editar un genoma con CRISPR/Cas9 incluye dos etapas.
En la primer etapa el ARN guía se asocia con la enzima Cas9. Para empezar habríamos de diseñar una molécula de ARN (CRISPR o ARN guía) que luego va a ser insertada en una célula con los cambios que deseemos hacer. Una vez dentro reconoce el sitio exacto del genoma donde la enzima Cas9 deberá cortar.
Este ARN guía es específico de una secuencia concreta del ADN, de tal manera que por las reglas de complementariedad de nucleótidos se hibridará en esa secuencia (la que nos interesa editar o corregir). Entonces actúa Cas9, que es una enzima endonucleasa (es decir, una proteína que es capaz de romper un enlace en la cadena de los ácidos nucleicos), cortando el ADN. Básicamente podemos decir que el ARN guía actúa de perro lazarillo llevando a Cas9, el ejecutor, al sitio donde ha de realizar su función.
En la segunda etapa se activan al menos dos mecanismos naturales de reparación del ADN cortado. El primero llamado indel (inserción-deleción) hace que, después del sitio de corte (la secuencia específica del ADN donde se unió el ARN guía), bien aparezca un hueco en la cadena, bien se inserte un trocito más de cadena. Esto conlleva a la pérdida de la función original del segmento de ADN cortado.
Un segundo mecanismo permite la incorporación de una secuencia concreta exactamente en el sitio original de corte. Para esto, lógicamente, hemos de darle a la célula la secuencia que queremos que se integre en el ADN.
Problemas
El primer problema viene derivado del hecho de que la especificidad del ARN guía (CRISPR) no es total. Es decir, este ARN, puede hibridar, es decir, juntarse con más de un sitio en el genoma, lo que llevaría a que la enzima Cas9 cortara en un sitio que no nos interese ya que el genoma está compuesto por sucesiones de bases nitrogenadas y la posibilidad de que se repita determinada secuencia es alta, sobre todo si la secuencia no es muy larga
El segundo punto débil de la técnica se debe a que Cas9 pueda cortar sin que esté presente el ARN guía. Esto se soluciona con enzimas más precisas.