Il 5 febbraio 1796 la Società degli Amici dell'arte patriottica (Společnost vlasteneckých přátel umění), organizzazione riuniva rappresentanti della nobiltà e della classe media, fondò una pinacoteca (Obrazárna Společnosti vlasteneckých přátel umění), che divenne la base dell'attuale Galleria Nazionale.
Nel 1902 fu aggiunta la Galleria d'arte moderna del Regno ceco (Moderní galerie Království českého), fondata dall'imperatore Francesco Giuseppe I d'Austria.
Nel 1918, la collezione dell'Società degli Amici dell'arte patriottica (Společnost vlasteneckých přátel umění) divenne proprietà dello stato cecoslovacco, mentre la Galleria d'arte moderna rimase una fondazione indipendente. Nel 1942, anche la Galleria d'arte moderna fu inclusa nella Galleria Nazionale, decisione fu confermata nel 1949.
La Galleria Nazionale espone le sue collezioni nelle seguenti sedi:
Convento di Sant'Agnese - Collezioni di arte medievale ceca e dell'Europa centrale
Monastero di San Giorgio - Collezioni d'arte dei tempi dell'imperatore Rodolfo II e arte barocca
Palazzo Kinský - Mostra di paesaggi cechi dal XVII al XIX secolo
Palazzo Sternberg - Arte europea dall'antichità al barocco
Palazzo Schwarzenberg - Arte barocca nella Repubblica Ceca
Veletržní palác - Collezione di arte del XIX secolo e contemporanea
Palazzo di Fryštát
Žďár nad Sázavou - Monastero