Reacción en cadena de la polimerasa

La reacción en cadena de la polimerasa, conocida como PCR por sus siglas en inglés (polymerase chain reaction) o como RCP, es una técnica de la biología molecular desarrollada en 1986 por Kary Mullis.Su objetivo es obtener un gran número de copias de un fragmento de ADN particular, partiendo de un mínimo; en teoría basta partir de una sola copia de ese fragmento original, o molde.²

Esta técnica sirve para amplificar un fragmento de ADN; su utilidad es que tras la amplificación resulta mucho más fácil identificar, con una probabilidad muy alta, virus o bacterias causantes de una enfermedad, identificar personas (cadáveres) o hacer investigación científica sobre el ADN amplificado. Estos usos derivados de la amplificación han hecho que se convierta en una técnica muy extendida, sobre todo en el ámbito de la investigación forense, con el consiguiente abaratamiento del equipo necesario para llevar a cabo dicha técnica.

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Gel de agarosa teñido con bromuro de etidio que muestra varios productos de PCR obtenidos mediante el uso de distintos cebadores.

Fundamento e importancia

Esta técnica se fundamenta en la propiedad natural de las ADN polimerasas para replicar hebras de ADN, para lo cual se emplean ciclos de altas y bajas temperaturas alternadas para separar las hebras de ADN recién formadas entre sí tras cada fase de replicación y, a continuación, dejar que las hebras de ADN vuelvan a unirse para poder duplicarlas nuevamente. La reacción en cadena de la polimerasa fue perfeccionada por Kary Mullis perteneciente a la Cetus Corporation en California, en la década de 1980. Inicialmente la técnica era lenta, ya que las polimerasas se desnaturalizaban al realizar los cambios de temperatura y era necesario agregar nuevas polimerasas en cada ciclo. Puesto que las temperaturas del ciclo (95 °C en las fases de desnaturalización del ADN) suponen la inmediata desnaturalización de toda proteína, se emplean ADN polimerasas termoestables, extraídas de microorganismos adaptados a vivir a esas temperaturas, restrictivas para la mayoría de los seres vivos. Dichos microorganismos, generalmente arqueas, son: Thermus aquaticus (polimerasa Taq), Pyrococcus furiosus (Pfu), Thermococcus litoralis (Vent) y Thermus thermophilus (Tth). Generalmente se emplean mezclas de polimerasas muy procesivas (Taq) con otras capaces de hacer corrección de errores (Pfu, Vent).

Hoy, todo el proceso de la PCR está automatizado mediante un aparato llamado termociclador, que permite calentar y enfriar los tubos de reacción para controlar la temperatura necesaria para cada etapa de la reacción. Muchos termocicladores modernos hacen uso del efecto Peltier, que permite tanto calentar como enfriar los tubos simplemente invirtiendo la corriente eléctrica. Los tubos usados para PCR tienen una pared muy fina, lo que favorece una buena conductividad térmica, permitiendo que se alcance rápidamente el equilibrio térmico. Casi todos los termocicladores tienen un sistema que calienta la tapa de cierre con el fin de evitar la condensación sobre los tubos de reacción. Los termocicladores más antiguos carecían de este sistema y solucionaban el problema de la condensación con una capa de aceite en la parte superior de la mezcla de reacción o con un poco de cera dentro de los tubos. Actualmente existen algunos termocicladores que utilizan o pueden utilizar aceite mineral en el tubo de PCR como los termocicladores de nueva generación de flujo de aíre.

Por lo general, la PCR es una técnica común y normalmente indispensable en laboratorios de investigación médica y biológica para una gran variedad de aplicaciones. Entre ellas se incluyen la clonación de ADN para la secuenciación, la filogenia basada en ADN, el análisis funcional de genes, el diagnóstico de trastornos hereditarios, la identificación de huellas genéticas (usada en técnicas forenses y test de paternidad) y la detección y diagnóstico de enfermedades infecciosas.

Reactivo

Para realizar la técnica se necesitan:

Los 4 desoxirribonucleótidos-trifosfato (dNTP), sustratos para polimerizar nuevo ADN.
Dos cebadores o iniciadores (en inglés, primers), oligonucleótidos que son, cada uno, complementarios a una de las dos hebras del ADN. Son secuencias cortas, de entre seis y cuarenta nucleótidos, normalmente de dieciocho a veintidós, que permiten que la polimerasa inicie la reacción. Deben estar enfrentados y no a mucha distancia. Delimitan la zona de ADN a amplificar, es decir, corresponden a los nucleótidos que definen los extremos de la secuencia que se desea replicar.
Iones divalentes. Se suele usar magnesio (Mg²⁺), agregado comúnmente como cloruro de magnesio (MgCl₂), o algún otro catión divalente. También se puede emplear manganeso (Mn²⁺), para mutagénesis de ADN mediante PCR, ya que altas concentraciones de Mn²⁺ incrementan la tasa de error durante la síntesis de ADN. Actúan como cofactores de la polimerasa.
Iones monovalentes, como el potasio.
Una solución tampón o buffer que mantiene el pH adecuado para el funcionamiento de la ADN polimerasa.
ADN polimerasa o mezcla de distintas polimerasas con temperatura óptima alrededor de 70 °C (la más común es la polimerasa Taq).
ADN molde, que contiene la región de ADN que se va a amplificar.
Termociclador, el aparato que mantiene la temperatura necesaria en cada una de las etapas que conforman un ciclo.

Conceptos de la PCR

Sensibilidad: se refiere a la cantidad mínima de ADN necesaria para que se produzca la amplificación, es decir, para obtener una banda. Se relaciona con los falsos negativos, ya que puede que una muestra sea positiva pero sea dada como negativa porque no se ha amplificado por no tener suficiente cantidad de ADN.
Especificidad: se refiere a la obtención de un solo producto amplificado. Viene determinada por los oligos y la especificidad con la que se unen al ADN molde. De esta forma, si los oligos tienen más de un sitio al que se pueden unir aparecerá más de un producto amplificado. Se relaciona con los falsos positivos, ya que puede que una muestra sea negativa pero sea dada como positiva porque se ha amplificado una región de ADN no diana o que no se buscaba amplificar.
Eficiencia: se refiere a la amplificación máxima que se puede obtener en un número determinado de ciclos.
Fidelidad: se refiere a los errores que comete la ADN polimerasa durante la amplificación. Este concepto es de especial importancia en la secuenciación, pero en otros casos no es tan importante. Una buena fidelidad permite evitar falsos positivos y/o negativos.

Ciclo de amplificación

El proceso de PCR por lo general consiste en una serie de 20 a 35 cambios repetidos de temperatura llamados ciclos; cada ciclo suele consistir en 2-3 pasos a diferentes temperaturas. La PCR común se realiza con ciclos que tienen tres pasos de temperatura. Los pasos de ciclos a menudo están precedidos por un choque térmico (llamado "hold") a alta temperatura (> 90 °C), y seguido por otro hold al final del proceso para la extensión de producto final o el breve almacenaje. Las temperaturas usadas y el tiempo aplicado en cada ciclo dependen de gran variedad de parámetros. Estos incluyen la enzima usada para la síntesis de ADN, la concentración de iones divalentes y de los dNTP en la reacción, y la temperatura de unión de los cebadores, así como la longitud del ADN que se desea amplificar.

Actualmente, casi todos los termocicladores dan la opción de realizar la reacción de PCR con la llamada " tapa caliente". Es decir, que el sistema del termociclador aplicará calor a la parte de arriba del vial que contiene la mezcla de PCR. Al comienzo, los laboratorios que empezaron a usar los primeros aparatos que se comercializaron y que no incluían este sistema tenían que poner unas gotas de aceite dentro del vial. El objetivo de este procedimiento, al igual que el de la tapa caliente, es evitar la condensación de la muestra, ya que en el eppendorf se encuentran dos fases:líquido y gas. Al condensarse la muestra, perdemos volumen de la mezcla. Sin embargo, calentando la tapa o poniendo las gotas de aceite evitamos este proceso físico, conservando casi intacto el volumen de la muestra.

Tubos de PCR que albergan la mezcla en un volumen total de 1000 μL.

Termociclador: aparato en el que se efectúa la PCR convencional.

Inicio

Este paso consiste en llevar la reacción hasta una temperatura de 94-96 °C (ó 98 °C si se está usando una polimerasa termoestable extrema), que se mantiene durante 1-9 minutos. Esto solo es necesario para ADN polimerasas que requieran activación por calor.

Desnaturalización

En primer lugar, se desnaturaliza el ADN (se separan las dos cadenas de las cuales está constituido). Este paso puede realizarse de diferentes modos, siendo el calentamiento (94-95 °C) de la muestra la forma más habitual. La temperatura a la cual se decide realizar la desnaturalización depende, por ejemplo, de la proporción de G+C que tenga la cadena, como también del largo de la misma. Otros métodos, raramente empleados en la técnica de la PCR, serían la adición de sales o agentes químicos capaces de realizar la desnaturalización.

Alineamiento o unión del cebador

Esquema general de la PCR.

A continuación se producirá la hibridación del cebador, es decir, el cebador se unirá a su secuencia complementaria en el ADN molde. Para ello es necesario bajar la temperatura a 40-68 °C durante 20-40 segundos (según el caso), permitiendo así el alineamiento. Los puentes de hidrógeno estables entre las cadenas de ADN (unión ADN-ADN) solo se forman cuando la secuencia del cebador es muy similar a la secuencia del ADN molde. La polimerasa une el híbrido de la cadena molde y el cebador, y empieza a sintetizar ADN. Los cebadores actuarán como límites de la región de la molécula que va a ser amplificada.

Grado de amplificación según el número de ciclos empleados. A: gel de agarosa (1: ladder, 2: producto específico, 3: producto inespecífico); B concentración de ADN respecto del tiempo; C logaritmo de la concentración de ADN respecto del tiempo.

Extensión o elongación de la cadena

Actúa la polimerasa, tomando el ADN molde para sintetizar la cadena complementaria y partiendo del cebador como soporte inicial necesario para la síntesis de nuevo ADN. La polimerasa sintetiza una nueva hebra de ADN complementaria a la hebra molde añadiendo los dNTP complementarios en dirección 5'→ 3', uniendo el grupo 5'-fosfato de los dNTP con el grupo 3'-hidroxilo del final de la hebra de ADN creciente (la cual se extiende). La temperatura para este paso depende del ADN polimerasa que usemos. Para la polimerasa Taq, la temperatura de máxima actividad está en 75-80 °C (comúnmente 72 °C). El tiempo de extensión depende tanto del ADN polimerasa usada como de la longitud del fragmento de ADN que se va a amplificar. Hay una regla comúnmente usada: en su temperatura óptima, la polimerasa de ADN polimerizará mil bases en un minuto.

Elongación final

Etapa única que se lleva a cabo a una temperatura de 70-74 °C durante 5-15 minutos tras el último ciclo de PCR. Con ella se asegura que cualquier ADN de cadena simple restante sea totalmente ampliado.

Conservación

Este es un paso que se lleva a cabo a 4-15 °C durante un tiempo indefinido para conservar la reacción a corto plazo.

La PCR normalmente se realiza con un volumen de reacción de 15-100 μL, en pequeños tubos de 0.2-0.5 mL que se colocan en el termociclador.

Para verificar que la PCR ha generado el fragmento de ADN previsto, se emplean técnicas de electroforesis, que separan los fragmentos de ADN generados de acuerdo a su carga, esto es, longitud, y, en menor medida y dependiendo de la matriz empleada, a su tamaño: típicamente se emplean la electroforesis en gel de agarosa, para fragmentos grandes; en acrilamida, para los más pequeños; y, de forma más rápida y aplicable a la PCR asociada a marcaje fluorescente, la electroforesis capilar. El/los tamaño/s de los productos de la PCR vienen determinados por un marcador de peso molecular de ADN, el cual contiene fragmentos de ADN de tamaño conocido, y que se corre en el gel junto con los productos de PCR.

Optimización de la PCR

En la práctica, la PCR puede fallar por varias razones, entre ellas:

La PCR es una técnica de gran sensibilidad, es decir, necesita una mínima cantidad de ADN para obtener un gran número de copias. Además, puede ser muy propensa a errores si se lleva a cabo en condiciones inadecuadas de esterilidad, que conduzcan a la amplificación de ADN no correspondiente a la muestra a analizar (y por tanto a conclusiones inciertas). Se han de tomar una serie de precauciones para evitar la contaminación con ADN extraño. Ejemplos en los que es especialmente importante evitar la amplificación son la detección de enfermedades (para no diagnosticar erróneamente a los pacientes) o el diagnóstico de identidad y parentesco. Posibles precauciones son:
- Tener especial cuidado durante los pasos previos a la amplificación: recogida, envío, custodia y procesado de muestras.
- Limpieza exhaustiva y esterilización (lejía, etanol, luz UV, psoralenos...) de la superficie de trabajo entre la realización de una PCR y la siguiente.
- En laboratorios de diagnóstico genético, se suelen tener áreas separadas de trabajo: un laboratorio para la preparación de la mezcla madre para la PCR, otro para la adición del ADN a amplificar, otro donde se encuentra la maquinaria para realizar la PCR y otro donde se abre y analiza la muestra ya amplificada.
- Cabinas de seguridad biológica para reducir vapores cargados de amplicones de enfermedades.
- Protección adecuada de los operarios que manipulen las muestras y los instrumentos del laboratorio: guantes, bata, cubrezapatos, gafas de seguridad, pelo recogido... En el diagnóstico molecular es conveniente que se cambien estos elementos al pasar de una zona de trabajo a otra.
- Controles positivos y negativos.
- Tipado de todo el personal del laboratorio. En el caso de encontrar una amplificación no esperada se podrá comprobar si proviene de uno de los operarios.
Las técnicas de diseño de cebadores son importantes en la mejora de la obtención de productos de PCR y en evitar la formación de productos falsos. Algunas consideraciones al diseñar estos cebadores son:
- Se recomienda usar primers de más de 15 nucleótidos (18-30 nn) Normalmente, se suelen diseñar de 20 nucleótidos. Los cebadores muy cortos hacen que nuestra PCR no sea muy específica, y los que se excedan en longitud harán que perdamos rendimiento en la reacción.
- Los primers no deben diferir en más de 3 bases.
- La proporción entre bases púricas y pirimidínicas de los dos oligos sea 1:1 (40-60% a lo sumo), y que empiecen y terminen con 1 o 2 bases púricas.
- Se requiere una distribución homogénea de los cuatro nucleótidos en la secuencia, evitando los poliT/A/G/C.
- La Tm (melting temperature) de los oligos no puede diferir en más de 5 °C.
- Los cebadores no deben incluir en su secuencia regiones que sean complementarias entre sí, o se formarán dímeros entre ellos.
Existe una gran variedad de polimerasas disponibles, pudiendo elegir la que más se ajuste a nuestras necesidades. Por ejemplo, algunas tienen actividades inexistentes en otras o las realizan de forma más eficiente, o funcionan en intervalos de temperatura en los cuales otras se desnaturalizan o pierden funcionalidad. Las más habituales son la taq y la pfu.
Los componentes del tampón de reacción deberán ajustarse a las exigencias de nuestras enzimas.
El termociclador, por supuesto, debe ser capaz de reproducir correctamente los ciclos de la PCR: para ello, diversas casas comerciales nos ofrecerán termocicladores elaborados con materiales que hagan más eficaces el desarrollo y el transcurso de las etapas, además de diversas facilidades de manejo. Dentro del laboratorio, su manejo, mantenimiento y ubicación será clave.

Aparte de aspectos como la contaminación y algún fallo en la hibridación de primers, puede haber otras complejidades que afecten a la PCR, como son:

Degradación del ADN: esto puede ocurrir cuando se manipula la muestra en condiciones subóptimas o cuando se hace una autopsia, por ejemplo, y resulta en ausencia de amplificación o resultados parciales. Un caso particular es el "allele dropout", o bien pérdida de un alelo, que se puede llegar a confundir con ser homocigótico para dicho alelo.
Inhibición de la PCR: puede haber agentes que interfieran en el correcto transcurso de la PCR. Requerirá un procesamiento adicional de la muestra para eliminar estos compuestos del medio antes de preparar la mezcla de PCR. Tanto la sangre como el semen contienen este tipo de inhibidores, por lo que es necesario una purificación previa.
Modificación del ADN: las sustancias como el formol (empleado en conservación de tejidos) o la luz ultravioleta modifican el ADN, alterando así los resultados de la amplificación.
Artefactos: pueden darse situaciones como las bandas "stutter" o "shadow", que consisten en que la polimerasa amplifica una repetición de más de un microsatélite o repetición en tándem.
Alelo fuera de patrón: un alelo amplificado puede no coincidir con el patrón de picos de la referencia. Esto es señal de que algo ha ido mal durante la PCR.
Mezclas: es posible que dos muestran se mezclen de alguna forma y el resultado sea una combinación del patrón de picos que cabe esperar tras la amplificación de cada una de ellas por separado. Esto y el caso anterior dificulta la interpretación de los resultados.

Tipos de PCR

PCR anidada

Técnica muy sensible de PCR en la que el producto de una amplificación es utilizado como molde para realizar una segunda amplificación con cebadores que se ubican dentro de la primera secuencia amplificada, es decir, cuando tenemos el primer, como su amplificación se pueden unir los cebadores y se hace de nuevo una amplificación dentro de la amplicón inicial. Este tipo de PCR tiene la ventaja de brindar alta sensibilidad y especificidad. La especificidad aumenta porque como es amplificación de un amplicón obtenido previamente, los cebadores solo van a hibridar en un sitio dentro de la molécula y el resultado será una única banda. Así, evitamos posibles hibridaciones inespecíficas de los cebadores. La desventaja de esta técnica es que no nos permite cuantificar la muestra.

PCR de extensión solapada (Mutagénesis)

Se introducen cambios de secuencia dentro de fragmentos (clonados) de ADN. Se requieren 2 cebadores (primers) mutagénicos y otros 2. Se amplifica un fragmento 5' y un fragmento 3' que se solapan portando ambos la mutación. Se usan los productos en otra reacción para producir el ADN mutado de longitud completa.

PCR in situ

La PCR in situ consiste en una reacción de PCR en secciones histológicas o células, donde los productos generados pueden visualizarse en el sitio de amplificación. Es realizada sobre preparaciones fijas en un portaobjetos. En la técnica de PCR in situ se realiza una primera amplificación de ADN blanco y luego detección mediante hibridación in situ convencional con sondas de ADN/ARN. De esta manera pueden detectarse cantidades pequeñísimas de genoma. Esta tecnología es de gran alcance en la capacidad de amplificar específicamente una población de secuencias de menor representación.

PCR múltiple

PCR en la cual se amplifica simultáneamente más de una secuencia. Para ello, se combinan dos o más pares de cebadores en un mismo tubo, junto con el resto de los reactivos de la reacción en cantidades suficientes, para amplificar simultáneamente varios segmentos de ADN. Ventajas: información sobre varios locus en una sola reacción, menor cantidad de molde para el análisis, menor cantidad de reactivos, rápida construcción de bases de datos. Desventajas: para llevarla a cabo adecuadamente y sin errores, se requiere de una cuidadosa optimización del proceso.

PCR con transcriptasa inversa (RT-PCR)

Es una variante de la PCR en la que usamos ARN como molde inicial en vez de ADN, y emplea una transcriptasa inversa (como Tth) para realizar la síntesis de un ADN complementario al ARN (ADNc). De esta forma, el desarrollo inicial de una RT-PCR sería:

1.er paso: retrotranscripción a partir del ARN.
2.º paso: amplificación a partir de la primera hebra de ADNc.
3.er paso: PCR estándar.

PCR en tiempo real o PCR cuantitativo (qPCR)

PCR en tiempo real

Reacción de PCR cuya principal característica es que permite cuantificar la cantidad de ADN o ARN presente en la muestra original, o para identificar con una muy alta probabilidad, muestras de ADN específicas a partir de su temperatura de fusión (también denominado valor T_m, del inglés melting temperature).

Se puede dividir en las técnicas basadas en fluorocromos no específicos y en las técnicas basadas en sondas específicas.

En las técnicas basadas en fluorocromos el ADN, que ve multiplicada su cantidad con cada ciclo, se une al fluorocromo (generalmente SYBR Green) produciendo fluorescencia que es medida por el termociclador apto para PCR en tiempo real. Permite cuantificar solo una secuencia por reacción pero tiene la ventaja de utilizar cebadores normales para su realización. Es mucho más económica que la que usa sondas específicas.

Las técnicas basadas en sondas específicas utilizan una sonda unida a dos fluorocromos que hibrida en la zona intermedia entre el cebador directo (forward) y el inverso (reverse); cuando la sonda está intacta, presenta una transferencia energética de fluorescencia por resonancia (FRET). Dicha FRET no se produce cuando la sonda está dañada y los dos fluorocromos están distantes, producto de la actividad 5'-3' exonucleasa de la ADN polimerasa. Esto permite monitorizar el cambio del patrón de fluorescencia y deducir el nivel de amplificación del gen.

La mayoría de estos inconvenientes se han solucionado con la introducción de la PCR realizada en tiempo real (Q-PCR), que elimina cualquier proceso post-PCR puesto que monitoriza la progresión de la amplificación en el momento en que ocurre. A diferencia de la PCR convencional (en punto final), que mide la acumulación del ADN al final de un número predeterminado de ciclos, con Q-PCR esto se hace durante el proceso de amplificación usando fluorescencia, de forma que su aumento es proporcional a la cantidad de ADN formada. El proceso se puede automatizar fácilmente usando un sistema que realice la amplificación (termociclador) y que a su vez sea capaz de leer fluorescencia. Existe una amplia oferta de aparatos en el mercado. La mayoría pueden trabajar con las diversas opciones de marcado fluorescente y son "abiertos", es decir, permiten programar las condiciones de amplificación y lectura de forma que su uso no queda limitado a unos reactivos determinados.

Variaciones de la PCR básica

PCR específica de alelo: esta técnica de diagnóstico o clonación es usada para identificar o utilizar los polimorfismos de una sola base (SNPs). Utiliza cebadores específicos para las secuencias normal y mutante. El diseño más habitual es un análisis en dos tubos con dos cebadores: uno normal y otro mutante en reacciones separadas junto con los cebadores control.
PCR "assembly": consiste en la síntesis artificial de largas secuencias de ADN, realizando para ello la PCR en un fondo de oligonucleótidos largos con secuencias solapantes cortas.
PCR asimétrica: usada para amplificar preferentemente una cadena del ADN original con respecto a la otra.
PCR de colonia: mediante esta técnica, colonias de bacterias Escherichia coli pueden ser rápidamente examinadas para construcciones viables de vectores de ADN.
Amplificación dependiente de helicasa: esta técnica es muy parecida a la PCR convencional, pero en ella se emplea la enzima helicasa y una temperatura constante en lugar de la polimerasa de ADN y los ciclos repetidos de hibridación-elongación.
PCR hot-start: esta técnica reduce la amplificación inespecífica durante las etapas iniciales de la PCR: mientras que la máquina alcanza la temperatura de la primera etapa (unos 95 ℃) puede que ocurra la unión de los cebadores y se produzca amplificación, ya que en el camino para alcanzar estos 95 ℃ se pasa por la temperatura de anillamiento (que es más baja).

Para evitar esto, la PCR hot-start se basa en que la reacción comience cuando la máquina ya esté a 95º, debido a que antes no se encuentran presentes la polimerasa o el cloruro de magnesio, lo que podemos conseguir mediante varias técnicas:

- Añadir la polimerasa o el cloruro de magnesio tras el periodo de calentamiento

- Separar por una capa de cera los distintos componentes de la reacción. La cera se funde al alcanzar los 95 ℃ y es entonces cuando los componentes entran en contacto

- Anticuerpos anti-polimerasa que estén bloqueando a la polimerasa. Al alcanzar los 95 ℃ estos anticuerpos se inactivan debido a que se desnaturalizan y la polimerasa puede actuar

PCR específica de intersecuencia (ISSR): se trata de un método de PCR para su uso en huella genética, que amplifica regiones entre repeticiones de secuencia simple para producir una huella genética única de longitudes de fragmento amplificadas.
PCR inversa: es un método usado para poder realizar la PCR cuando sólo es conocida una secuencia interna. Muy útil en la identificación de secuencias que flanquean insertos genómicos.
PCR mediada por ligación: este método usa pequeños linkers de ADN ligados al ADN de interés y múltiples cebadores hibridando estos linkers.
PCR específica de metilación (MSP): se usa para detectar metilaciones en islas CpG de ADN genómico.
Amplificación Múltiple Dependiente de Sonda (Multiplex Ligation-dependent Probe Amplification o MLPA): permite amplificar varias secuencias objetivo con un único par de cebadores, evitando así las limitaciones de resolución de la PCR multiplex.
PCR cuantitativa: se usa para medir la cantidad de un producto de PCR. En la técnica clásica de PCR, se cuantifica por aproximación con diluciones y amplificación de concentraciones conocidas de la secuencia diana. También se puede cuantificar por método competitivo: se trabaja con concentraciones crecientes conocidas de un fragmento que puede ser amplificado por los mismos oligos que la muestra de estudio, pero de menor tamaño que esta, de forma que con los resultados obtenidos se puede estimar qué concentración del competidor es equivalente a la de la muestra de cantidad desconocida. La cuantificación en PCR está optimizada en la técnica de PCR en tiempo real.
PCR-TAIL: la PCR termal de entrelazado asimétrico es usada para aislar una secuencia desconocida que flanquea una secuencia conocida.
PCR touchdown: se trata de una variante de la PCR que se emplea cuando se desconoce la secuencia exacta de los extremos de la secuencia a amplificar, de modo que se asume que puede existir alguna base desapareada en el alineamiento cebador-secuencia. Su finalidad es reducir el fondo no específico bajando gradualmente la temperatura de hibridación a lo largo del progreso de la PCR.
PAN-AC: este método usa condiciones isotermas para la amplificación, y puede ser usado en células vivas.
Ciclo térmico rápido para PCR:⁵ La amplificación del DNA puede llevarse a cabo rápidamente, como completar 30 ciclos en menos de 30 minutos: ciclo térmico rápido. Normalmente se ha considerado que las etapas de cada ciclo son tres reacciones que ocurren en tres periodos separados y a tres temperaturas diferentes. Este paradigma del equilibrio secuencial no tiene en cuenta que la temperatura de la muestra no cambia instantáneamente, de hecho, durante una PCR la muestra está la mayoría del tiempo en temperaturas de transición. El ciclo térmico rápido aprovecha la ventaja de la instantánea desnaturalización e hibridación, cuyas temperaturas necesitan alcanzarse, pero no mantenerse. Además, para productos cortos, la extensión puede llevarse a cabo durante la transición a la temperatura de extensión, y por lo tanto, tampoco es necesario mantenerla. Un ciclo rápido podría entonces describirse como 94 ºC, 0 s; 55 ºC, 0 s y 72 ºC, 0 s. Como vemos, este modelo no ayuda, porque nos lleva solo a temperaturas extremas y no nos da información sobre lo que pasa entre ellas. En cambio, en el paradigma cinético para PCR de ciclo rápido se describe completamente el historial de temperaturas de la muestra. Se considera que desnaturalización, hibridación y elongación ocurren en un rango de temperaturas y además pueden solapar temporalmente. Hay termocicladores que permiten que un ciclo se complete en 20-60 segundos, por lo que 30 ciclos tardan de 10 a 30 minutos.

Aplicaciones

La técnica de la PCR tiene multitud de aplicaciones: ya en ciencia básica, como herramienta de detección y/o generación de acervos de fragmentos de ADN de interés; ya en ciencia aplicada, como elemento resolutivo en sí mismo, por ejemplo en diagnóstico clínico.

Investigación

La PCR convencional, se emplea como base para multitud de técnicas en el laboratorio debido a su robustez y rapidez. De este modo, la PCR de punto final permite controlar y detectar los fragmentos de ADN de interés.

Una aplicación de la PCR de extrema importancia es la clonación de secuencias de ADN en vectores, como pueden ser los plásmidos. Para ello, se emplean cebadores que contienen en su extremo 5' una corta secuencia que permite la interacción posterior con otra complementaria situada en el vector de clonación a emplear. Por ejemplo, se puede incluir una diana de restricción en dichos cebadores, de modo que, y si esta no existía previamente en el fragmento y es única en el vector, pueda efectuarse una ligación mediante la ligasa de T4 tras la digestión con la enzima de restricción apropiada de ambos elementos. Otro método asimilable a esta vía es el empleo de la recombinación dirigida; esto es, se adapta al 5' de los cebadores una secuencia que faculta a una recombinasa la recombinación dirigida con un vector dado.

Medicina

En medicina, la PCR se emplea fundamentalmente como herramienta de diagnosis (Coleman y Tsongalis, 2006):

Una de las principales aplicaciones de la PCR es hacer pruebas genéticas para detectar mutaciones en el ADN que provoquen algún tipo de enfermedad.El diagnóstico de enfermedades hereditarias presentes en el genoma es un proceso largo y complicado que puede acortarse significativamente gracias a la PCR. Así, se pueden hacer análisis del ADN de los futuros padres para ver si son portadores, o analizar el ADN de sus hijos por si están afectados por una enfermedad hereditaria. Para el análisis prenatal, las muestras de ADN pueden obtenerse a partir de la amniocentesis, de la muestra de las vellosidades coriónicas o incluso a partir de algunas células fetales que circulan por el torrente sanguíneo de la madre. El uso de la PCR también es esencial para el diagnóstico genético preimplantacional donde se pueden analizar las células del embrión para buscar posibles mutaciones.
Permite el genotipar la especie o especies que provocan un determinado cuadro infeccioso: para ello, se amplifica una zona del genoma bacteriano cuyo producto de PCR posea unas características de tamaño o temperatura de fusión que permitan identificarlo de forma inequívoca. En el caso de infecciones virales que implican la integración del genoma del patógeno en el ADN del hospedador, como es el de la infección por VIH, la PCR cuantitativa posibilita la determinación de la carga viral existente y por tanto, del estadio de la enfermedad.
La PCR también se puede usar en revisiones médicas rutinarias, como en los servicios de donantes de sangre, para test de rutina. A través de esta técnica se pueden detectar infecciones en el donante (como VIH o Hepatitis B) mientras aún están en el periodo de incubación. Dada la sensibilidad de los test de PCR se pueden tomar muestras colectivas o "pools" (por ejemplo, 96 pruebas individuales). Si una de estas muestras colectivas da positivo, se toman a partir de ella muestras progresivamente menores hasta que se encuentre el causante.
También se puede usar la PCR como parte de las pruebas realizadas cuando se hace un trasplante de tejidos. En 2008 se propuso usar esta técnica para reemplazar las pruebas tradicionales con anticuerpos.
A veces, mediante la PCR se pueden hacer terapias personalizadas para pacientes con ciertos tipos de cáncer que producen mutaciones en los oncogenes a partir de la detección de estas mutaciones.

Paleontología, antropología biológica y ciencias forenses

Los campos de la paleontología, antropología biológica y la medicina y antropología forense se han visto enormemente beneficiados por esta técnica, puesto que todas ellas construyen con frecuencia el conocimiento de sus correspondientes disciplinas gracias a restos o huellas de seres vivos. Uno de los materiales biológicos que más información puede proporcionar es el ADN.

La relativa estabilidad de este permite que, aunque fragmentado, se conserve durante largos períodos si las condiciones son propicias.⁶ En ocasiones las muestras intactas con las que se puede contar son extraordinariamente pequeñas o están deterioradas. La PCR soluciona ambos problemas y proporciona cantidades útiles para posteriores pasos de análisis. En primer lugar aumenta la cantidad de material recuperado a partir de muestras escasas, puesto que como ya se dijo anteriormente, en teoría basta una sola molécula para que el proceso pueda tener lugar. También debido a la naturaleza de la técnica y su propósito de amplificación de fragmentos pequeños, esta fragmentación no impide que este ADN pueda ser empleado como molde para una reacción de PCR.

En paleontología y Antropología la PCR permite recuperar las escasas cantidades de ADN que aún no se han degradado. Algunos lugares en que el ADN podría preservarse son la brea las cenizas volcánicas, el ámbar, hielos históricos polares o glaciares y ambientes áridos, sedimentos, así como en los cristales de apatita de restos de esqueleto, siendo posible de ese modo caracterizar cadáveres, fósiles u otros restos mediante genotipado por análisis de microsatélites o incluso genomas de taxones extintos, amplificados de este modo, como pueden ser los realizados mediante el ADN genómico del hombre de Neanderthal. El propósito sería utilizar este ADN amplificado para posteriormente realizar estudios filogenéticos o etnográficos o de poblaciones mediante la comparación de secuencias de ADN, o el estudio de las causas de la separación evolutiva de dos especies.
En las ciencias forenses se emplea para establecer la filiación de una persona o para obtener pruebas a partir de muestras mínimas dejadas por el autor de un crimen como saliva, semen u otros restos de tejidos (Butler, 2005).

Agronomía y diversidad

Tal y como la PCR multiplex permite producir huellas genéticas de individuos concretos, dentro del marco de la genética forense, existen métodos basados en la PCR que permiten discernir entre grupos infraespecíficos de cultivos de interés agronómico; por ejemplo, de cultivares. Para ello, se emplean oligonucleótidos de un tamaño lo suficientemente pequeño como para que ceben de forma relativamente inespecífica, aunque siempre de tal forma que produzcan un patrón de bandas discreto e interpretable. De este modo, la pauta obtenida tras la electroforesis de los fragmentos tiende a agrupar a los individuos de mayor semejanza, que poseen un comportamiento similar, de los que divergen.

Historia

En 1971, un artículo publicado por Kleppe et al. en Journal of Molecular Biology describió por primera vez un método que usaba enzimas para replicar una secuencia pequeña de ADN con cebadores in vitro. Sin embargo, este temprano ejemplo del principio básico de la PCR no recibió mucha atención, y la invención de la reacción en cadena de la polimerasa en 1983 es generalmente atribuida a Kary Mullis.Mullis ganó el Premio Nobel por su trabajo en PCR.

Algo muy a tener en cuenta en la PCR es que la ADN polimerasa que se use sea capaz de soportar las altas temperaturas de >90 °C necesarias para la separación de las dos hebras de ADN de la doble hélice tras cada ciclo de replicación. Las ADN polimerasas que se utilizaron originariamente para los experimentos in vitro previos a la PCR no eran capaces de soportar estas altas temperaturas, por lo que los primeros procedimientos para replicar el ADN eran muy ineficientes, largos y requerían grandes cantidades de ADN polimerasa.

El descubrimiento en 1968 de la polimerasa Taq, una polimerasa de ADN extraída de la bacteria termófila Thermus aquaticus que habita medios de muy alta temperatura (50-80 °C), eliminó los grandes inconvenientes del método de la PCR. Este ADN polimerasa es estable a altas temperaturas, permaneciendo activa hasta después de la desnaturalización del ADN, eliminando la necesidad de añadir a la reacción nueva polimerasa tras cada ciclo. Este descubrimiento permitió automatizar el proceso, antes tan tedioso, acoplándolo al uso del termociclador.

Al mismo tiempo que desarrollaba la PCR en 1983, Mullis trabajaba en Emeryville, California (EE. UU.), para una de las primeras empresas biotecnológicas, Cetus Corporation, donde era responsable de sintetizar cadenas cortas de ADN. Mullis afirma que concibió la idea para la PCR una noche mientras cruzaba la Autopista de la Costa Pacífica (EE. UU.) en su coche. Estaba imaginando una nueva forma de analizar mutaciones en el ADN cuando se percató de que, en lugar de eso, había inventado un método para amplificar regiones específicas de ADN mediante ciclos de duplicación repetidos usando ADN polimerasas. Mullis atribuye la invención de esta técnica a los efectos de la droga psicodélica y alucinógena LSD.

En la revista Scientific American, Mullis resumió el procedimiento: "Comenzando con una única molécula del material genético ADN, la PCR puede generar 100 billones de moléculas iguales en una tarde. La reacción es fácil de hacer, no requiere más que un tubo de pruebas, unos pocos reactivos simples y una fuente de calor". Fue premiado con el Premio Nobel de Química en 1993 por su invención, y siete años después, él y sus colegas del Cetus llevaron a la práctica su propuesta. Sin embargo, han aparecido controversias y diferentes versiones sobre las contribuciones intelectuales y prácticas de otros científicos al trabajo de Mullis, y sobre si él fue el inventor único del principio de la PCR.

Guerras de patentes

La técnica de la PCR fue patentada por Cetus Corporation, donde Mullis trabajaba cuando inventó la técnica en 1983. La enzima polimerasa Taq fue también cubierta de patentes. Tuvieron lugar varios pleitos relacionados con la técnica, incluyendo un pleito fracasado generado por DuPont. La compañía farmacéutica Hoffmann-La Roche adquirió los derechos de las patentes en 1992 y actualmente mantiene las que aún están protegidas.

Electroforesis de proteínas SDS-PAGE resolviendo la polimerasa Taq.

Clonación de un segmento de ADN mediante amplificación con cebadores que contienen una secuencia apta para la recombinación dirigida con un plásmido.

Replicación del ADN

La replicación del ADN es el proceso mediante el cual se duplica una molécula de ADN. Cuando una célula se divide, en primer lugar, debe duplicar su genoma para que cada célula hija contenga un juego completo de cromosomas.

Una de las cosas interesantes acerca de las células es que la gente siempre las considera como una especie de bloques sobre los que se construye el cuerpo, pero a mi me gusta pensar en ellas de forma individual, como si fueran una especie de nanopartículas, o pequeños nanobots, que tienen sus propias actividades individuales, y que juntos forman cosas como tejidos y órganos. De hecho se tiene que considerar la existencia de esas células que actúan con total independencia, sólo por su propia cuenta, como las bacterias. Así que hay células que actúan independientemente, pero también hay células que pueden actuar juntas, como los mohos mucilaginosos, donde tienes células individuales que en un momento determinado se unen y forman una conjunto con entidad propia y actividades muy bien programadas. Así que la célula es muy sorprendente cuando se piensa en ella, porque puede ser cualquier cosa y casi todo lo que constituye un organismo. Y de nuevo, cuando pienso en las células, pienso en estas pequeñas entidades sorprendentes que en conjunto forman cuerpos enteros, aunque tampoco podemos descartar la importancia que tienen individualmente.

Cromosoma

Un cromosoma es un paquete ordenado de ADN que se encuentra en el núcleo de la célula. Los diferentes organismos tienen diferentes números de cromosomas. Los humanos tenemos 23 pares de cromosomas - 22 pares autosómicos, y un par de cromosomas sexuales, X e Y. Cada progenitor contribuye con un cromosoma de su par de autosomas y uno del par sexual, de manera que la descendencia obtenga la mitad de sus cromosomas de su madre y la mitad de su padre.

La replicación del ADN es probablemente uno de los trucos más impresionantes que hace el ADN. Si lo piensas bien, cada célula contiene todo el ADN que necesita para fabricar las demás células. De hecho empezamos siendo una sola célula y terminamos con billones de células. Y durante ese proceso de división celular, toda la información de una célula tiene que ser copiada; y tiene que ser copiado a la perfección. Por tanto, el ADN es una molécula que puede ser replicada para hacer copias casi perfectas de sí misma. Y eso es sorprendente teniendo en cuenta que hay casi tres mil millones de pares de bases de ADN para ser copiadas. La replicación del ADN utiliza polimerasas, que son moléculas dedicadas específicamente sólo a copiar ADN. Replicar todo el ADN de una sola célula humana lleva varias horas, y al final de este proceso, una vez que el ADN se ha replicado, en realidad la célula tiene el doble de la cantidad de ADN que necesita. Entonces la célula se puede dividir y depositar la mitad de este ADN en la célula hija, de manera que la célula hija y la original sean en muchos casos absolutamente idénticas genéticamente

Células

Las células son los bloques estructurales básicos de los seres vivos. Todas las células se pueden clasificar en dos grupos: eucariotas y procariotas. Las eucariotas tienen núcleo y orgánulos envueltos por una membrana, mientras que las procariotas no. Las plantas y los animales están constituidas por un gran número de células eucariotas, mientras que muchos de los microbios, como las bacterias, son células individuales. Se estima que el cuerpo adulto de un humano contiene entre 10 y 100 billones de células

Un cromosoma es la estructura que alberga al ADN en la célula. Los cromosomas son estructuralmente muy sofisticados, conteniendo los elementos necesarios para procesos como la replicación y la segregación. Cada especie tiene un conjunto característico de cromosomas con respecto a su número y organización. Por ejemplo, los humanos tenemos 23 pares de cromosomas - 22 pares de cromosomas llamados autosomas, numerados del 1 al 22-, y un par de cromosomas sexuales, X e Y. Cada progenitor contribuye con un cromosoma de cada uno de sus pares a la descendencia.

El ADN, o ácido desoxirribonucleico, es la molécula que contiene la información genética de todos los seres vivos, incluso algunos virus. El nombre viene de su estructura. El ADN tiene una parte central con un azúcar y un fosfato, a la que se enlazan unas moléculas llamadas bases. La desoxirribosa se refiere al azúcar, y el nucleico es el ácido formado por el fosfato y la base nitrogenada. Estas bases pueden ser de 4 tipos: Adenina, citosina, timina y guanina, nombradas normalmente como A, C, T, G. Y el orden en que se combinen una después de la otra, es lo que codifica la información genética. El ADN se organiza estructuralmente en cromosomas. A nivel funcional se organiza en genes, que son piezas de ADN que generan características físicas específicas. Estas características no vienen directamente del propio ADN, sino de una molécula llamada ARN, formada a partir del ADN, y codifica una proteína. Esto es lo que se llama el dogma central de la biología molecular: en el ADN hay genes que generan ARNs mensajeros, y estos generan proteínas. Y esto es lo que da las diferentes características físicas que observamos en individuos, como el color de ojos, o la altura. También se ha visto que algunas veces estas instrucciones estan almacenadas directamente en el ARN, sin necesidad de pasar a proteínas, como en el caso de los micro ARNs. Pero estos suelen ser una excepción.

ADN (Ácido Desoxirribonucleico)

ADN es el nombre químico de la molécula que contiene la información genética en todos los seres vivos. La molécula de ADN consiste en dos cadenas que se enrollan entre ellas para formar una estructura de doble hélice. Cada cadena tiene una parte central formada por azúcares (desoxirribosa) y grupos fosfato. Enganchado a cada azúcar hay una de de las siguientes 4 bases: adenina (A), citosina (C), guanina (G), y timina (T). Las dos cadenas se mantienen unidas por enlaces entre las bases; la adenina se enlaza con la timina, y la citosina con la guanina. La secuencia de estas bases a lo largo de la cadena es lo que codifica las instrucciones para formar proteínas y moléculas de ARN.

Proteína

Las proteínas son una clase importante de moléculas que se encuentran en todas las células vivas. Una proteína se compone de una o más cadenas largas de aminoácidos, cuya secuencia corresponde a la secuencia de ADN del gen que la codifica. Las proteínas desempeñan gran variedad de funciones en la célula, incluidas estructurales (citoesqueleto), mecánicas (músculo), bioquímicas (enzimas), y de señalización celular (hormonas). Las proteínas son también parte esencial de la dieta.

Muchos genes en el genoma codifican proteínas. Se trata de moléculas de aminoácidos unidos en una secuencia muy específica que produce una molécula funcional que puede plegarse y ser una enzima, o ser parte de la estructura de la célula, o ser secretada y actuar como molécula señalizadora. En total, hay miles y miles de proteínas que se producen cada día en sus células y en su cuerpo. En el genoma humano, hay aproximadamente 20.000 genes que codifican para la producción de proteínas.

Aminoácido

Los aminoácidos son un conjunto de 20 tipos distintos de moléculas y constituyen las piezas básicas para construir proteínas. Las proteínas constan de una o más cadenas de aminoácidos; estas cadenas se llaman polipéptidos. La secuencia de la cadena de aminoácidos determinará cómo se pliega tridimensionalmente el polipéptido, pues la forma que adquiera es muy importante para que sea biológicamente activo. De forma general, la secuencia de aminoácidos que forma una proteína está codificada en un gen.

Los aminoácidos son unas moléculas que se unen en cadena para formar proteínas. De hecho, hay 20 tipos distintos de aminoácidos. Es como si tuviéramos un collar de perlas de distintos colores, donde cada perla es un aminoácido. Estas cadenas son lo que llamamos polipéptidos, un conjunto de aminoácidos en un orden o secuencia determinada. Las proteínas, por tanto, están hechas de cadenas polipeptídicas. Pero, lo realmente interesante de los aminoácidos es que, cuando se unen entre ellos y forman cadenas, éstas se repliegan y dan una forma concreta a la proteína resultante. Dependiendo de la forma, la proteína podrá desempeñar una función u otra dentro de la célula.

Gen

El gen es la unidad física básica de la herencia. Los genes se transmiten de los padres a la descendencia y contienen la información necesaria para precisar sus rasgos. Los genes están dispuestos, uno tras otro, en estructuras llamadas cromosomas. Un cromosoma contiene una única molécula larga de ADN, sólo una parte de la cual corresponde a un gen individual. Los seres humanos tienen aproximadamente 20.000 genes organizados en sus cromosomas.

Un gen puede ser tan pequeño como unos pocos cientos de pares de bases o tan largo como miles. Los genes BRCA1 y BRCA2, por ejemplo, son enormes, muy largos. El gen de la beta-globina, por el contrario, sólo tiene unos pocos cientos de nucleótidos. La forma habitual de visualizar un gen es un paquete de información que, en general, codifica para una proteína. Por supuesto, el gen no lleva a cabo su función en el ADN. Es la proteína producida a partir del mismo la que realiza la actividad. Ésto se ha vuelto un poco más lioso porque hay veces en que un gen no hace sólo una proteína. A menudo, a causa de un procesamiento alternativo, un gen puede producir múltiples proteínas. Y por supuesto, hay genes que ni siquiera hacen ninguna proteína. Dan lugar a moléculas de ARN que tienen algún papel funcional. Y algunas personas han comenzado a cuestionar si el término "gen" es útil, ya que se ha vuelto tan complicado. No se preocupe, todavía es un término muy útil. Los genetistas no sabrían mantener una conversación sin utilizar esta palabra.

Genoma

El genoma es el conjunto de instrucciones genéticas que se encuentra en una célula. En los seres humanos, el genoma consiste de 23 pares de cromosomas, que se encuentran en el núcleo, así como un pequeño cromosoma que se encuentra en las mitocondrias de las células. Cada conjunto de 23 cromosomas contiene aproximadamente 3,1 mil millones de bases de la secuencia de ADN.

"Genoma", o "genome" en inglés, es una palabra curiosa. Nadie sabe exactamente como se pronuncia correctamente en este idioma. ¿Es "yinom" o "yiinóm"? He oído varias malas pronunciaciones, algunas realmente divertidas. Pero, básicamente, el genoma es el conjunto completo de instrucciones de un organismo; todo su ADN. Para los humanos, asciende a alrededor de 3,100 millones de letras del código - A, C, G y T - todas en el orden correcto, y repartidas entre los distintos cromosomas.

Par de bases

Un par de bases es un par de bases químicas que interaccionan entre ellas. Podemos imaginar que la doble hélice de ADN es como una escalera de mano, donde los pasamanos son las dos hebras enrolladas entre sí. La unión entre los pares de bases corresponde al peldaño de la escalera. Cada hebra está formada por la alternancia de un azúcar (desoxirribosa) y un grupo fosfato. En cada azúcar, hay anclada una de las cuatro bases nitrogenadas: adenina (A), citosina (C), guanina (G) o timina (T). Las dos hebras se mantienen juntas gracias a los puentes de hidrógeno entre las bases complementarias, es decir, la adenina con la timina, y la citosina con la guanina.

El término par de bases alude a los bloques que construyen las cadenas de ADN. Así, cada molécula de ADN está formada por dos hebras, y hay cuatro tipos de nucleótidos presentes en el ADN: A, C, T y G. Cada uno de los nucleótidos de una hebra es complementario o interacciona con un nucleótido específico de la otra hebra, y así se mantiene unida la doble hélice. Si, por ejemplo, tenemos una G en una hebra, en la otra hebra siempre habrá una C con la que interactúa. Si, en cambio, hay una T, su pareja en la otra hebra será la A. Así, los nucleótidos siempre se complementan. Podemos contar el ADN y la cantidad de ADN, o su longitud, usando los pares de bases. De este modo, cuando hablamos de un gen y queremos describir cómo es de grande, podríamos decir que este gen tiene una longitud de mil pares de bases. Si se trata de un gen muy largo, podría tener 10.000 pares de bases o, lo que es equivalente, 10 kilobases. Por lo tanto, usamos el par de bases como una unidad para medir el ADN y el ARN, y también para describir la relación entre las bases nitrogenadas.

Doble hélice

La doble hélice es la descripción de la estructura de una molécula de ADN. Una molécula de ADN consiste en dos cadenas que serpentean una alrededor de la otra como una escalera de caracol. Cada cadena tiene una espina dorsal en la cual se alternan un azúcar (desoxirribosa) y un grupo fosfato. A cada azúcar se une una de las cuatro bases: adenina (A), citosina (C), guanina (G) o timina (T). Las dos cadenas se mantienen unidas por enlaces entre las bases nitrogenadas, adenina formando enlaces con la timina, y citosina con la guanina.

La doble hélice se ha convertido en el icono para muchos, y rodea muchas discusiones acerca del pasado y el futuro de la ciencia. Es realmente una estructura impresionante. No se puede mirar a la doble hélice por mucho tiempo sin tener una especie de respeto hacia la elegancia de esta molécula de ADN en que se guarda la información genética. La forma de doble hélice es, básicamente, la manera en que todas las formas de vida están conectadas entre sí, porque todos utilizan esta misma estructura para la transmisión de esa información. Por supuesto, se trata del increíble descubrimiento de Watson y Crick en 1953, pero se mantendrá probablemente en la historia como uno de los momentos científicos más importantes de todos los tiempos.

Adenina

La adenina (A) es una de las cuatro bases nitrogenadas que se encuentran en el ADN, juntamente con las otras tres bases: la citosina (C), la guanina (G) y la timina (T). En la molécula del ADN, las bases adenina que se encuentran en una hebra interaccionan con las bases timina de la hebra opuesta, formando así la doble hélice del ADN. La secuencia de las cuatro bases del ADN proporciona las instrucciones genéticas de la célula. Una forma de la adenina llamada 'adenosina trifosfato' (ATP) sirve como molécula de reserva energética, y proporciona energía para que puedan tener lugar muchas reacciones químicas dentro de la célula.

La adenina es una de las cuatro bases que forman el ADN. Corresponde a la letra A de la secuencia que combina A, C, G y T en el ADN. La adenina tiene la propiedad de que, cuando se encuentra en la doble hélice, siempre está formando pareja con la timina de la hebra opuesta. La adenina también está presente en otras partes de la célula, no sólo en el ADN o el ARN. También forma parte de la molécula 'adenosina trifosfato', la fuente energética de la célula por excelencia. Por lo tanto, la adenina juega un doble papel en la célula: sirve para construir ADN y ARN, y también se utiliza para almacenar energía en la célula.

Citosina

La Citosina (C) es una de las cuatro bases del ADN, siendo las otras tres la adenina (A), guanina (G) y timina (T). Dentro de la molécula de ADN, las bases de citosina se encuentran localizadas en una cadena formando enlaces químicos con las bases de guanina de la cadena opuesta. La secuencia de las cuatro bases del ADN es lo que codifica las instrucciones genéticas de la célula.

La Citosina es uno de los cuatro componentes básicos del ADN y el ARN, y es uno de los cuatro nucleótidos que son parte del código genético. La Citosina tiene la propiedad única de unirse en la doble hélice frente a la guanina, uno de los otros nucleótidos. La Citosina tiene otra propiedad interesante que no posee ninguno de los otros nucleótidos, y es que muy a menudo en la célula, la citosina puede tener un producto químico adicional ligado a ella; un grupo metilo. Esta metilación del ADN en citosinas se cree que ayuda a regular los genes, a activarse y desactivarse.

Guanina

La guanina (G) es una de las cuatro bases químicas del ADN, siendo las otras tres la adenina (A), la citosina (C), y la timina (T). Dentro de la molécula de ADN, las bases de guanina localizadas en una hebra forman puentes químicos con la citosina de la hebra opuesta. Las instrucciones genéticas de la célula están codificadas por la secuencia compuesta por las cuatro bases.

La guanina es una de las unidades de construcción del ADN. Le corresponde la letra G dentro de las letras A, C, G, o T. La guanina se aparea con la citosina en la doble hélice, por lo que veran pares GC; una en una hebra y la otra en la otra hebra. Los pares CG crean uniones más fuertes que los pares AT, por lo que tramos largos de CG dan lugar a hebras más firmes que hélices con regiones AT.

Timina

Timina (T) es una de las cuatro bases químicas del ADN, los otros tres son adenina (A), citosina (C) y guanina (G). Dentro de la molécula de ADN, las bases de timina se encuentra en una línea que forma enlaces químicos con las bases de adenina en la cadena opuesta. La secuencia de cuatro bases del ADN codifica las instrucciones genéticas de la célula.

Timina es uno de los componentes básicos del ADN. Es uno de los cuatro nucleótidos que se unen para hacer la larga secuencia que se encuentran en el ADN, de C, A, G y T. En la doble hélice, la timina se aparea con la adenina; el nucleótido A.

Uracilo

Uracilo (U) es una de las cuatro bases químicas que forman parte del ARN. Las otras tres bases son la adenina (A), citosina (C) y guanina (G). En el ADN, la base timina (T) se encuentra en lugar del uracilo.

El uracilo es un nucleótido, al igual que la adenina, guanina, timina y citosina, que son los componentes básicos del ADN, excepto que el uracilo reemplaza a la timina en el ARN. Así uracilo es un nucleótido que se encuentra casi exclusivamente en el ARN.

Nucleótido

Un nucleótido es la pieza básica de los ácidos nucleicos. El ARN y el ADN son polímeros formados por largas cadenas de nucleótidos. Un nucleótido está formado por una molécula de azúcar (ribosa en el ARN o desoxirribosa en el ADN) unido a un grupo fosfato y una base nitrogenada. Las bases utilizadas en el ADN son la adenina (A), citosina (C), guanina (G) y timina (T). En el ARN, la base uracilo (U) ocupa el lugar de la timina.

El ADN consiste en una secuencia lineal de nucleótidos, o bases, que por simplicidad se cita por las primeras letras de sus nombres químicos - A, T, C y G. El proceso de deducir el orden de los nucleótidos en el ADN se denomina secuenciación del ADN. Dado que la secuencia de ADN confiere la información que utiliza la célula para la fabricación de las moléculas de ARN y proteínas, disponer de la secuencia de ADN es clave para entender cómo funcionan los genomas. La tecnología de secuenciación de ADN se hizo más rápida y menos costosa, a partir del Proyecto del Genoma Humano. Y otros progresos más recientes han aumentado aún más la eficiencia de la secuenciación del ADN.

Proyecto Genoma Humano

El Proyecto Genoma Humano fue el proyecto internacional que mapeó y secuenció todos los genes humanos. Terminado en abril de 2003, los datos del proyecto están a libre disposición de los investigadores y otros interesados en genética y salud humana.

El Proyecto Genoma Humano fue anunciado en 1990. Fue un esfuerzo internacional, pero fuertemente liderado por Estados Unidos. Tenía la meta audaz de haber determinado todas las letras del código del ADN humano en 2005. Para gran alivio de los que estábamos involucrados en él, y creo que para alegría del público también, terminamos dicho proyecto en 2003, más de dos años antes de lo previsto y por debajo de presupuesto, y produjimos toda esta información para el dominio público con la que, por siempre, la gente puede seguir trabajando en entender cómo funciona y aplicarlo en beneficio de la medicina.

Clonación

La clonación consiste en hacer copias idénticas de un organismo, célula o secuencia de ADN. La clonación molecular (de ADN) es un proceso que usan los científicos para amplificar una secuencia concreta de ADN (es decir, obtener muchas copias de ella). Para hacerlo, primero se aísla la secuencia diana; después se inserta este fragmento dentro de otra molécula de ADN (conocida con el nombre de 'vector') y, finalmente, se introduce en una célula huésped adecuada. Cada vez que esta célula huésped se divide, se replica también la secuencia de ADN foráneo insertado, como si fuera una parte más de su propio ADN. También hablamos de clonación para referirnos a la reproducción asexual.

Clonación es una palabra que describe el proceso molecular de hacer miles de millones de copias a partir de una sola molécula. En este caso, hay que distinguirlo de otros términos como 'clonación celular' o 'clonación de organismos enteros', que se usan en el campo de la genética reproductiva. También usamos la clonación molecular para amplificar, o hacer muchas copias, de genes o proteínas.

Farmacogenómica

La Farmacogenómica es una rama de la farmacologia, que utiliza el ADN y datos de la secuencia de aminacidos para aplicarlos al desarrollo de drogas y nuevas pruebas clinicas. Una aplicacion importante de la Farmacogenómica es correlacionar las variaciones geneticas individuales con la respuesta a drogas.

La Farmacogenómica es una combinación de dos campos de la investigación y dos palabras diferentes: "farmacología" y "genómica". Se refiere a la diferencia de los genomas de diferentes personas, que dan lugar a diferencias en la respuesta a fármacos. En otras palabras, la manera en que responden los individuos a un medicamento en particular. La Farmacogenómica se utiliza de muchas maneras. Se usa más comúnmente para estudiar si diferentes personas tienen genomas ligeramente diferentes, y esta diferencia en la secuencia del ADN ¿tendrá una influencia positiva en la respuesta a un medicamento (efecto terapéutico esperado) o negativa (falta de efecto terapéutico) o podrá predecir un efecto secundario de ese farmaco?

Haplotipo

Un haplotipo es un conjunto de variaciones del ADN, o polimorfismos, que tienden a ser heredados juntos. Haplotipo se puede referir a una combinación de alelos o a un conjunto de polimorfismos de nucleótido sencillo (SNPs) que se encuentran en el mismo cromosoma. Información acerca de distintos haplotipos está siendo recopilada por el Proyecto Internacional HapMap y utilizada para investigar la influencia de los genes en enfermedades.

Un haplotipo es, en su sentido más general, un conjunto de variaciones de ADN a lo largo de un cromosoma que tienden a ser heredados juntos porque están muy próximos. El motivo por el cual se heredan juntos es porque no suele haber cruzamientos o recombinaciones entre estos marcadores, o diferentes polimorfismos, al estar tan cerca. Así que un haplotipo se puede referir a una combinación de alelos en un solo gen, o alelos en múltiples genes. Podrían ser polimorfismos de nucleótido sencillo que no están en un gen, sino en la región intergénica. Básicamente, sólo significa que se trata de variaciones en el ADN que están tan juntos que no tienen tendencia a recombinarse, y por lo tanto tienden a ser transmitidas juntas a traves de generaciones. El Proyecto Internacional HapMap nos ha dado una herramienta excelente para la detección de estas regiones de haplotipos que se transmiten juntos y utilizarlas en estudios genéticos.

NASBA (Nucleic acid sequence based amplification o ampliﬁcación isotérmica de ácidos
nucleicos)
ADN
ARN
Análisis clínicos
Polimerasa
Animación PCR
Artículos sobre PCR
Nueva técnica más eficiente en PCR
Please find all details about real-time PCR here: http://www.gene-quantification.info - The reference in real-time PCR
Simulation en línea de reacciones de PCR frente a procariotas secuenciados.
Ejercicio en línea en el que se diseñan y simulan experimentos de PCR y PCR-RFLP.

Un fragmento foraneo de ADN puede ser diseñado para propagarse como un cromosoma circular artificial dentro de las bacterias - son los llamados cromosomas bacterianos artificiales, o BACs. Cada BAC es un clon de ADN que contiene pares de entre 100 y 300 mil bases de ADN clonado. Debido a que los BACs son mucho menores que el cromosoma bacteriano endógeno, es sencillo purificar el ADN del BAC del resto del ADN de la célula bacteriana, y por tanto, tener el ADN clonado en una forma purificada. Esta y otras propiedades de los BAC los han convertido en extremadamente útiles para el mapeo y la secuenciación de genomas de mamíferos.

Secuenciación del ADN

La secuenciación del ADN es una técnica de laboratorio utilizada para determinar la secuencia exacta de las bases (A, C, G y T) en una molécula de ADN. La secuencia de bases de ADN lleva la información que una célula necesita para ensamblar proteínas y moléculas de ARN. La información de la secuencia de ADN es importante para los científicos que investigan las funciones de los genes. La tecnología de secuenciación de ADN se hizo más rápida y menos costosa como resultado del Proyecto del Genoma Humano.

Las bacterias son microorganismos que pueden tener distintas formas. Pueden ser esféricas, alargadas o espirales. Existen bacterias perjudiciales, llamadas patogénicas, las cuales causan enfermedades; pero también hay bacterias buenas. Por ejemplo, en nuestro sistema digestivo, en el intestino, tenemos bacterias que son muy necesarias para que nuestro cuerpo funcione correctamente. Lo más sorprendente sobre las bacterias es que en nuestro cuerpo tenemos 10 veces más células bacterianas que células humanas. Las bacterias también son muy importantes para la biotecnología.

Cromosoma artificial bacteriano (BAC)

Un cromosoma artificial bacteriano (BAC) es una molécula de ADN utilizada para clonar secuencias de ADN en las células bacterianas (por ejemplo, E. coli). Los BAC se suelen utilizar en la secuenciación del ADN. Los segmentos de ADN de un organismo, que van de 100.000 a cerca de 300.000 pares de bases, se pueden insertar en BACs. Los BACs, con su ADN insertado, son entonces introducidos en células bacterianas. A medida que las células bacterianas crecen y se dividen, amplifican también el ADN de los BACs, que después pueden ser aislados y utilizados en la secuenciación del ADN.

Los virus son submicroscópicos, lo que significa que no se pueden ver en el microscopio. Lo que es interesante acerca de los virus es que tienen dos o tres componentes. Comenzando desde el interior, tienen un ácido nucleico, que puede ser ADN o ARN, y en ambos casos el ácido nucleico puede ser tanto de cadena simple como de cadena doble. A continuación, rodeando el ácido nucleico hay una cubierta proteica en forma cápside, o pequeñas unidades que se ensamblan en una cierta manera. Éso es lo que tienen todos los virus. Ahora, algunos virus también tienen una envoltura que obtienen cuando emergen de la célula. Los virus son muy interesantes en cuanto que sólo pueden sobrevivir dentro de una célula viva. Necesitan una célula viva para poder sobrevivir y replicarse. Los antibióticos no son eficaces contra los virus, pero sí lo son las vacunas, así como algunos antivirales.

Bacteria

Las bacterias son organismos procariotas unicelulares, que se encuentran en casi todas las partes de la Tierra. Son vitales para los ecosistemas del planeta. Algunas especies pueden vivir en condiciones realmente extremas de temperatura y presión. El cuerpo humano está lleno de bacterias, de hecho se estima que contiene más bacterias que células humanas. La mayoría de bacterias que se encuentran en el organismo no producen ningún daño, al contrario, algunas son beneficiosas. Una cantidad relativamente pequeña de especies son las que causan enfermedades.

El término "ácido nucleico" es utilizado para describir unas moléculas específicas y grandes en la célula. En realidad están hechas de cadenas de unidades de polímeros que se repiten; los dos ácidos nucleicos más famosos, de los que usted habrá oído hablar, son el ADN y el ARN. Los ácidos nucleicos trabajan en la célula almacenando información. La célula codifica información, como cuando se graba en una cinta, en los ácidos nucleicos. Así que la secuencia de estas moléculas en el polímero puede transmitir "hacer una proteína ", por favor replícame", "trasládame al núcleo ..." La otra parte sorprendente sobre los ácidos nucleicos es que son proteínas muy estables. Si usted piensa acerca de la necesidad de transmitir la información genética de una célula a otra, le gustaría una molécula muy estable y que no se deshaga por sí sola, y eso es una de las principales características de los ácidos nucleicos. El nombre de "ácido nucleico" proviene del hecho de cómo fueron descritos por primera vez, ya que en realidad tienen propiedades ácidas, muy similar a los ácidos que usted conoce. Y el término nucleico viene del hecho de dónde se aislaron por primera vez, ya que se encontraron en el núcleo. Y como ustedes saben ahí es donde el ADN, uno de los tipos de ácidos nucleicos de los cuales hemos estado hablando, se encuentra predominantemente.

Virus

Un virus es una partícula de código genético, ADN o ARN, encapsulada en una vesícula de proteínas. Los virus no se pueden replicar por sí solos. Necesitan infectar células y usar los componentes de la célula huésped para hacer copias de sí mismos. A menudo, el virus daña o mata a la célula huésped en el proceso de multiplicación. Los virus se han encontrado en todos los ecosistemas de la Tierra. Los científicos estiman que sobrepasan a las bacterias en razón de 1 a 10. Puesto que los virus no tienen la misma biología que las bacterias, no pueden ser combatidos con antibióticos. Tan sólo vacunas o medicaciones antivirales pueden eliminar o reducir la severidad de las enfermedades virales, incluyendo SIDA, Covod-19, sarampión y viruela.

El ARN, o ácido ribonucleico, es un ácido nucleico similar en estructura al ADN pero con algunas diferencias sutiles. La célula utiliza el ARN para una serie de tareas diferentes; una de estas moléculas se llama ARN mensajero o ARNm. Y es la molécula de ácido nucleico cuya traducción transfiere información del genoma a las proteínas. Otra forma de ARN es el ARNt o ARN de transferencia, y moléculas de ARN no-codificantes de proteínas que físicamente llevan los aminoácidos al sitio dónde se lleva a cabo la traducción y permiten que sean ensamblados en las cadenas de proteínas en dicho proceso.

Ácido nucleico

Los ácidos nucleicos son un tipo importante de macromoléculas presentes en todas las células y virus. Las funciones de los ácidos nucleicos tienen que ver con el almacenamiento y la expresión de información genética. El ácido desoxirribonucleico (ADN) codifica la información que la célula necesita para fabricar proteínas. Un tipo de ácido nucleico relacionado con él, llamado ácido ribonucleico (ARN), presenta diversas formas moleculares y participa en la síntesis de las proteínas.

Los nucleótidos son las unidades y productos químicos que se unen para formar los ácidos nucleicos, principalmente ARN y ADN. Ambos son largas cadenas de nucleótidos repetidos. Hay una A, C, G y T en el ADN, y en el ARN hay los mismos tres nucleótidos que en el ADN, pero la T se sustituye por un uracilo (U). Los nucleótidos son el componente estructural básico de estas moléculas, que esencialmente son ensamblados de uno en uno por la célula y después se encajan juntos en el proceso de la replicación, en el caso del ADN, o en el que llamamos proceso de transcripción o de producción del ARN.

ARN (ácido ribonucleico)

El ácido ribonucleico (ARN) es una molécula similar a la de ADN. A diferencia del ADN, el ARN es de cadena sencilla. Una hebra de ARN tiene un eje constituido por un azúcar (ribosa) y grupos de fosfato de forma alterna. Unidos a cada azúcar se encuentra una de las cuatro bases adenina (A), uracilo (U), citosina (C) o guanina (G). Hay diferentes tipos de ARN en la célula: ARN mensajero (ARNm), ARN ribosomal (ARNr) y ARN de transferencia (ARNt). Más recientemente, se han encontrado algunos ARN de pequeño tamaño que están involucrados en la regulación de la expresión génica.

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