מיקרוסקופיה
מאת דר' גל חיימוביץ.
דר' גל חיימוביץ, פוסט-דוקטורנט בניו-יורק כתב בשבילנו דף על מיקרוסקופיה אחד מכלי העזר החשובים במחקר הביולוגיה. אפשר לקרוא עוד בבלוג שלו העוסק במיקרוסקופיה פלורסצנטית, או ברשומה בבלוג על שיטה חדשה להסתכל על תאים כפי שהם ברקמה שלמה - clarity במוח
המיקרוסקופ הוא אחד הכלים החשובים ביותר בביולוגיה, והוא משמש להגדלה של דוגמאות ביולוגית זעירות שאינן ניתנות להבחנה בעין בלתי מזויינת. המיקרוסקופ הומצא ע"י אנטוני ואן לוונהוק בשנות ה-70 של המאה ה-17, והוא היה הראשון לתאר יצורים זעירים ("מיקרוסקופיים") החיים במי ביצה, כמו גם תאי גוף שונים ועוד. ב-350 השנים מאז הומצא המיקרוסקופ, הוא השתכלל מאוד, וכיום ניתן למצוא מיקרוסקופ כמעט בכל מעבדה ביולוגית.
קיימים מספר סוגים של מיקרוסקופים המשמשים ביולוגים, העיקריים שבהם הם:
חלבונים זורחים בשלל צבעי הקשת
מקורו של החלבון הזורח בירוק (GFP) הוא מהמדוזה Aequorea Victoria. GFP בודד לראשונה בשנת 1962, והוא היה הראשון במשפחה הולכת וגדלה של חלבונים פלואורסנטים בשלל צבעים. חלבון פלואורסנטי (או כל חומר פלואורסנטי) הוא חלבון שפולט אור באורך גל מסוים לאחר עירור (excitation) ע"י אור באורך גל קצר יותר. למשל, כאשר מקרינים על GFP אור באורך גל של 488nm (אור כחול), החלבון פולט אור באורך גל של 517nm (אור ירוק). באופן דומה, ישנם חלבונים שפולטים אור כחול, ציאן, צהוב, כתום, אדום, אדום רחוק (far red, למשל שָני) ולאחרונה אף פותחו מספר חלבונים שפולטים אור תת-אדום.
השימוש בחלבונים אלה הוא מאוד נפוץ במחקר ביולוגי בשל שלוש סיבות עיקריות:
1. מאוד קל, בשיטות של הנדסה גנטית, לאחות חלבון פלואורסנטי לחלבון אחר אותו מעוניינים לחקור. במקרים רבים, החלבון הפלואורסנטי לא מפריע לתפקוד החלבון הנחקר.
2. החלבון הפלואורסנטי מסוגל להתקפל לבד וליצור לבדו את הכרומופור (המבנה הפנימי שפולט אור), ללא צורך בחלבונים או מולקולות אחרות (מלבד חמצן). כמו כן, חלבונים אלה פועלים בכל אורגניזם – החל מחיידקים ועד לתאי יונקים.
3. מכיוון שהתא עצמו מייצר את החלבון המאוחה אין צורך לחורר את הממברנה (תהליך שנעשה לצורך הכנסת צבעים פלואורסנטים כימיים). כך, ניתן לצלם תאים חיים ולעקוב אחרי החלבון המאוחה בזמן אמיתי.
התגלית של GFP והשימוש בחלבון למיקרוסקופיה, היו המושא לזכיית פרס נובל בכימיה לשנת 2008.
סרטון (עם כתוביות בעברית) שמספר על התגלית והשימושים:
כאן ניתן למצוא מאות סרטונים שקשורים לנושא: http://www.youtube.com/channel/HCVEbq6KUMOE0
ברגע שהחלבון המאוחה (fusion protein) מתבטא בתא הנבדק, ניתן לענות על השאלות הבאות (ועוד רבות אחרות):
1. היכן החלבון נמצא בתא?
2. האם החלבון נע? אם כן, מתי, באיזה כיוון ובאיזו מהירות?
3. האם החלבון בכלל מתבטא בתא בתנאי הניסוי? אם כן, מה רמתו בתא? האם יש אזורים בתא בו יש יותר או פחות ממנו? האם יש תנאים או זמנים מסוימים בהם רמתו עולה או יורדת?
4. מהו קצב יצירתו של החלבון? מהו קצב פירוקו?
כמו כן, ניתן בתא אחד לבטא מספר חלבונים שונים מאוחים לחלבונים פלואורסנטים (כל אחד בצבע אחר), ולהוסיף לכל אחת מהשאלות לעיל, האם זה דומה בין החלבונים השונים?
כיום, קיימים כמה מאות של חלבונים פלואורסנטים שפותחו עבור צרכים שונים. בין החלבונים המיוחדים ניתן למצוא:
1. חלבונים המופעלים באור (photo-activatable) – אלו חלבונים "חשוכים", כלומר לא פולטים אור, אלא אם מפעילים אותם קודם באור על-סגול (בדרך כלל). לאחר ההפעלה, הם פועלים כמו חלבונים זורחים רגילים. ע"י שימוש בקרן לייזר צרה להפעלתם, ניתן להפעיל את החלבון רק באזור מסוים בתא (במקום בכל התא).
2. "שעוני עצר" זרחניים (fluorescent timers) – אלו חלבונים שמשנים את צבעם לאחר פרק זמן מסויים ומדוד. על ידי מדידת שינוי הצבע, ניתן לדעת מה פרק הזמן של תהליכים ביולוגיים מסוימים.
3. "חלבון GFP חצוי" (split GFP)– גילו שניתן לחלק את החלבון לשניים (וכך לאחות כל חצי לחלבון אחר בתא). רק אם שני החצאים יהיו קרובים אחד לשני, החלבון יזרח.
4. מד-חומציות – חלבון שזורח (או משנה את צבעו) בהתאם לרמת החומציות (pH) בתוך האברון בו הוא נמצא.
5. מד-סידן – חלבון שזורח רק כאשר רמת יוני הסידן עולה.
6. קיפול-מהיר (superfolder) – לרוב החלבונים הפלואורסנטים לוקח זמן רב (עשרות דקות עד מספר שעות) להתקפל למבנה הנכון לאחר שהם מתורגמים ע"י הריבוזום. בשל בעיה זו לא ניתן למדוד תהליכים מהירים שקורים מיד לאחר התרגום. לכן, פותח חלבון שמתקפל במהירות (תוך דקות), כדי למדוד תהליכים שקורים מיד לאחר תרגום החלבון המאוחה.