骨の主役が、腸の司令塔だった！

我々が骨代謝の文脈で親しんでいる「RANK-RANKLシグナル」が、実は妊娠・授乳期における腸管リモデリング（巨大化）の真の司令塔だった、というエレガントな報告です。

妊娠期、高まるプロラクチンを感知した腸管間質細胞（Twist2+）がRANKLを放出。それが幹細胞のRANKを叩き、以下の二面性を駆動します。

生存（NF-κB）: 細胞死を防ぎ、絨毛を長くする。

分化（BMP/pSmad）: 幹細胞枯渇を防ぎつつ、吸収上皮への分化を促す。

特に興味深いのは、この腸管拡大が単なる母体の適応に留まらず、「母乳の質」を介して次世代（F1）の代謝的健康（インスリン感受性など）を決定づけているというDOHaD的な視点です。

さらに、大腸がんモデルマウスでは、RANKシグナルを恒常的に活性させると、幹細胞が枯渇して、癌が消失したことも見出され、がん幹細胞の枯渇という新しい治療概念も創出しました。

我々が注目している脱リン酸化酵素 Ctdnep1 は、この回路における「ブレーキ」の役割を果たしている可能性があります。本論文が示した「RANKLというアクセル」と、我々の「ブレーキ」の概念が噛み合ったとき、BMPシグナルの全貌が見えてくると確信しました。

骨芽細胞による骨形成と破骨細胞による骨吸収のバランスが骨の恒常性を維持しています。現在、核内受容体（NR）は骨の生理学および病理学において重要であると理解されています。しかし、NRファミリーメンバーであるファルネソイドX受容体（FXR）の骨の恒常性制御における機能は、依然として完全には理解されていません。本研究では、in vitroとin vivoモデルによって、骨髄間葉系幹細胞（BMSC）および骨芽細胞におけるFXR欠損マウスが、骨芽細胞分化が阻害されることによる骨の発達の遅延と骨粗鬆症表現型を示すことが明らかにされました。FXRのリガンドである胆汁酸は血流に乗って骨に到達します。FXRは胆汁酸と結合してThoc6プロモーターに結合し、Thoc6の発現を抑制しており、FXRを欠損させるとThoc6発現が上昇しました。Thoc6はユビキチンE3リガーゼ複合体のCRL4（Cullin-RING Ligase 4）とRUNX2の結合を媒介し、RUNX2のユビキチン化とその後のプロテアソームによる分解を促進し、これによって骨芽細胞分化が抑制され、骨粗鬆症が引き起こされました。すなわち、FXRはThoc6の発現を抑制しRUNX2のユビキチン化を減少させることで、骨芽細胞分化を促進し骨の恒常性維持に寄与していることが明らかになりました。さらに、経口投与可能なFXRアゴニストであるオベチコール酸（OCA）は卵巣摘出術（OVX）誘導性骨粗鬆症マウスの骨量減少および骨形成の低下を改善しました。よって、FXRを標的とすることは骨粗鬆症に対する有望な治療アプローチとなり得ることが示唆されました。

胆汁酸が骨量を制御するというメカニズムが興味深いと感じました。オベチコール酸は経口投与可能なFXRアゴニストであり、すでに原発性胆汁性胆管炎（PBC）治療薬としてFDAに承認されています。将来オベチコール酸でPBC患者の骨粗鬆症も治療できる可能性が示されたことは大変意義のあることだと思いました。

口蓋裂（Cleft Palate, CP）は、遺伝的要因と環境要因の組み合わせによって引き起こされる一般的な先天性頭蓋顔面奇形です。しかし、その根本的な発症メカニズムは明らかになっておらず、そのプロセスを解明することは口蓋裂の予防と出生前介入療法の可能性を高める上で重要です。また筆者らの先行研究では、口蓋形成中に解糖系から酸化的リン酸化へエネルギー代謝が切り替わる糖代謝リプログラミングが起きることが報告がされています。しかし、糖代謝リプログラミングの機序においても未解明でした。そして脱アセチル化酵素Sirtuin6（SIRT6）の変異はヒトの頭蓋顔面異常と関連しており、その全身欠損は2~3週間後に致死的な低血糖を示すため、Sirt6が顔面奇形と糖代謝の調節に重要な役割を果たしている可能性があります。本研究では、口蓋形成におけるSirt6の役割を明らかにし、その分子メカニズムを解明することを目的としました。またWnt1-Creは頭部神経堤細胞CNCC系譜における特定の遺伝子ノックアウトに広く用いられているため、Cre/loxp組換えシステムを用いて、Sirt6条件付きノックアウトマウス（Wnt1-Cre/Sirt6loxp/loxp, Sirt6 cKO）を作製しました。すると、Sirt6ノックアウト（Sirt6 cKO）が口蓋の骨形成を抑制し、その結果として口蓋裂の発生を促進することを示しました。また先行研究から、外因性TGF-β3がレチノイン酸を介したマウス胚口蓋間葉（MEPM）細胞増殖抑制を著しく阻害できることが明らかとなり、本研究からSirt6はTGFBR1を介して口蓋突起の増殖の初期段階に関与する可能性があることを示唆されました。そして先行研究から骨形成タンパク質2（BMP2）のハプロ不全が口蓋裂に重要な役割を示すことが報告されており、Sirt6は後期段階でBMP2を介して口蓋骨の形成に影響を及ぼす可能性があると示唆されました。

Sirt6 cKOマウスにおいて解糖系の重要な構成要素であるLDHAとHK2のタンパク質発現を評価すると、どちらも有意に増加し、Sirt6が口蓋の糖代謝リプログラミングを抑制していることを示唆しました。さらにChIP-seqによりSirt6がGot1のヒストン3リジン9（H3K9）を直接脱アセチル化したことも示されました。またSirt6欠損によりアセチルトランスフェラーゼp300ではなく、アセチラーゼTip60がGot1のH3K9のアセチル化を促進しました。加えて、Got1阻害剤であるAOAAはSirt6欠損の口蓋裂促進効果を部分的に回復させました。まとめると、MEPM細胞におけるSirt6欠損はGot1の脱アセチル化を阻害し、TGFBR1の活性化とBMP2の阻害を介して増殖能の亢進と分化能の低下を促すことが示唆されました。

エピジェネティックの制御や代謝に意識を向けて読んでいましたが、Got1によるTGFBR1の発現変化が形態形成の異常と関連するという展開には驚きました。Sirt6欠損による代謝の乱れがTGFβシグナルの低下へと繋がる知見は、自分の研究領域とも重なる部分が多いと感じます。今後の実験にぜひ取り入れたいと思いました。

関節リウマチ性（RA）は、慢性的な炎症により関節破壊や骨吸収が進行する自己免疫疾患です。近年、免疫細胞における代謝変化が炎症や組織破壊の制御に重要な役割を果たすことが明らかになってきており、炎症性マクロファージが産生する代謝物であるイタコン酸（ITA）は、抗炎症作用を有する免疫代謝因子として注目されています。しかし、RAにおけるITA産生に関与する細胞種、その標的細胞、および基盤となる分子機構は十分に解明されていませんでした。

そこで本研究では、RA病態におけるITAの主要な細胞起源を明らかにするとともに、ITAが破骨細胞分化および骨吸収に与える影響と、その分子メカニズムを解明することを目的としました。特に、DNA脱メチル化酵素であるTET2に着目し、免疫代謝とエピジェネティクスの観点から骨破壊制御機構の解析を行いました。解析の結果、RA患者の血清および滑液中では、健常者と比較してITA濃度が有意に上昇していることが示されました。また、このITA濃度の上昇は、炎症性サイトカインの増加と相関していました。細胞レベルの解析から、ITAの主要な産生源は炎症刺激を受けたマクロファージであり、破骨細胞や骨芽細胞自身はほとんどITAを産生しないことが明らかになりました。一方で、外因性にITAや細胞透過性誘導体である4-octyl-itaconate（OI）を添加すると、破骨細胞の分化および骨吸収活性が顕著に抑制されました。

さらに分子機構の解析により、ITAはα-KGと競合することで、DNA脱メチル化酵素TET2の活性を抑制することが示されました。その結果、Acp5、Ctsk、Mmp9などの破骨細胞分化および機能に必須な遺伝子の発現が低下し、破骨細胞の過剰な活性化が抑えられることが明らかになりました。実際に、Tet2欠損マウスでは、ITA欠損に伴う骨破壊の促進が改善されており、TET2がITAの作用を媒介する重要な分子であることが裏付けられました。また、関節炎モデルマウスにおいてITAまたはその誘導体を投与すると、関節炎症および骨破壊の双方が有意に抑制されました。

以上の結果から、本研究は、炎症性マクロファージ由来のITAが、TET2を介したエピジェネティック制御によって破骨細胞の過剰な活性化を抑制し、RAにおける骨破壊を防ぐという新たな分子機構を明らかにしました。この知見は、免疫細胞の代謝変化が骨リモデリングに直接影響を及ぼすことを示す重要な成果であり、ITAやTET2を標的とした治療戦略が、RAに伴う骨破壊に対する新規治療法として有望であることを示唆しています。

現在自身が扱っているマウスでも似たような仮説を立てていたため、実験手法や考察に非常に役立つ内容でした。特に、培養条件を分けて検討することで、Irg1の効果が常在的な分化制御因子ではないことを明確に示している点が印象的でした。

不妊症は世界的な問題であり、その30～50％は男性要因によるもので、精子形成障害は男性不妊症の最も一般的な根本原因です。驚くべきことに、現在男性不妊症治療に利用できるFDA承認された薬剤は存在しません。したがって、将来の治療標的となり得る男性生殖系列における重要な分子因子の研究が緊急に必要とされています。

精巣特異的転写産物10（Tex10）は、精巣、胚性幹細胞（ESCs）、および始原生殖細胞（PGCs）において高発現しています。条件付きノックアウトマウスとdTAG-degron ESCsを用いて、Tex10が精子形成およびESCからPGCLCへの分化に必要であることを示しました。Tex10欠損精母細胞は第一分裂中期で停止し、円形精子細胞の形成を損ないます。Tex10の欠損と過剰発現は、それぞれESCからPGCLCへの分化を抑制し、促進します。バルクおよび単一細胞RNAシーケンシングにより、Tex10の欠損が多能性、PGC発生、精子形成に関与する遺伝子の発現を抑制し、一方で、体細胞プログラムを促進する遺伝子の発現を亢進させることが明らかになりました。クロマチン占有解析により、Tex10がWntシグナル伝達の負の調節因子であるPsmd3およびPsmd7のH3K4me3修飾を受けたプロモーター領域に結合し、それらの発現を活性化することでWntシグナル伝達を抑制することが明らかになりました。

まとめると、Tex10の欠損は、おそらくPsmd3/7などの負の調節因子の直接的な転写を抑制することで、Wntシグナル伝達が過剰活性化され、PGCLC形成の阻害と精子形成の欠損を引き起こします。Tex10調節不全はヒト不妊症患者と関連していることから、本研究は男性不妊症治療の潜在的な標的を提供します。

精子形成についての知識や精巣の解析についての知識を学ぶことができてとても勉強になりました。今回の論文では実験を行った背景や目的、結果に対する考察がいずれの実験についても明確に記載されており、その点においても非常に学びが多いと感じました。精巣/精子の観察や免疫染色、精子形成障害の発生段階の検討など今後精巣の解析を行う際に参考にしたいと思いました。

最近、変形性関節症（OA）の治療法にMatrix-Associated Autologous Chondrocyte Implantation（MACI）がFDAで承認されており、軟骨細胞の自家移植が治療に応用されています。しかし、高齢者の軟骨自家移植にはその増殖能が乏しいため、MACI治療の年齢制限が課題となっています。これまでにPrg4陽性軟骨前駆細胞は、生理的および病的条件において関節軟骨の維持に重要な細胞とされてきましたが、そのヘテロジェニティについてはよくわかっていませんでした。筆者らは、これまで造血系や椎間板髄核で幹細胞能を持つと知られていた、膜糖タンパク質のProtein C receptor (Procr)陽性細胞について、その関節軟骨における役割を検討しました。Procr陽性細胞は関節軟骨において、生後3週齢ほどで観察されており、レポーターマウスを用いたトレース実験では、Procr陽性細胞は関節の表層から深層へと移行し、関節軟骨を形成していることを明らかにしました。筆者らは、膝関節の大腿骨側は、脛骨や半月板と比較して、Procr陽性細胞が少ないことを発見し、各部位の機械刺激の違いが関連していることを考察しました。そこで、マウスのトレッドミルやProcr陽性細胞の単離によってProcr陽性細胞の機械刺激への影響を解析しました。運動したマウスではProcr陽性細胞数の増加が認められましたが、細胞増殖マーカーは陰性であったため、Procr自体の発現が機械刺激によって増加したことが示唆されました。実際、in vitroでのProcr陽性細胞の伸展培養では、Procr発現が増加していることが分かりました。Procr陽性細胞のOAに対する影響を調べるため、半月板機能不全術（DMM）によってOAを発症させ、さらにProcr陽性細胞のジフテリア毒素（DTA）を用いた除去によるOA病態の変化を観察しました。OAでは、Procr陽性細胞が増加しており、重要なことに、DTAによる細胞除去は、OA病態を悪化させることが示されました。よって、Procr陽性細胞がOAに応答して活性化し、OA病態の悪化を抑制していることが示唆されました。OAでどのようにProcr陽性細胞が活性化されているかを検討するためscRNA-seqをShamとDMMで比較しました。Shamでは表層細胞の数が増加しており、そのクラスターに属するProcr陽性細胞についてSCENICによるRegulon解析などを行うことで、Procr陽性表層細胞においてPiezo1が重要な機械刺激因子であることが示唆されました。Piezo1を薬理学的あるいは遺伝的に阻害または活性化することで、Procr陽性細胞数の変動を介してOA病態を調節できることを明らかにしました。次に、Procr陽性細胞の特性をさらに評価するため、細胞分取を実施できるような膜タンパク質を同定するためscRNA-seqを実施しました。Procr陽性表層細胞の幹細胞マーカーの発現をその他のProcr陽性非表層細胞クラスターと比較し、CD200, CD105を同定しました。同定した幹細胞は、Procr陰性幹細胞と比較し、コロニー形成能が高く、軟骨分化能も高いことが明らかとなりました。その細胞を用いてマウスの足関節欠損部位の修復を試みると、Procr陰性細胞と比較して、軟骨再生能が高いことが分かりました。ヒトについても検討するため、若年および高齢者由来のProcr陰性軟骨細胞を免疫不全マウスの軟骨欠損部位へと移植すると、軟骨再生能が高いことが明らかとなりました。興味深いことに、高齢者由来の細胞でも若年とほぼ同じレベルで軟骨を再生させることができました。以上よりProcr陽性軟骨前駆細胞は、関節軟骨の形成に重要であり、機械刺激に感受性を持った細胞であることと、再生医療に理想的な細胞および細胞マーカーであることを明らかにしました。

　論文紹介の発表者は、軟骨の機械刺激に興味があるため、本研究の実験手法やトランスクリプトームのデータは参考になりました。高齢者由来の細胞でも軟骨再生能が高いことを示したのは、インパクトがあると感じました。

フェロトーシスは、細胞膜リン脂質中の多価不飽和脂肪酸の過酸化によって細胞膜が破綻し誘導されます。フェロトーシスをがんの治療戦略として応用できるかについては、これまで十分に解明されていませんでした。そこで本研究では、フェロトーシス抑制因子であるGPX4およびFSP1の役割を解析しました。遺伝子改変マウスを用いた肺腺がんモデルにおいてGPX4またはFSP1を欠損させた結果、脂質過酸化の増加と腫瘍形成の顕著な抑制が観察され、肺腫瘍がフェロトーシスに極めて高い感受性を有することが示唆されました。これまでFSP1はin vitroではフェロトーシス防御に必須ではないと報告されていましたが、本研究によりin vivoでは必須であることが明らかになりました。さらに、FSP1阻害剤はフェロトーシスを促進し、腫瘍増殖を抑制したことから、FSP1を標的としたフェロトーシス誘導が有望ながん治療戦略となり得る可能性が示されました。

現在の抗がん剤はアポトーシス誘導を中心とした治療が多く、アポトーシス抵抗性を示すがんでは治療効果が限定されるという課題があります。本研究で示されたフェロトーシス誘導は、薬剤耐性がんに対する新たな治療戦略として有効である可能性があり、非常に意義のある研究だと感じました。

老化骨芽細胞のクリアランスは、骨の恒常性と健康に重大な影響を及ぼします。免疫系は老化の重要な制御因子ですが、老化骨芽細胞と免疫系の関係はほとんど不明でした。

本研究では、ヒト骨組織の空間解析により、骨粗鬆症患者では、特徴的な細胞集団であるCD4陽性の細胞障害性Tリンパ球（CD4+ CTL）の割合が顕著に減少するとともに、老化骨芽細胞と密接に関係することが示唆されました。そして、長寿遺伝子SIRT1が、このクロストークを介して、老化骨芽細胞のクリアランスおよび骨恒常性を制御していることが示唆されました。具体的には、SIRT1がEZH2のアセチル化を介してDAAM2の発現を上方制御し、ケモカインの分泌を促進することで、CD4+ CTLを活性化し、MHC-IIを高発現している老化骨芽細胞のアポトーシスを誘導する、というプロセスが示唆されました。さらに、自然老化により骨量が減少したマウスにCD4+ CTLを補充することで、老化骨芽細胞が減少し、骨量が増加しました。

これらの結果から、SIRT1が、骨芽細胞とCD4+ CTLのクロストークを制御することで、非細胞自律的機能を発揮することが示唆されました。また、DAAM2がSIRT1の重要な下流エフェクターとして機能したことから、DAAM2が骨粗鬆症の治療標的となり得る可能性が示唆されました。老化骨芽細胞を除去するために、骨芽細胞自身が、ケモカインの分泌を介してCD4+ CTLをリクルート・活性化させ、その結果、CD4+ CTLが老化骨芽細胞のアポトーシスを誘導する、というクロストークがなされていることが興味深かったです。また、CD4+ CTLの標的細胞としては、MHC-IIを発現する樹状細胞やマクロファージ、B細胞、腫瘍細胞などが知られていますが、今回、老化した骨芽細胞もMHC-IIを発現し、CD4+ CTLの標的となり得ることがわかりました。CD4+ CTLは、老化線維芽細胞も除去することが報告されており、本研究では、CD4+ CTLの補充が老化骨芽細胞を減少させ、骨量減少を改善しました。このことから、CD4+ CTLの適切な補充が、様々な老化細胞に対するセノリティクスとなる可能性も考えられ、今後の研究が期待されます。

本発表では、マクロファージにおける WDFY3 の機能に着目し、エフェロサイトーシスを介した炎症制御および自己免疫抑制機構について解析しました。エフェロサイトーシスは、アポトーシス細胞を速やかに除去することで炎症を終結させ、組織恒常性を維持する重要な仕組みです。先行研究のCRISPRスクリーニングにより、Wdfy3 がエフェロサイトーシスに必須の因子として同定されています。

Wdfy3 欠損マクロファージでは、アポトーシス細胞の認識および取り込みは正常に起こるものの、その後のファゴソーム成熟が障害されていました。特に、ファゴソーム周囲に F-actin が持続的に残存し、その結果、ファゴリソソーム形成が不完全となり、死細胞分解の遅延が引き起こされることが明らかとなりました。In vivo 解析では、Wdfy3 欠損マウスにおいて T 細胞活性化の亢進と自己免疫様表現型が観察されました。一方で、Wdfy3 を過剰発現させたマウスではエフェロサイトーシス効率が上昇し、炎症応答が速やかに終結しました。これにより、T 細胞活性化や自己免疫反応が抑制されることが示されました。

さらに、加齢マウスにおいて本来低下するエフェロサイトーシス能が、Wdfy3 過剰発現により回復することも確認されました。また腎臓では、慢性炎症の抑制を介して糸球体肥大が軽減され、組織構造の維持が認められました。

以上より、WDFY3 は自然免疫における死細胞処理と獲得免疫制御をつなぐ重要な分子であり、エフェロサイトーシス制御を介した自己免疫疾患や加齢関連炎症疾患に対する新たな治療戦略を示唆する因子であると考えられます。

自分の研究テーマに関わってるマクロファージの機能や免疫における役割ついてより深く勉強できてよかったです。体の中での免疫が起こる流れや免疫疾患の発症メカニズムについてもしっかり整理できて役に立ったと思います。

本研究では、FAタンパク質であるビンキュリンの発現が加齢性骨粗鬆症患者の骨細胞で著しく低下していることを示しています。骨細胞特異的にビンキュリンを欠損させた10-kb Dmp1-Creマウスでは、骨吸収に影響を与えずに骨芽細胞形成と機能が抑制され、荷重のかかる長骨や脊椎で顕著な骨量減少が生じました。

ビンキュリン欠損は機械的負荷に対する骨形成応答を阻害し、Mef2cの核移行を促進することでSost遺伝子発現とスクレロスチン産生を増加させました。一方、Sost欠損やMef2cノックダウンはこの骨量減少を回復させました。さらに、エストロゲンは骨細胞におけるビンキュリン発現を誘導し、閉経後骨粗鬆症との関連が示唆されました。

これらの結果から、ビンキュリンはFAシグナルを介してWnt/βカテニン経路を活性化し、骨形成を促進する重要な因子であることが明らかになっています。

骨形成を分子だけでなく、細胞の状態や環境との関係として捉える視点が印象的であり、骨芽細胞分化を理解するうえで新しい見方を与えてくれる論文だと思いました。骨細胞ができるまでのメカニズムを詳しく知ることができました。また、基本的な実験手法について学び直そうと感じました。

本研究は、出生前デキサメタゾン曝露（PDE）が子の長管骨発達を障害する分子・細胞基盤を、骨髄脂肪前駆細胞（Adiponectin陽性：Adipoq⁺細胞）に着目して解析したものです。これまで、PDEは出生後の骨成長遅延や骨量低下を引き起こすことが知られていましたが、その詳細な機序は十分に解明されていませんでした。

筆者らは、PDEマウスモデルにおいて、骨髄内で細胞老化が亢進し、特にType H血管の減少、骨芽細胞および骨前駆細胞の喪失が生じることを確認しました。さらに、PDEにより骨髄Adipoq⁺細胞数が著しく減少することを見出し、遺伝学的にAdipoq⁺細胞を除去すると、PDEと同様に細胞老化の増加、Type H血管の消失、骨形成低下が再現されることを示しました。

RNA-seq解析から、Adipoq⁺細胞が細胞外基質タンパク質Fibulin-5（Fbln5）の主要な供給源であること、そしてPDEによってFbln5発現が低下することが明らかとなりました。Fbln5は抗酸化酵素SOD3と協調して骨髄のROS恒常性を維持する因子であり、PDEではFbln5低下により骨髄内ROSが増加し、主に好中球で酸化ストレスが亢進します。

さらに、Adipoq⁺細胞特異的にAAVを用いてFbln5を過剰発現させると、ROS蓄積と細胞老化が抑制され、Type H血管および骨形成が回復し、PDEによる骨成長障害が有意に改善されました。

以上より、本研究は、骨髄脂肪前駆細胞がFbln5を介して骨髄の酸化還元恒常性を維持し、発生期の骨形成を保護する重要なニッチ構成要素であることを示しています。出生前グルココルチコイド曝露による骨発達障害に対し、Adipoq⁺細胞–Fbln5–ROS制御軸が新たな治療標的となり得ることを提案する、意義深い研究です。

妊婦へのグルココルチコイド投与が胎児に与える影響を研究する分野について何も知りませんでしたので、大変勉強になりました。また、論文内でAdipoq陽性細胞の欠失が骨に与える影響を検証しており、非常に興味深い内容でした。酸化ストレスという視点も私にとって新しく、自らの研究を進めるうえで参考になりました。

強度近視は、世界中で有病率が増加している失明に至る眼疾患です。近視の発症と進行の病因を明らかにしようとする研究は数多く行われていますが、眼球の中心的な屈折媒体である水晶体がどのように変化するのかについては、いまだ十分に理解されていません。

筆者らの研究では、MRIを用いて大規模サンプルにおける近視と正視の間でレンズの寸法を比較し、強度近視において水晶体の赤道径直径が増加し、前面が平坦化することを示すことで、この未解決の問題に形態学的に迫ることができました。

さらに、β/γ-クリスタリンをコードする遺伝子の発現増加が強度近視被験者の水晶体上皮で観察され、これは水晶体サイズと正の相関を示していました。加えて、2つの独立した強度近視モデルマウスの水晶体においても、レンズサイズの増大とβ/γ-クリスタリンの増加が確認されています。

さらなる探索により、強度近視におけるMAFの増加と、クリスタリンプロモーターへの直接的活性化、さらにTGF-β1-Smadシグナルを介した間接的活性化への関与が明らかになりました。

総合すると、筆者らの研究は、強度近視水晶体の病的成長におけるMAF-TGF-β1-クリスタリン軸の、これまで認識されていなかった役割を同定しています。

今回の論文では、水晶体上皮細胞におけるTGF-β1シグナルの亢進が与える影響について学ぶことができました。私は白内障やTGF-βシグナルが密接に関わる研究をしているため、とても有意義な論文であると感じています。

また、不死化された水晶体上皮細胞株ではクリスタリンの発現に問題があり、細胞実験はすべてマウスやヒトから採取した初代細胞で行った旨が記載されていました。この点は、私自身の今後の実験手法を検討するうえで大きな参考となりました。

RIPK4の欠損がバルツォカスパーパス症候群を引き起こすことが知られていますが、RIPK4が骨格の恒常性をどのように制御するかは未だに大部分がわかっていないことから、筆者らはこの研究においてRIPK4と骨格の関係性について調査を行いました。RIPK4の全身的な除去は骨粗鬆症を引き起こし、骨髄系に偏った造血を促進することを実証しました。また、骨系RIPK4は骨格形成や骨髄造血において重要な役割を担っていることについても明らかにしました。さらに、RIPK4はミトコンドリア融合タンパク質MFN2と相互作用することが明らかとなり、RIPK4はMFN2を介したミトコンドリアの輸送により骨髄造血を維持することも示しました。まとめると、今回の筆者らの研究は骨恒常性の維持におけるRIPK4の重要な役割を明らかにし、骨形成と骨髄造血制御におけるRIPK4-MFN2軸の評価されていない機構について解明しました。

RIPK4は骨形成に関与するだけでなく、骨髄造血も制御するという点が興味深いなと感じました。また、現在研究を行っている遺伝子がミトコンドリアに関与している遺伝子であるため、今回の論文から骨形成とミトコンドリアの関係性について学ぶことができ良い機会になったと感じました。加えて、参考になる実験手法などもあったため、自分自身の研究に活かしていきたいと思いました。

この研究では、N-アセチルトランスフェラーゼ 10 (NAT10) が、c-FosのmRNAをN4-アセチルシチジン (ac4C) 修飾することによって、安定性を維持し、破骨細胞形成を正に制御することが示されました。筆者らは、NAT10のac4C修飾を特異的に阻害するRemodelinを用いて、in vitroにおいて、破骨細胞分化や吸収能にもたらす影響を検証し、NAT10の阻害によって、これらが抑制されることが分かりました。このことから、NAT10が、ac4C修飾によって、破骨細胞の分化やその機能を正に制御することが分かりました。また、同様な結果が、shRNAによってNAT10をKDさせた細胞でも見られました。次に、筆者らは、より深くメカニズムを理解するため、NAT10を阻害した時の、MAPKシグナル経路とNF-κBシグナル経路における関連タンパク質の発現量の変化を調べました。その結果、前者のERK1/2やJNKでは変化が見られたのに対して、後者では変化が見られなかったことから、筆者らはMAPK/ERK1/2およびMAPK/JNKシグナル伝達経路を促進し、AP-1（c-Fos/c-Jun）転写を活性化するとの仮説を提示しました。最後に、二種類の炎症性骨減少のモデルマウスを用いて、in vivoでのNAT10の阻害の影響を調べました。その結果、NAT10の阻害により、破骨細胞形成およびその機能が抑制されていることが観測され、in vivoでもNAT10の機能が証明され、治療的効果の可能性を示しました。

mRNAの転写後翻訳や、破骨細胞形成との関連について学ぶ良い機会となりました。また、破骨細胞分化におけるシグナル経路についても、少し勉強することができました。加えて、RNA修飾の実験の手法についても学ぶことができました。

特徴的ながん遺伝子である MYC は腫瘍形成に重要な役割を果たし、多くのマウス腫瘍モデルの研究から主要な治療標的として注目されてきました。しかし、MYC は多数の結合パートナーと協調して機能するため、がん細胞の増殖や腫瘍維持において どの因子が特に重要なのかは明らかではありませんでした。

本研究では、著者らは培養 PDAC 細胞・線維芽細胞・マウス膵腫瘍を用いた包括的な遺伝子スクリーニングを行い、MYC の重要な協調因子として RUVBL1 と RUVBL2 を特定しました。KPC 細胞における RUVBL1 の枯渇は S 期での細胞周期停止を引き起こし、さらに免疫能を保持したマウスにおいては、いずれのタンパク質の枯渇も 急速な腫瘍退縮と免疫細胞浸潤の増加をもたらしました。

加えて、RUVBL1 の急性枯渇は MYC 高発現腫瘍に特徴的な遺伝子発現プログラムを抑制し、MYC の腫瘍促進作用が RUVBL1/2 に依存していることを示しました。

膵腫瘍では強い免疫抑制性の腫瘍微小環境が形成され、多くの患者は PD-1 / CTLA-4 チェックポイント阻害などの免疫療法の恩恵を受けられていません。本研究では、著者らは一部の同所移植マウスにおいて RUVBL1/2 阻害薬を用いた一時的な RUVBL1 枯渇と PD-1 チェックポイント阻害を併用し、単剤治療よりも有意な生存期間延長を示しました。

以上の結果から、著者らは MYC–RUVBL1 軸を標的とする治療により、膵腫瘍を免疫療法に対して感受性化できる可能性を提唱しています。本研究は、免疫抑制性の強い膵がんに対して、新たな薬理学的治療戦略の可能性を示すものです。

膵臓がんのような免疫抑制性の強い腫瘍において、免疫チェックポイント阻害薬が効果を発揮する可能性が示された点が非常に興味深いと感じました。もし特異的な免疫療法が幅広い腫瘍に有効となれば、臨床的にも大きな意義があると思います。

理解が難しい実験手法や読み取りの難しい Figure もありましたが、この研究を通じて学ぶべき点が多くありました。

アルツハイマー病やそれに関連するタウオパチーは、微小管関連タンパク質タウのミスフォールディングと凝集を特徴としています。こうしたミスフォールドに起因する病原性において、種々のシャペロンの機能が重要な役割を担っていることが分かっております。また、タウのリン酸化が蓄積し、凝集の頻度が上昇することによって、アルツハイマー病やそれに関連したタウオパチーが引き起こされることが確認されています。そのため、内在性のシャペロンがどのようにタウのリン酸化状態およびミスフォールドを調節するのかを理解することで、今後の治療を支援する可能性があると考えられます。本研究において、筆者らはプロリン異性化酵素の一つであるFKBP12（12-kDa FK506 binding protein）と単量体タウタンパク質の関係について解析を行いました。

まず、アルツハイマー病モデルマウスP301S PS19において、FKBP12の発現が減少すること、及びFKBP12発現の変化が神経変性と関連することを示しました。さらに、タウの凝集に伴ってFKBP12の局在が軸索小丘から細胞体および樹状突起へと変化することも明らかにしました。さらに、FKBP12の発現量が神経細胞におけるアポトーシスと負に相関することも示されました。次に、NMRを用いた構造生物学的な手法により、FKBP12とタウの相互作用がタウにおけるプロリンリッチ領域ではなくIVYKを持つ特異的なモチーフにおいて生じること、このような相互作用はモチーフ内のチロシンがリン酸化されることで阻害されることを示しました。加えて、AlphaFold2を用いた構造予測により、FKBP12とタウがIVYKモチーフにおいて相互作用する可能性があることを裏付けました。これらのことから、筆者らはFKBP12が非リン酸化タウを特異的に認識することで、病原性の発現に重要なリン酸化を阻害する可能性を示唆しております。また、in vitro凝集実験によりFKBP12がタウの凝集を阻害し、可溶性タウを増加させ凝集タウを減少させること、および凝集タウの伸長を阻害することを示しました。最後に、筆者らはiPS細胞を用いたオルガノイドモデルであるAstTau Systemを用いて、脳オルガノイドにおけるFKBP12過剰発現がタウ凝集に及ぼす影響について検討しました。結果として、FKBP12過剰発現は脳オルガノイドにおいてもタウの凝集を阻害するとともに、変性ニューロンの数を減少させることが確認されました。筆者らが示した神経や神経原繊維変化におけるFKBP12とタウの共局在や相互作用、神経保護に関する今回のデータおよび先行研究の結果は、タウの病原性の制御においてFKBP12が重要な役割を担うことを示唆しています。  

感想

最初はFKBPと基質の相互作用に関する構造的な理解を深める目的で読み始めた論文でしたが、プロリン異性化酵素であるFKBP12がプロリン残基のない構造を認識するということはとても興味深かったです。また、FKBPが種々のシグナル伝達においてリン酸化状態と関連している報告もいくつか見たことがあるので、今回の論文においてタウの非リン酸化状態を認識することでリン酸化をブロックする可能性があるという考察は、FKBPのこれ以外の機能においても関連し得ると思います。神経についてはほとんど勉強したことのない分野だったので、神経に関連した知識や手法についても非常に勉強となり、面白い論文でした。

この研究では、N-アセチルトランスフェラーゼ 10 (NAT10) が、c-FosのmRNAをN4-アセチルシチジン (ac4C) 修飾することによって、安定性を維持し、破骨細胞形成を正に制御することが示されました。筆者らは、NAT10のac4C修飾を特異的に阻害するRemodelinを用いて、in vitroにおいて、破骨細胞分化や吸収能にもたらす影響を検証し、NAT10の阻害によって、これらが抑制されることが分かりました。このことから、NAT10が、ac4C修飾によって、破骨細胞の分化やその機能を正に制御することが分かりました。また、同様な結果が、shRNAによってNAT10をKDさせた細胞でも見られました。次に、筆者らは、より深くメカニズムを理解するため、NAT10を阻害した時の、MAPKシグナル経路とNF-κBシグナル経路における関連タンパク質の発現量の変化を調べました。その結果、前者のERK1/2やJNKでは変化が見られたのに対して、後者では変化が見られなかったことから、筆者らはMAPK/ERK1/2およびMAPK/JNKシグナル伝達経路を促進し、AP-1（c-Fos/c-Jun）転写を活性化するとの仮説を提示しました。最後に、二種類の炎症性骨減少のモデルマウスを用いて、in vivoでのNAT10の阻害の影響を調べました。その結果、NAT10の阻害により、破骨細胞形成およびその機能が抑制されていることが観測され、in vivoでもNAT10の機能が証明され、治療的効果の可能性を示しました。

mRNAの転写後翻訳や、破骨細胞形成との関連について学ぶ良い機会となりました。また、破骨細胞分化におけるシグナル経路についても、少し勉強することができました。加えて、RNA修飾の実験の手法についても学ぶことができました。

グルカゴン様ペプチド-1（GLP-1）、グルコース依存性インスリン分泌刺激ポリペプチド（GIP）、およびグルカゴン（GCG）の各受容体を標的とする単一分子ペプチドは、マウスとヒトの両方で血糖管理を改善することが示されています。しかし、これらのペプチドによって媒介される下流のシグナル伝達イベントの正体は、まだ解明されていませんでした。本研究では、GLP-1/GIP/GCG受容体に対する検証済みのトリアゴニスト(IUB447）が、マウス膵島においてインスリン分泌を刺激するメカニズムを評価することを目的としました。

このトリアゴニストは、野生型マウス膵島において、従来の単一作動薬の併用投与よりも高程度にグルコース刺激インスリン分泌（GSIS）を促進しました。また本研究では、トリアゴニストIUB447 のインスリン分泌促進作用は、主としてGLP-1 受容体（GLP-1R）への直接的な結合により、Gαqシグナル伝達および TRPM5活性の双方が増強されることによって生じることが明らかになりました。筆者らの研究は、マウス膵島ではトリアゴニストのインスリン分泌促進作用の主要な媒介因子がGLP-1R であることを示しているが、ヒト膵島では受容体の関与様式が異なる可能性があります。また先行研究よりティルゼパチドなど他のマルチアゴニストでは種差が報告されていることから、ヒトにおけるGLP-1R および Gαq–TRPM5シグナル軸の関与を確認するためには、ヒト膵島を用いたさらなる研究が必要になると考えられます。

糖尿病治療薬について、GLP-1作動薬は知っていたが、GLP-1のシグナル伝達が糖尿病患者においてGαではなく、Gq優位になることは知らず興味深かった。またトリアゴニストという存在も初めて知り、チルゼパチドなど他のデュアルアゴニストよりも高い血糖改善効果を示すことが明らかになった一方で、デュアルアゴニストの副作用に加えて、グルカゴンが作用する関係で、血圧・心拍数の上昇といった新たな副作用も考えられるため、実際の臨床応用のハードルは高いのではないかと考えました。(フェーズ２あるいは3にあるトリアゴニストがいくつか存在するようです。

中耳真珠腫は、鼓膜の上皮から形成される嚢胞が骨溶解を伴って拡大する難病です。本研究はヒト中耳真珠腫サンプルを用いてscRNA-seqを実施し、骨破壊に寄与する線維芽細胞サブタイプを同定しました。この線維芽細胞は炎症性サイトカインに応答してactivin Aを産生し、これがRANKLと協調して破骨細胞形成を促進することが分かりました。また、activin Aのアンタゴニストであるfollistatinは、中耳真珠腫において破骨細胞形成と骨侵食を抑制しました。これらの結果は、ヒト中耳真珠腫に特有のactivin A産生線維芽細胞が、局所的な破骨細胞形成を誘導し、これが骨侵食を誘導することを示唆しました。これにより、activin Aとその産生を誘発する炎症性サイトカインが中耳真珠腫の治療標的となる可能性を提示しています。

　真珠腫中耳炎は治療法が外科的手術に限られる難病ですが、本研究は分子経路からアプローチする新たな根本的治療法を提示する研究内容でした。本研究で同定された線維芽細胞サブセットは他の炎症性骨破壊疾患にも共通する可能性があり、破骨細胞や免疫細胞以外の組織による骨破壊への関与がさらに解明されることが期待されます。炎症性骨破壊疾患の発症機序解明について線維芽細胞に着目した視点を得ることができました。

軟骨は、生体の骨格を維持するために重要な組織であり、イカやカブトガニなどの無脊椎動物においても軟骨様組織が見られます。哺乳類を含む脊椎動物において、頭蓋顔面を形成する軟骨は、中胚葉または神経堤細胞由来です。筆者らは以前、毛包研究において耳の毛包再生が不良であることを報告しました。それと同時に耳軟骨においてLipid ghost artifactを発見しました。耳軟骨に存在する脂肪を含む軟骨（脂肪軟骨細胞）は、1850年にFranz von Leydigによって発見されています。特徴的な細胞を発見したにもかかわらず、これまで脂肪軟骨細胞に関する研究は全くありません。本研究では、脂肪軟骨細胞の起源や生体内分布、従来の軟骨や脂肪細胞との違いをマルチオミクス解析によって明らかにし、その特徴的な細胞外基質と脂肪代謝を示しました。さらに、ヒトを含むいくつかの哺乳類において脂肪軟骨細胞の存在を示しましたが、鳥類や両生類などの他の脊椎動物においては観察されないといった進化学的な脂肪軟骨細胞の重要性も示しました。

　軟骨組織のOilRedO染色では、脂肪に富んだ特徴的な脂肪軟骨細胞が、鼻軟骨や咽頭軟骨、胸骨の剣状突起において観察されました。頭蓋顔面の軟骨形成に重要な神経堤細胞を標識するWnt1-Cre2を用いた細胞系譜解析を実施すると、Wnt1陽性かつCol2a1、OilRedO陽性の脂肪軟骨細胞を耳において観察しました。耳に存在する脂肪細胞はWnt1陰性であり、脂肪軟骨細胞のほうがサイズが小さいこと、力学的特性に関しては脂肪軟骨細胞のほうが硬度が高く丈夫であることを示しました。次に、メタボロミクスやプロテオミクス、トラスクリプトミクスを用いた脂肪軟骨細胞と脂肪細胞または軟骨細胞との違いを解析しました。脂肪軟骨細胞には、脂肪細胞とは異なる脂肪酸の構成を示しており、従来の脂肪細胞とは異なる脂肪合成経路が示唆されました。さらに、軟骨細胞に特徴的なCol2a1が脂肪細胞に比較して豊富であり、従来の軟骨では見られないような特徴的なECMとしてのCol8a1の増加などを示しました。トラスクリプトミクスにおいては、主成分分析を用いて、脂肪細胞・軟骨細胞との全く異なる細胞の特徴を持つことを示しました。また、脂肪軟骨細胞において脂肪酸トランスポーターのCd36, Slc27a1のレベルが低い一方で、グルコーストランスポーターのSlc2a1, Scl2a4の発現が見られたことから、脂肪軟骨細胞のグルコースを用いた脂肪酸合成(de novo lipogenesis)が主な脂肪滴形成の機序であることが示唆されました。実際に、高脂肪食およびin vitro脂肪軟骨細胞への高グルコース処理実験を実施することで、脂肪軟骨細胞の脂肪合成について検討しました。高脂肪食では、白色脂肪組織の増大を認めましたが、脂肪軟骨細胞に富んだ耳のサイズに有意な変化は見られませんでした。脂肪軟骨細胞へのグルコース処理では、脂肪軟骨細胞の増大を示しており、de novo lipogenesisを阻害する阻害剤（ACC阻害剤など）をマウスに処理することによって、耳サイズの低下を示しました。

　次に、脂肪軟骨細胞の発生について検討するため、胚や生後早期のマウスを用いて脂肪軟骨細胞を示しました。マウス胚では、鼻軟骨における脂肪軟骨細胞を確認しましたが、耳では見られませんでした。生後10日マウスでは、OilRedO陽性の脂肪軟骨細胞が観察され始めました。タイムポイントを取って観察およびRNA-seq解析を実施した結果、増殖、分化移行、初期分化、後期分化の４つの時期に応じて、シグナル因子や細胞外基質などの変化が示されました。

　ヒトにおける脂肪軟骨細胞について検討するため、ヒト胎児における脂肪軟骨細胞も示しました。さらに、ヒトES細胞株のオルガノイド培養によって、脂肪軟骨を形成させることができており、それらのRNA-seqの結果は、マウスの脂肪軟骨細胞と同様な特徴を示しました。最後に、ヒト以外の哺乳類および哺乳類以外の脊椎動物に関して、脂肪軟骨細胞を観察し、その進化学的な重要性について検討しました。多くの哺乳類動物において脂肪軟骨細胞が観察されており、興味深いことにコウモリの耳については、波だった特徴的な構造を示しており、超音波を用いるコウモリにとって脂肪軟骨細胞がその構造を維持するために重要であることが示唆されました。また、鳥類や両生類における軟骨組織を観察したところ、OilRedOは陰性であり、脂肪軟骨細胞が哺乳類の特徴的な細胞であることが示されました。

　軟骨は再生医療で用いられますが、移植時に未分化細胞があるとテラトーマを形成することが知られています。そこで筆者らは、脂肪軟骨細胞の脂肪滴は、標識が容易であり、このことは細胞分取によって再生医療における未分化細胞の除去に寄与することが考察され、脂肪軟骨細胞の医療応用を提案しました。本研究は、マルチオミクスを用いて新しいタイプの軟骨に関する多角的な知見を提供し、脂肪軟骨細胞の生体内分布や発生の様子、さらに進化学的な知見も与える研究でした。

　昔発見された特徴的な細胞を現代の科学で再度研究することで、他分野に波及するような知見を提供することができた論文であり、まさに温故知新な内容でした。骨代謝、特に軟骨に従事する者として、新しい軟骨に関する知見は興味深かったです。また、進化学や分類学もこれを機に勉強し、その分野への興味も湧きました。

腫瘍細胞間の複雑なコミュニケーションネットワークの解明は膵管腺がん（PDAC）における細胞運命決定と腫瘍進行の理解に重要です。本研究では、SPP1（オステオポンチン）が間葉系PDAC細胞運命の主要な調節因子であることを同定しました。PDAC患者ではSPP1の発現が進行期で著しく上昇していました。さらに、マウスPDACモデルにおいてSpp1を不活性化すると、腫瘍形成の遅延と転移形成の消失が認められました。

Spp1は上皮性PDAC細胞で発現しており、Spp1によって上皮間葉転換（EMT）が誘導されることが示唆されました。機構的には、Spp1が間葉系PDAC細胞上のCD61受容体に結合し、Bmp2およびGrem1の発現を誘導しました。また、上皮細胞におけるSpp1発現にはGrem1によるBMPシグナルの阻害が必要であり、これにより細胞間調節ループが形成されました。以上より、間葉系および上皮性PDAC細胞の運命は、GREM1とSPP1の相互パラクリン調節によって制御されることが明らかになりました。

腫瘍内の多様な細胞が相互作用しながらがんの進行や形質を決定するという、がんの複雑性と動的な制御機構の重要性を改めて実感しました。今後はこのような細胞間ネットワークを標的とする新たな治療戦略の開発が期待されます。

RIPK4の欠損がバルツォカス・パーパス症候群を引き起こすことが知られていますが、RIPK4が骨格の恒常性をどのように制御するかは未だに大部分がわかっていないことから、筆者らはこの研究においてRIPK4と骨格の関係性について調査を行いました。RIPK4の全身的な除去は骨粗鬆症を引き起こし、骨髄系に偏った造血を促進することを実証しました。また、骨系RIPK4は骨格形成や骨髄造血において重要な役割を担っていることについても明らかにしました。さらに、RIPK4はミトコンドリア融合タンパク質MFN2と相互作用することが明らかとなり、RIPK4はMFN2を介したミトコンドリアの輸送により骨髄造血を維持することも示しました。まとめると、今回の筆者らの研究は骨恒常性の維持におけるRIPK4の重要な役割を明らかにし、骨形成と骨髄造血制御におけるRIPK4-MFN2軸の評価されていない機構について解明しました。

RIPK4は骨形成に関与するだけでなく、骨髄造血も制御するという点が興味深いなと感じました。また、現在研究を行っている遺伝子がミトコンドリアに関与している遺伝子であるため、今回の論文から骨形成とミトコンドリアの関係性について学ぶことができ良い機会になったと感じました。加えて、参考になる実験手法などもあったため、自分自身の研究に活かしていきたいと思いました。

脂肪組織マクロファージ（ATM）は、脂肪組織で最も豊富に存在する免疫細胞の一つであり、発達やリモデリング、代謝適応などに寄与します。これまで多様なATMサブセットが明らかになってきましたが、これらサブセットと、脂肪組織の恒常性維持や疾患との関係はほとんど不明でした。

本研究では、トランスクリプトーム解析及びプロテオーム解析から3つのマクロファージ集団が同定され、これらは発生起源や組織内での局在が異なることが明らかとなりました。これらのATMは、局在の違いから隔壁ATM（sATM）、被膜ATM、及び実質ATMに分類されました。特に、CD209やLYVE1、TIM4を高発現するsATMの選択的な枯渇は、BATの褐色化とWATのベージュ化を促進して熱産生を向上させ、HFD誘導性の肥満から保護しました。また、sATMは、CD26陽性の脂肪細胞幹細胞（ASC）と近接しており、リガンド受容体相互作用モデリング解析から、sATM由来のTGFβ1がASCに発現するTGFβR1/2に作用する可能性が示唆されました。実際、LYVE1又はTIM4特異的なTgfb1欠損マウスでは、sATM枯渇による表現型が再現されました。最後に、ヒトにおいても、LYVE1陽性ATMが、隔壁でCD26陽性ヒトASCと近接していることが示唆されました。

これらの結果から、sATMがTGFβ1シグナルを介してASCの運命を誘導し、白色脂肪細胞の形成を促進することが明らかとなりました。本研究は、マクロファージと幹細胞により形成される隔壁内のニッチが、白色脂肪細胞の分化、さらには全身の代謝まで制御することを示唆しています。組織内での局在が異なるATM集団では、遺伝子発現だけでなくその由来や機能まで異なる点が非常に興味深く、なぜsATMが他のATM集団とは異なる特有の由来や機能を持つのか疑問に感じました。以前、肝臓の門脈近傍のマクロファージが過剰な炎症を防ぐ、という論文を紹介しましたが、その他の組織においても、局在の違いによりマクロファージの機能が異なる可能性が考えられ、さらなる研究が期待されます。

結腸直腸癌 (CRC)は世界で3番目に多い癌であり、発症率と死亡率共に、今後数十年で増加することが予想されています。CRCは化学療法や放射線療法に耐性を持つことが課題となっており、分子メカニズムを解明し、その開始、進行、および転移を支配する分子チェックポイントを特定することが求められています。

著者らは、RING型E3ユビキチンリガーゼとして機能するTRIM24がCRCにおいて高発現しており、AURKB (AURORA kinase B)によりS1042がリン酸化されることにより、核から細胞質への分布が促進されることを明らかにしました。細胞質へ分布したTRIM24はVHLとの相互作用及びユビキチン化を介してAKTの活性化を促進することでWnt/β-カテニンシグナル伝達を活性化します。

著者らの研究は、TRIM24 が VHL-AKT-GSK3β 軸を介した β-カテニン分解を制御する極めて重要なタンパク質であり、Wnt/β-カテニンシグナル伝達を活性化し、CRC 細胞の増殖を促進することを示しています。これらの発見は、CRC の病原性メカニズムと、特に腫瘍細胞に細胞質 TRIM24 が分布している患者に対する CRC 治療の潜在的な治療戦略についての洞察を提供するものです。

タンパク質間の相互作用の検討方法や、シグナルの活性化の指標について勉強になりました。AURKBが臨床応用される可能性に期待したいです。

本論文は、2025年度ノーベル生理学・医学賞を受賞した坂口志文教授の研究チームによるもので、体の免疫システムを調整する「制御性T細胞（Treg細胞）」という特別な細胞に関する研究です。Treg細胞は、自己免疫疾患（自分の免疫が自分自身を攻撃してしまう病気）の治療に役立つ可能性があるため、Treg細胞をより効果的に活用する方法が求められています。

本研究では、ヒト初代T細胞を用いたゲノムワイドCRISPRスクリーニングとPerturb-icCITE-seqにより、FOXP3発現の新規制御因子としてRBPJ遺伝子を同定しました。RBPJノックアウトはNotchシグナル非依存的にiTreg細胞の分化・機能を増強し、FOXP3エンハンサーCNS2の脱メチル化を促進することでFOXP3発現の安定性を高めました。RBPJはHDAC3を介してFOXP3のヒストンアセチル化を直接制御し、移植片対宿主病モデルにおいてRBPJノックアウトiTreg細胞は高い抑制効果を示しました。これらの結果から、RBPJ-NCOR複合体はFOXP3発現を制御する新たな分子機構であり、RBPJを標的としたiTreg細胞の機能制御は自己免疫疾患に対する養子細胞免疫療法の効率向上に繋がる可能性が示唆されました。

ゲノムワイドCRISPRスクリーニングは従来から知られた方法ですが、今回、核内タンパク質であるFOXP3陽性細胞を集めて行う、新たなトランスクリプトミクスとゲノミクスが何種類も開発されていることに感服しました。ゲノムワイドCRISPRスクリーニングとPerturb-icCITE-seqを組み合わせることで、FOXP3発現の制御機構を網羅的に解析している点が素晴らしいと感じました。single-cell resolutionでの解析により、従来のバルク解析では見過ごされがちな細胞集団の多様性や、遺伝子ノックアウトによる微細な変化を捉えることが可能になったと考えられます。RBPJノックアウトiTreg細胞がGvHDモデルにおいて高い抑制効果を示したことは、自己免疫疾患に対する養子細胞免疫療法への応用可能性を示唆するものであり、今後の臨床研究の進展が楽しみです。

肥満、閉経、加齢など、骨の劣化を伴う多様な病態生理学的条件下では、BMAdsの過剰な蓄積が頻繁に観察され、骨微小環境に有害な影響を及ぼす可能性があります。研究グループは、脂肪細胞特異的に転写因子ESRRA（Estrogen-related receptor α）を欠損させたマウスを用い、肥満やエストロゲン欠乏による骨量減少モデルで解析を行いました。その結果、ESRRA欠損マウスでは骨髄内の脂肪蓄積が抑制され、骨形成および骨内の血管（特にType H血管）の形成が促進されました。機構的には、ESRRAがE2/ESR1シグナルを阻害し、骨形成を促す分泌因子SPP1（osteopontin）の転写を抑制する一方、脂肪細胞ホルモンであるレプチンの発現を促進することが判明しました。したがって、ESRRA欠損によりSPP1が増加し、レプチンが減少することで、骨髄間葉系幹細胞の分化バランスが脂肪系から骨芽系へとシフトすると言えます。この変化は血管新生を伴いながら骨形成を回復させることが示されました。さらに、ESRRA阻害剤C29の投与によっても骨量の減少が防がれることが確認され、ESRRAを標的とする治療が肥満や閉経後骨粗鬆症など、脂肪細胞の蓄積を伴う骨疾患に対して有効な戦略となる可能性が示唆されました。

感想

骨髄脂肪と骨代謝の連関に着目する自らの研究において、どのような実験を行うべきか行き詰っていましたが、培養上清を用いる方法などが非常に参考になりました。また、血管新生が骨形成に影響を与えることを知らなかったので、その点でも興味深い内容でした。

強度近視は複雑な眼疾患であり、さまざまな眼併存疾患と関連して失明につながる可能性があります。特に、強度近視における最も一般的な合併症である白内障は、早期発症や典型的な核硬化症を示し、急速な進行や予後不良を伴うことが多く、重大な懸念事項です。本研究では、筆者らが強度近視患者の水晶体線維配列がARCや健常な水晶体と比べて高度に偏極し、圧縮された特性を示すことを発見しています。また、筆者らはTGF-β1により水晶体におけるm6Aレベルが大幅に上昇し、これがHMC（高度混濁水晶体）の重症度と正に相関することを見出しています。これは、DVL2 mRNAのm6A修飾が促進され、m6AリーダーであるIGF2BP3を介してそのmRNAが安定化されるMETTL3の上昇を伴って生じます。m6A修飾型DVL2はその後PCP/p-JNK経路を促進し、細胞増殖、遊走、極性形成の亢進とHMC様の水晶体線維の形成へとつながります。まとめると、筆者らの研究は強度近視患者のPCP経路を介した核白内障形成の促進における、TGF-β1誘導性m6A修飾のこれまで十分に理解されていなかった役割を明らかにしています。

私の研究テーマにおける重要なタンパク質であるCTDNEP1は、機能を失うとTGF-βシグナルが増強されることが知られています。そのため、TGF-βシグナルの亢進が核白内障につながるという本論文の内容は、私が研究を進めるうえで非常に参考になりました。また、眼疾患の研究においてどのような実験計画を組むべきかについて私はかなり苦慮していたため、本論文は今後の私の研究に大いに役立つと感じました。

骨粗鬆症およびそれに関連する骨欠損の治療は、いろんな副作用や投与間隔など医療従事者にとって大きな課題となってきました。その問題を克服するために本研究ではまず、骨粗鬆症と診断された被験者から得られた検体を用いて包括的な解析を実施した結果、パイロトーシスに関連する炎症性微小環境（IME）が骨の恒常性を破城させる中心的な役割を果たしていることを明らかにしました。これらの結果に基づき、パイロトーシスの阻害と水素による炎症抑制を利用したMg・ゼラチン複合マイクロスフェア(GelMa/Mg/DMF MSs）を開発し、このMSを移植することで、 水素ガス（H₂）、Mg²⁺、およびDMF（ジメチルフマル酸）の持続的放出を実現しました。DMFは、NLRP3/CASP1/GSDMDシグナル経路を阻害し、骨芽細胞のパイロトーシスを防止する作用を有し、さらに、水素の抗酸化作用と相まって、炎症整備症環境を再構築し、骨の恒常性を回復するために有利な条件を整えます。本研究の結果、 GelMa/Mg/DMF MSsはin vivoおよびin vitroの両方で炎症性微小環境を効果的に改善し、顕著な組織修復をもたらすことが示されました。

初期の結果として、このマイクロスフェアは多孔質構造を通じてpHや炎症性微小環境（IME）の変化に応答し、内部のマグネシウム粒子は水素ガスを発生させて強力な抗炎症効果を示し、これがDMFと相乗的に作用してマクロファージを抗炎症性のM2型へと誘導することが確認できました。また、GelMa/Mg/DMF MSsはGSDMDを標的としてそのN末端断片（N-GSDMD）の細胞膜穿孔活性を阻害し、骨芽細胞のパイロトーシスを抑制し、さらにパイロトーシスを起こした骨芽細胞によって活性化される破骨細胞のp-ERK/AP1経路も抑制することがわかりました。これらの結果により、GelMa/Mg/DMF MSsはパイロトーシスに起因する炎症性微小環境（IME）の悪循環を断ち切ることによって局所的な骨欠損を修復し、骨粗鬆症の病態進行を抑制することを踏まえ、有望な治療対策として活躍できると考えられます。

感想

今回の論文を勉強しながら、まず生体内での炎症反応のメカニズムについてより理解を深めることができました。そしてBMSCのパイロトーシスによるBMDMへの影響とそこに関わっているいろんな経路の流れも新たにわかることができ、ROS調整によるマクロファージ環境のリモデリングのメカニズムについても深く勉強ができたと思います。また今回紹介されたGelMa/Mg/DMFの骨粗鬆症においての製剤的なメリットがわかり、そしてまだ見つけられてない副作用や投与間隔の工夫などの限界点についても考察することができたと思います。

骨リモデリングは、骨吸収と骨形成が協調して起こり、骨芽細胞（OB）と破骨細胞（OC）の相互作用によって維持されます。しかし、骨形成期がどのように終息し、骨吸収期へ転換するのかといった仕組みは不明でした。本研究では、OB間コミュニケーションを担う新たな因子として、骨芽細胞由来小胞を同定しました。生体内イメージング観察により、成熟骨芽細胞が直径約0.25-1㎛の小胞を放出し、隣接するOBに取り込ませる様子を可視化しました。OB培養液から分離した小胞（SOV: small osteoblast vesicles）を他のOBに加えると、骨形成関連遺伝子（Runx2, Alp, Col1a1など）の発現が抑制され、RANKL/OPG比が上昇してOC分化が促進されました。さらに、SOV内にはmiR-143が高濃度で含まれ、これがCbfbを標的としてRunx2活性を阻害することで骨形成を負に制御することが明らかになりました。SOVをマウス骨内に投与すると、局所的な骨吸収促進と骨形成抑制が誘導され、in vivoでも同様のスイッチ効果を確認しました。以上から、成熟骨芽細胞は自身が放出する小胞を介して、他の骨芽細胞の分化状態とRANKL発現を制御し、骨形成から骨吸収への転換を誘導することが示されました。本研究では、骨芽細胞が単なる骨形成細胞ではなく、リモデリング全体を調整することを明らかにしました。さらに、骨量異常疾患における新たな治療標的として、SOVおよびmiR-143経路の可能性を提示しました。

感想

骨形成と骨吸収の間にある過程を見ている点についてとても興味深いと感じました．本研究で用いられている手技である生体内イメージングは生体内そのものを撮影しているため実際の働きを観察できる点が理解しやすく，リアルであるなと思いました．また、miRNAの細胞間伝達も面白いなと感じました。

骨芽細胞や生体内イメージングに関する同じ著者の論文が複数あったので他のも読んでみようと思います．

長寿命形質細胞は骨髄の特殊な微小環境に生存しています。しかし、形質細胞の生存を維持するための微小環境やシグナルの全容は未解明です。本研究では骨髄形質細胞がリガンド依存性プリン作動性イオンチャネルP2RX4を用い、骨芽細胞からパンネキシン3（PANX3）を介して放出される細胞外ATPを感知することで小胞体依存性アポトーシスを回避していることを示しました。Panx3欠損とB細胞系でのP2RX4欠損は血清抗体価の減少と骨髄形質細胞の枯渇を引き起こしました。また、PANX3欠損骨芽細胞は細胞外ATPの分泌量が少なく、in vitroで形質細胞の維持に失敗しました。P2RX4欠損形質細胞はATPを処理しても生存を維持することができませんでした。また、P2RX4特異的阻害剤５-BDBDはin vitroで細胞外ATPによる骨髄形質細胞の生存維持効果を抑制し、in vivoで骨髄形質細細胞を枯渇させました。また、5-BDBDは全身性エリテマトーデスモデルマウスの抗dsDNA抗体価と腎疾患を改善しました。P2RX4はカルシウムを通す陽イオンチャネルであり、カルシウムは小胞体機能に重要であることから、細胞外ATP/P2RX4シグナルが小胞体の恒常性維持に重要である可能性を考え、検討しました。その結果、P2RX4阻害は小胞体ストレス関連因子の1つであるATF4の蓄積を引き起こしました。また、ATF4の標的であるアポトーシス促進因子CHOPの欠損は、5-BDBDによる形質細胞枯渇を防止しました。よって、P2RX4阻害は小胞体ストレス応答を引き起こし、骨髄形質細胞のCHOP依存性アポトーシスを開始することがわかりました。まとめると、本研究で、形質細胞がP2RX4を介して骨芽細胞によるPANX3依存性ATP放出を感知することで、小胞体依存性アポトーシスを回避していることが明らかにされました。 

感想

骨芽細胞に形質細胞の生存を維持する役割があるという点が興味深いと思いました。また、初めて骨髄独自の形質細胞生存ニッチの特徴を明らかにした研究であり、「短命の形質細胞がいる一方で、なぜ骨髄の形質細胞は長期間生存できるのか」という疑問に答える画期的な論文だと感じました。

細胞内エネルギー（ATP）と還元当量（NADPH, NADH等）の不足は、体内の多くの病理学的プロセスに関与する重要な要因です。ATPは細胞内の生物学的プロセスにおける「エネルギー通貨」として機能し、NADPHの還元型は同化作用に還元力を提供する重要な電子供与体です。病的条件下では、同化作用の障害を是正し、不足しているATPおよびNADPHを最適濃度まで増加させることは困難です。本研究では、ナノチラコイドユニット（NTU）をベースとした、制御可能なナノサイズの植物由来光合成システムを開発しました。具体的には、ホウレンソウの葉からチラコイド（葉緑体膜）を単離し、超音波処理や押し出し処理により、細かく分散させサイズを揃えナノ粒子に加工し、NTUを得ました。また、プロテオミクス解析によってNTUにおけるタンパク質を網羅的に調査すると、NTUは光合成に必要なすべてのタンパク質成分を保持していることも示されました。

さらに、軟骨細胞への導入を可能にするため、特定の成熟細胞膜（軟骨細胞膜（CM））をNTUに包み、CM-NTUを作製しました。軟骨細胞への効率的な導入を確認するために、CM-NTUと他の膜でコーティングされたNTUを軟骨細胞と共に培養したところ、CM-NTUが最も高い割合で取り込むことが示されました。

また、これらのCM-NTUが膜融合を介して軟骨細胞に侵入し、リソソームによる分解を回避し、迅速な浸透を達成することを実証しました。

さらに、CM-NTUは光照射後に細胞内ATPおよびNADPH濃度を上昇させ、in vitroにおいて炎症刺激を受けた軟骨細胞におけるエネルギー代謝の不均衡を改善することも明らかになりました。またin vivoにおいてマウスの変形性関節症に対する CM-NTU 治療効果も調査したところ、CM-NTUと光の照射により軟骨恒常性を促進し、変形性関節症の進行を予防できることを実証しました。したがって、この変性疾患に対する治療戦略は、主要なエネルギーおよび代謝キャリアを独立して軟骨細胞に供給することで細胞同化作用を制御的に促進できる天然の光合成システムに基づいています。さらに様々な成熟哺乳類細胞由来のコーティングを用いることで、様々な変性疾患に対して用途に応じた効果を提供できます。

感想

エネルギー代謝の制御因子を操作するのではなく、光合成のシステムそのものを導入するという新しく大胆なアプローチが非常に興味深かったです。人間もいつか光合成をする未来が来るかもしれないと思い、ワクワクしました。

従来、骨髄は長骨などで主に研究されてきましたが、本研究は頭蓋骨に存在する骨髄が独自の役割を果たすことを示しました。まず、頭蓋骨骨髄は若齢期から老齢期にかけて持続的に拡大し、血管網や造血幹・前駆細胞、間質細胞を増加させることが確認されました。これは、加齢に伴い造血幹細胞の機能低下や脂肪化が進む長骨骨髄とは対照的でした。また、妊娠、tMCAOモデル、CMLモデル、PTH投与といった生理的・病理的刺激に対して、頭蓋骨骨髄は著しい血管拡張と造血細胞の増加を示し、高い動的可塑性を有することが明らかになりました。さらに、頭蓋骨骨髄の造血幹・前駆細胞は、加齢に伴い、血管新生の主要な調節因子であるVEGFA発現が増加し、このVEGFA–VEGFR2シグナル経路が血管拡張と骨髄増殖を駆動していることが示されました。加齢に伴い炎症や脂肪細胞蓄積が進む長骨骨髄とは異なり、頭蓋骨骨髄はこれらの老化関連変化に対して耐性を持ち、末梢血への造血細胞供給を持続的に拡大する能力を保持していました。さらに、マウスの頭蓋骨骨髄を保護すると、若齢および老齢期において、放射線照射後の生存が可能であることから、老齢期においても機能的な造血リザーバーとして重要な役割を果たすことが示唆されました。ヒトにおいてもCT解析により、加齢に伴う頭蓋骨骨髄の拡大が確認されており、マウスで得られた知見が臨床的にも関連する可能性があります。以上から、頭蓋骨骨髄は拡大性・可塑性・老化耐性を備えた特異的な造血の場であり、造血障害や加齢関連疾患に対する新たな治療標的となり得ることが示唆されました。

本論文では、頭蓋骨骨髄と長管骨骨髄間の造血機能におけるギャップについて学ぶことができ、非常に興味深かったです。特に、頭蓋骨骨髄では、長管骨で見られる加齢による脂肪化やHSCの分化偏向に強い耐性を持つ点が非常に興味深かったです。

米国の人口の約40％、世界では6人に1人が肥満であり、その発生率は世界的に急増しています。炭水化物、脂質、さらに最近ではアミノ酸の制限を含む、さまざまな食事介入が、この流行に対抗するために探究されてきました。筆者らは個々のアミノ酸を除去することがマウスの体重プロファイルに与える影響を調査しました。筆者らは、条件付きシステイン制限は必須アミノ酸制限と比較して最も大幅な体重減少をもたらし、それが1週間で30%に達し、標準食に戻すことで体重が容易に回復したことを示しました。 これは、システイン欠乏誘導体重減少が、明らかに有害な影響を与えることなく、高い可逆性を示すことを強調しています。筆者らは、システイン欠乏が統合ストレス応答および酸化ストレス応答を活性化し、それらが互いに増幅し合って GDF15 と FGF21 の誘導を引き起こし、そのことが部分的に表現型を説明することを見出しました。注目すべきことに、筆者らは極めて安定であると考えられてきた組織中の補酵素A （CoA）のレベルの低下を観察し、その結果ミトコンドリアの機能低下と代謝のリプログラミングが生じました。これにより、エネルギー効率の悪い嫌気的解糖と不完全なトリカルボン酸回路が生じ、ピルビン酸、オロト酸、クエン酸、α-ケトグルタル酸、窒素に富む化合物、およびアミノ酸の持続的な尿中排泄が起こります。また、ミトコンドリア活性の低下により、熱産生のために細胞質における無駄なクレアチンサイクルを必要とさせていることを示しました。要約すると、本研究は、システイン制限がGSHとCoAを枯渇させることで、他のアミノ酸制限と比較して体重減少、代謝、およびストレスシグナル経路に最も強い影響を及ぼすことを明らかにしました。これらの知見は、さまざまな代謝性疾患や増大する肥満危機に対処するための戦略を提案しています。

どのようなメカニズムで体重減少が引き起こされるのか、その仕組みを知ることができて勉強になりました。システイン欠乏がCoA枯渇につながり、それ自体が代謝に大きな変化をもたらすというのがとても面白いと感じました。また、これまで読んだ論文は遺伝子に着目したものが多く、アミノ酸に着目している点も新鮮で面白かったです。

運動は骨の健康に不可欠であり、腸内細菌叢は骨代謝を調節する重要因子ですが、その関与メカニズムは未だ明確ではありませんでした。本研究では、卵巣摘出（OVX）および高齢マウスモデルにおいて抗生物質投与で腸内細菌を枯渇させたうえで、運動群由来の糞便微生物移植（FMT）を施し、腸内環境が運動による骨保護に不可欠であることを明示しました。具体的には、16S rRNA遺伝子シーケンシングとLC‑MSによるアンターゲットメタボローム解析を用いて、運動型FMTが受容体マウスにおいて腸内微生物叢と代謝プロファイルを再構築し、タウリンとウルソデオキシコール酸（UDCA）のような胆汁酸代謝物の濃縮が骨量の保持に寄与することが明らかになりました。さらに、トランスクリプトーム解析とRNA干渉実験により、FMTがアペリンシグナル経路を活性化し、MSC（間葉系幹細胞）において骨芽分化を促進し脂肪分化を抑制することで、骨‐脂肪バランスを回復させる分子メカニズムが示されました。本研究は、「運動→腸内微生物変化→代謝物産生→アペリン経路活性化→MSCの運命制御→骨量増加」という腸内–代謝–シグナル経路の連関が、運動由来の骨保護効果を支えていることを示唆しており、FMTや胆汁酸代謝物を活用した新規な骨粗鬆症治療・予防戦略の開発につながる重要な知見であると言えます。

運動によって腸内細菌の組成が変化し、その腸内細菌を経口投与することで、運動をしていないマウスにも運動したマウスと同様の生理的変化が見られるという点が非常に興味深いと感じました。もしこの効果がヒトにも応用可能であれば、運動をしていない人でも、運動によって得られる腸内環境の恩恵を受けられる可能性があります。つまり、運動によって形成された腸内細菌を活用することで、努力の成果を“共有”するような新しい製剤の開発につながるかもしれないという発想がとても面白いと思いました。

骨芽細胞におけるIL-11は機械的負荷によって転写が促進され、骨形成に影響を与えることが知られていましたが、IL-11 が骨芽細胞分化と骨形成を生体内でどのように制御しているのかについては不明でした。

そこで筆者らはIL-11 遺伝子を全身的に欠損させたマウスを作製しました。

全身性IL-11 KOマウスでは、予想通り、Wnt シグナルと骨量の減少、骨形成の抑制が認められましたが、驚くべきことに、全身性の白色脂肪組織（WAT）の増加と耐糖能異常も引き起こしました。

続いて、骨芽細胞および骨細胞由来のIL-11を欠損させたマウスおよび脂肪細胞由来のIL-11を欠損させたマウスを作製し、前述の表現型が、骨芽細胞及び骨細胞由来のIL-11欠損によって引き起こされることをつきとめました。

これによって、骨芽細胞および骨細胞由来の IL-11 が骨格だけでなく脂肪組織の量にも関与するという、生理学的に重要な役割を明らかにしました。

 運動への応答として、骨を介して脂肪組織の分解が進む可能性が示されたことが非常に面白いと感じました。また、IL-11 KOでの表現型も興味深い内容だった上、この論文紹介を通して脂肪組織およびその染色手法等についての勉強にもなりました。

小胞体（ER）ストレスは、プロテインキナーゼRNA様小胞体キナーゼ（PERK）の活性化に起因したシグナルを介して細胞全体におけるタンパク質合成の抑制を誘引することが広く知られています。

しかしながら、ERにおける部分的なストレスが如何にして広範囲の翻訳抑制を引き起こすのか理解する試みは、小器官レベルでの翻訳量を定量することの難しさから研究が限定されてきました。

本研究で筆者らは、mRNA翻訳レポーターを用いるSunTagPP7システムを利用して、オルガネラごとの翻訳頻度の違いについて調査を行いました。結果として、ERストレス下でミトコンドリアにおける翻訳活性が顕著に保護されていることを予想だにせず発見しました。

更に、この機構の分子メカニズムについて調査し、ERストレスにおける翻訳阻害を担うPERKと相互作用し得るタンパク質としてミトコンドリアタンパク質ATPアーゼファミリーAAAドメイン含有タンパク質3A（ATAD3A）を同定しました。また、ATAD3AはPERKの標的であるeukaryotic initiation factor 2（eIF2）との結合を競合阻害することで、ミトコンドリアでの位置特異的な翻訳制御を仲介すると示しました。

PERK-ATAD3A間の相互作用はERストレスによって上昇し、ミトコンドリア-ER接着サイトを形成しました。さらに、ATAD3Aの結合によってPERKの本来のシグナルは減衰しました。

最後に、筆者らはプロテオミクス解析を行い、ATAD3AをsiRNAによってノックダウンすることで、ERストレス時にも発現が維持されていた複数のミトコンドリアタンパク質の発現が低下することを示しました。これによって、レポーターに限らず、ATAD3Aはいくつかのミトコンドリアタンパク質について、ERストレス時にその翻訳制御に寄与していることが示唆されました。

これらのことから、 PERK-ATAD3A間の相互作用は細胞小器官レベルで翻訳抑制を制御し、細胞におけるERストレスの影響を回避できるとわかりました。

ERストレスによる影響がミトコンドリアで選択的に阻害されるという点は、面白いと感じました。また、SunTagPP7という手法は全く知りませんでしたが、オルガネラ特異的なタンパク質の翻訳頻度を調べることができるという点と、それを可能とするように考えられた機構が非常に興味深かったです。それ以外の部分でも、様々な手法を使って研究を進めていたので、研究メソッドについてとても勉強になりましたし、ERストレスに関連することで、自分の研究にも応用できそうな点が多かったです。

Trim21はオートファジー制御、先天的な免疫反応、そして細胞分化において多様な役割を果たしているにも関わらず、骨格疾患におけるこれらの役割は大部分がわかっていません。筆者らは以前骨肉腫の骨芽細胞分化制御においてTrim21が重要な役割を果たすことを示しましたが、骨粗鬆症を含む骨格変性疾患にどのように寄与しているかはいまだわかっていないままでした。本研究では、Trim21欠損がBMSCsの骨発生分化の促進と骨芽細胞活性の向上により骨形成を促進し、BMSCsとBMMsのカップリングによって破骨細胞の形成が抑制することが示されました。ここから、Trim21が骨形成の促進と骨吸収の抑制をおこなう点で骨粗鬆症治療の新しい二重標的型アプローチとして使用できる可能性を示しました。

骨粗鬆症の治療は不完全なものが多く、ロモソズマブのような二重標的型治療の数は少ないです。そのような現状の中で、Trim21は骨形成の促進と骨吸収の抑制の両方の働きをもつ珍しいタンパク質であり、とても興味深く感じました。

GSDMDが炎症性細胞死パイロトーシスに働くことが知られていますが、近年、細胞恒常性維持にも関わる機能も報告されています。本研究では、筋肉の組織再生にガスダーミン（GSDMD)が重要な機能を持つことを明らかにしました。筋損傷後の修復過程において、GSDMDは活性化マクロファージ中でオリゴマーとなり、脂肪酸代謝物である11, 12-EETの分泌経路を形成します。11,12-EETは線維芽細胞成長因子（FGF）の液液相分離を調節することで、FGF経路を増幅させ、これによりMuSC細胞の活性化と増幅を促進させました。また、11,12-EETは筋肉の老化関連修復障害の改善、角膜・皮膚損傷後の組織再生促進効果を持つことを特定しました。本研究は、マクロファージと筋幹細胞のクロストークがGSDMD依存性分泌代謝物を介して組織修復を支配することを示唆し、組織再生に対する治療効果を提示します。

本論文は損傷後のGSDMD機能について、炎症応答ではなく組織修復に関与するという新たな機能を提示した興味深い内容でした。GSDMD遺伝子変異とゴーハム病発症に関して、外的炎症や慢性炎症後の組織修復にGSDMD機能が関与する可能性を考えると、GSDMD機能不全により修復障害が起こる可能性などが考えられ、発症機序解明に近づくヒントとなります。

　YAPの細胞内局在はYAP活性および腫瘍形成において重要です。いくつかの腫瘍においてYAPは、がん幹細胞マーカーとしても知られているSOX9と共発現していることが知られており、SOX9とYAPはお互いの活性を増加させるように働くことが報告されてきましたが、SOX9がYAPの細胞内局在を制御するかは知られていませんでした。本研究では、肝臓がんでSOX9がYAPの核内移行を制御する詳細な分子基盤を示し、YAPにおいて翻訳後修飾のアルギニン非対称ジメチル化が、SOX9-YAP間相互作用を増強させることを示しました。さらに、YAPアルギニン非対称ジメチル化は、様々ながん患者において予後不良を示しており、新規のバイオマーカー及び治療標的となることを示されました。最後に、明らかにされたSOX9-YAP間相互作用を競合的に阻害できるペプチドを作成し、それの肝臓がん治療効果が示されました。

　まず、肝臓がん細胞のSOX9を欠損させ、RNA-seq解析を実施すると、SOX9欠損において、YAP標的遺伝子の上昇を確認しました。Hippoシグナルに着目し、LATSやYAPのリン酸化を確認すると、リン酸化への影響はほとんどなく、Hippo経路とは非依存的な制御がなされていることが示唆されました。そこで、免疫沈降を行うとSOX9とYAPの相互作用が確認されました。SOX9の欠損または過剰発現によって、YAPの核内移行を制御していることが示されました。相互作用についてさらに詳しく解析するため、SOX9の変異を導入し、免疫沈降によってSOX9のHMGドメイン、その中でも特にN末端側核局在シグナル(nNLS)が含まれているSOX9 がYAPとの相互作用に重要であることを明らかにしました。さらに、YAPとSOX9の相互作用に重要と同定されたドメインを利用したドッキングシミュレーションによって、YAP-SOX9間の重要な水素結合が示されました。特に、SOX9 (Asp-125)とYAP (Arg-124)が相互作用に必要でした。

　さらに筆者らは、YAPの質量分析を実施し、Arg-124における非対称ジメチル化(R124me2a)を同定しました。このR124me2aは、肝臓がんで増加することが知られていたメチルトランスフェラーゼPRMT1のノックダウンで減少することを明らかにしました。SOX9との相互作用の観点では、R124me2aの増加は、SOX9とYAP相互作用を強固にすることが示されました。興味深いことに、YAPのR124me2aは、様々ながん患者の予後不良と関連しており、YAP R124me2aが新規のバイオマーカーおよび治療標的となることが示唆されました。

　最後に、同定されたSOX9-YAP間相互作用を模倣する合成ペプチドを利用して、競合的にSOX9-YAP相互作用を阻害することで、がん治療への応用を検討されました。細胞内透過ペプチドとSOX9のnNLSを持つペプチド(Pep-S-A1)、nNLSに含まれたAsp-125を変異させたペプチド(Pep-D125A)を用いて、マウスがんXenograftモデルにおける治療効果を評価すると、Pep-D125A処理では治療効果は見られない一方で、Pep-S-A1処理では、対照と比較して腫瘍形成を抑制していました。以上のことをまとめると、本研究では、がんの進行に重要なYAP-SOX9相互作用を同定し、新規のがんバイオマーカーのYAP R124me2aを示しました。さらに、YAP-SOX9相互作用を阻害する合成ペプチドが有望な治療戦略となることが示唆されました。

　自分が興味を持っている転写因子のSOX9とYAPの相互作用を示された論文でした。SOX9の転写因子としての働きではなく、タンパク質の核移行を担っていることは興味深いと思いました。新規のバイオマーカーおよび新規のがん治療戦略となり得るペプチド医薬を示されており、CNSではないもののインパクトのある論文だと思いました。

骨粗鬆症は骨密度低下により骨折リスクが高まる疾患です。本研究では韓国人女性を対象に解析を行い、UBAP2遺伝子のSNPが骨粗鬆症と関連する可能性が示されました。ゼブラフィッシュでもUBAP2を抑制すると骨形成異常が確認され、骨代謝マーカーとも相関が見られました。UBAP2は骨リモデリングに関与する新たなリスク遺伝子候補と考えられます。 

今回Ubap2に関する論文を読み，骨代謝に関する知見を深めることができました．また，Ubap2の制御メカニズムについても理解することができました．

TGF-βスーパーファミリーのサイトカインは、R-SMAD転写因子を介して細胞運命を制御し、胚発生から成体の恒常性維持まで多岐にわたる生物学的プロセスに関与します。これらのリガンド刺激によりR-SMADは細胞質でリン酸化され、SMAD4と複合体を形成して核内に移行し、標的遺伝子の発現を制御します。

本研究では、TGF-βスーパーファミリーのシグナルを負に制御する新たなメカニズムとして、R-SMADの脱リン酸化による不活化に注目しました。特に、内核膜に局在する足場タンパク質MAN1と脱リン酸化酵素複合体CTDNEP1-NEP1R1が、R-SMADの脱リン酸化に関与することを明らかにしました。MAN1はR-SMADおよびNEP1R1に独立して結合し、NEP1R1を介してCTDNEP1をR-SMADに近接させることで、核内でのR-SMADの脱リン酸化と不活化を促進します。

この複合体の破綻（CTDNEP1やNEP1R1の欠損）は、TGF-βリガンドが存在しない条件でもR-SMADのリン酸化状態が維持され、異常な転写活性が持続する原因となります。

またCTDNEP1やMAN1の欠損は、多臓器におけるSMADシグナルの異常活性化や特定疾患（骨疾患、髄芽腫）と関連していることが明らかとなり、CTDNEP1-NEP1R1複合体が細胞内で広範な調節機能を有することが示唆されました。

CTDNEP1-NEP1R1複合体がMAN1を介して核内でR-SMADの脱リン酸化を担うという知見は、CTDNEP1の新たな機能を示すものであり、非常に興味深く感じました。本研究は、私自身のCTDNEP1に関する研究においても今後シグナル制御との関係性を深めていく上で大変参考になりました。

まとめ

この研究では、転写因子SREBP2が破骨細胞の分化と骨吸収を負に制御することが示されました。SREBP2はIRF7を促進し、IRF7はISGs（IFN誘導性遺伝子群）やLy6a（リンパ球活性化タンパク質）などを通じて破骨細胞の過剰形成を抑制します。SREBP2を欠損したマウスでは破骨細胞活性が亢進し、炎症性骨破壊が増強されました。この経路はコレステロール代謝とは独立しており、新たな骨疾患治療の標的となる可能性があります。

感想

破骨細胞の分化の負の調節機構について、あまり知識がなかったので、勉強になりました。また、SREBP2の働きを阻害する実験において、阻害する時期が異なると、破骨細胞形成の促進・抑制が変わるのが、興味深く感じました。

変形性関節症（OA）は、世界中で5億9500万人以上が罹患している局所性関節疾患ですが、未だ疾患修飾薬は存在しません。最近の研究では、腸内細菌叢の乱れや微生物代謝物がOAに関連することが報告されていますが、その詳細は不明でした。

本研究では、ターゲットメタボローム解析により、OA患者ではglycoursodeoxycholic acid (GUDCA) の減少を伴って胆汁酸代謝が変化していることが明らかになりました。GUDCAは、farnesoid X receptor (FXR) のアンタゴニストとして腸管幹細胞の増殖を促進し、L細胞からのGLP-1分泌を促すことで、OAの症状を緩和させることが示唆されました。また、FDA承認薬のGLP-1R作動薬の関節内注射はOAの症状を改善しました。さらに、メタゲノム解析から、OA患者ではClostridium bolteae (C. bolteae) の相対存在量が低下しており、マウスへのC. bolteae投与はGUDCAの前駆体であるursodeoxycholic acid (UDCA) の濃度上昇を伴って、OAの進行を抑制しました。最後に、FDA承認薬のUDCA投与は変形性関節症の進行を緩和しました。また、コホート研究から、UDCAの服用によりOA関連関節置換のリスクが低下することが示唆されました。

OAは、機械的な過負荷だけでなく、慢性の代謝性炎症や脂質代謝の変化が寄与することが報告されてきています。本研究では、OAにおけるGLP-1を介した腸管関節軸が明らかになり、この経路がOAの治療標的となる可能性が示唆されました。また、本研究では、FDA承認薬のGLP-1作動薬やUDCAなどがOAの症状を緩和させたことから、これらのOAに対する臨床応用の可能性も期待されます。一方、関節に到達したGLP-1がOAの進行を緩和するメカニズムについては、さらなる研究が必要です。また、今回、OAにおける腸管関節軸が明らかになったことから、関節リウマチなど他の関節疾患における腸管関節軸についても興味深いと感じました。

本研究では、関節リウマチ（RA）に対する新しい注射治療法が提案されています。酵素活性を持つナノザイムであるDAGQD@Cu@KGNに、潤滑性を付与するSO3–HAと、軟骨への接着性を高めるDA-HAを組み合わせたハイドロゲルを使用しています。このハイドロゲルは、初期および後期のRAモデル動物の関節腔に注射することで自己ゲル化し、関節内にとどまって治療効果を発揮します。

具体的には、SO3–HAによる関節内での潤滑性、DA-HAによる軟骨表面への接着性、そしてKGN（カルトゲニン）による間葉系幹細胞（BMSCs）の動員と軟骨細胞への分化誘導が示されました。これにより、メトトレキサートによる骨髄抑制や肺障害のリスクを低減し、ヒアルロン酸の注射回数も大幅に減らすことができると考えられます。

ただし、DAGQD@Cu@KGNにおけるCuやDAGQDの生体内での分解や代謝に関しては、今後さらなる研究が必要です。

感想

これまでのRA治療では薬物療法が中心でしたが、本研究を通じて注射製剤による治療メカニズムについても理解を深めることができ、大変興味深く感じました。今回のハイドロゲル注射は、変形性関節症など他の関節疾患にも応用可能だと考えられ、今後のin vivoでの投与結果にも大きな期待が持てます。

ヒト胚の骨・関節形成における細胞分化のメカニズムを解明するため、受胎後5～11週のヒト胚の関節と頭蓋を対象に、33万個以上の細胞核のマルチオミクス解析（遺伝子発現とエピジェネティクス）と空間トランスクリプトミクスを実施しました。

この研究で以下のことが明らかになりました。

• 骨と軟骨の前駆細胞の発生軌跡と、膜内骨化と軟骨内骨化を制御する遺伝子ネットワーク

• 骨・関節形成中の前駆細胞の空間的な配置（ゾーニング）のメカニズム

• Schwann細胞からの軟骨細胞への新たな発生経路の可能性

• 変形性関節症に関連する細胞種特異的な遺伝子ネットワーク

• 頭蓋縫合早期癒合症の原因遺伝子の影響と潜在的な疾患メカニズム

これらの知見は、ヒト骨格発生における細胞運命決定の理解を深め、骨・関節疾患の治療法開発に貢献する可能性があります。

感想

今回の中絶胎児を用いた解析は、複数の最新解析技術を駆使し、献体を最大限に活用したという印象を受けました。特に、遺伝子発現情報と空間情報を組み合わせ、高解像度で空間情報を推測する新しいバイオインフォマティクスの手法が考案された点は画期的です。また、Multiplex in situ sequencingなどの最新の解析技術や数学的なデータの解析手法を勉強することができました。生物学で、これほど数学や統計が使われるようになるとは想像もしていませんでした。さらに、ヒト疾患に関連する一塩基多型とヒト発生を結びつけることで、疾患メカニズムへの新たな光を当てています。例えば、膝の変形性関節症では軟骨関連遺伝子、股関節の変形性関節症では骨形成関連遺伝子との関連が見出されたことは、今後の治療戦略に繋がる可能性を示唆しています。データサイエンスの進歩によって、医学生物学の解析手法は驚くほど精密（かつ高価）になり、ヒト発生現象の解明を通じて、ヒト特有の生命現象の発見や疾患治療への新たな道が開かれるかもしれません。当日、朝７時に来て、準備してましたが、これまで読んだ論文の中で最も難解でした😂

骨リモデリングは破骨細胞による骨吸収と骨芽細胞による骨形成によりバランスを取ることで骨組織の頑強性を保つとされています。破骨細胞と骨芽細胞はともに骨リモデリングにおいて重要な役割を担っていますが、共通の因子がこれら2つの細胞の分化に関与しているという報告は少なかったため、この論文ではFam102aという骨リモデリング因子が破骨細胞と骨芽細胞の分化を制御すること可能性を示しました。また、膵臓の腺細胞で高発現しNotchシグナルを介した自己増殖を行うことで知られているRbpjlとFam102aの複合体であるFam102a-Rbpjl軸が転写因子の核内移行を促進し、骨芽細胞分化において必要不可欠な転写因子であること、Fam102a欠損、Rbpjlの機能的な変異は骨芽細胞の骨形成減少に伴った骨減少を導くことなどからRbpjlが骨芽細胞分化の制御により骨恒常性に寄与しているかどうか、骨芽細胞において自己増殖能を持っているかどうかなどを論証することによって、Fam102a-Rbpjl軸が骨芽細胞において重要な役割を担っていることについても解明しました。

感想

今回の論文の中で行われていた実験において用いられた実験手法などをしっかりと理解し、今後の研究に活かしていきたいと感じました。

運動がマウスの骨の健康に良い影響を及ぼすメカニズムを解明するため、老齢マウスにランニング生活をさせた結果、ランニングによって骨芽細胞および破骨細胞の減少が改善し、加齢による骨量減少が回復しました。加齢によりBMATが増加することが知られていますが、ランニング生活をしたマウスでは老化脂肪細胞が減少しました。すなわち、運動がBMAdsの老化を緩和し、骨の老化を遅らせることが示唆されました。

骨の老化に関与する重要な制御因子を解明するため、筆者らは最近行った若齢および老齢雄ラットの骨髄上清のLC-MS/MSデータを分析した結果、細胞増殖、アポトーシス、細胞周期の制御に必須の役割を果たし、骨組織と骨髄に高発現のPCLAFに着目しました。PCLAFはBMAdsの老化の変化傾向と一致して、加齢とともに増加し、運動によって減少しました。

またscRNA-seqの結果より、PCLAFは特に老齢ラットの骨髄マクロファージ (BMM) で高発現でした。RAW264.7細胞の濃縮培養液にPCLAFタンパク質発現が確認されたことから、PCLAFはBMMに由来する分泌因子であることが示唆されました。PCLAFを骨髄内投与したマウスでは、コントロールと比較してBMAdsの老化が促進し、骨量が減少しました。またPCLAFを処理したBMAdsを皮下投与したマウスでは、老化骨芽細胞および老化破骨細胞が多く観察されました。すなわちPCLAFを介したBMAdsの老化が骨量を減少させることが示唆されました。

in vivoにおけるPCLAFの役割をさらに検証するために、骨髄球特異的PCLAF CKOマウスを作製し、3,9,15ヶ月齢マウスの骨のµCTをおこなった結果、3ヶ月齢マウスの骨量は同程度でしたが、9ヶ月齢と15ヶ月齢マウスにおいて、コントロールマウスと比較して、CKOマウスは加齢に伴う骨量減少の遅延を示しました。また15ヶ月齢のCKOマウスでは老化BMAdsが減少したことから、BMMにおけるPclaf欠損がBMAdsの老化を阻害し、骨の老化を遅らせることが示唆されました。

PCLAFと運動によって緩和される骨の老化との関連をさらに調べるため、老化に伴うBMMにおけるPCLAFの蓄積を模倣したPclaf過剰発現モデルをin vivoで樹立し、ランニング生活をさせた結果、ランニングによってPCLAF過剰発現による骨量減少およびBMAdsの老化が緩和しました。したがって運動がPCLAFの分泌を阻害し、それによってBMAdsの老化と骨の老化を遅らせることが示唆されました。

BMAdsにおけるPCLAFの潜在的受容体を同定するために質量分析を行った結果、接着クラスGタンパク質共役型受容体（ADGRL2）が同定されました。ADGRL2ノックダウンしたBMAdsではPCLAFを処理しても老化BMAds数が増加しなかったことから、ADGRL2がPCLAFの受容体として機能し、脂肪細胞の老化を促進するPCLAFの作用を仲介していることが示唆されました。PCLAFが骨代謝に影響を及ぼすメカニズムをさらに解明するため、rPCLAFまたはPBSで処理したBMAdsのRNA-seq解析を行った結果、PCLAFはADGRL2と結合し、AKT-mTORシグナル伝達を阻害して骨の老化を誘導していることが示唆されました。

骨髄におけるBMAds老化およびBMAds老化を介した二次老化に対するPCLAFの直接的効果をさらに検証するために、Adgrl2欠損マウス由来のBMAdsにrPCLAFを処理し、レシピエントマウスに移植した結果、rPCLAF-Scramble-BMAdsマウスは、PBS-Scramble-BMAdsマウスと比較して骨量減少および老化骨芽細胞・破骨細胞の増加が認められましたが、rPCLAF-ShAdgrl2-BMAdsでは認められなかったことから、ADGRL2がPCLAFの骨ホメオスタシスに対する効果を媒介することが示唆されました。

PCLAFの中和抗体 (PCLAF-NAb) 投与は18ヶ月齢マウスの骨量を増加させましたが、3ヶ月齢のマウスでは増加しなかったことから、PCLAF-NAbの治療効果はPCLAFの加齢依存的な蓄積のためであることが示唆されました。またPCLAF-Nab投与は老齢マウスの骨リモデリングを改善し、老齢マウスBMAdsを減少させたことから、PCLAF-Nabは加齢に伴う骨粗鬆症の治療法の可能性があることが明らかになりました。

本論文では、骨髄マクロファージ由来の分泌因子が低回転型骨粗鬆症を引き起こすことが書かれていました。３ヶ月齢マウスではコントロールマウスとPclaf CKOマウス間に変化が見られなかったことから、私が用いているLysM-Creマウスも3ヶ月齢ではなくもう少し後に解析をすることも視野に入れようと考えました。

機能喪失型変異は、Foxp3+制御性T細胞（Treg）の免疫調節作用に関する重大な知見を与えてきました。対照的に、Tregの機能や分化の側面を増幅させる欠陥の結果については、ほとんどわかっていません。機能獲得型(GoF)変異の作用機序を調べるため、オルソログ遺伝子変異を持つマウスを作製しました。本研究では、IkbkbのGoF変異をヘテロ接合体で有するマウスが乾癬の組織学的特徴をもつ皮膚病を発症することを示しました。遺伝子量を2倍にすると（ IkbkbGoF/ GoF ）、乾癬性関節炎の特徴である指炎、脊椎炎、特徴的な爪の変化が生じました。IkbkbGoFマウスは、Foxp3+CD25+Tregの選択的増殖を示し、そのうちのサブセットはIL-17を発現します。これらの改変されたTregは、炎症を起こした組織、血液、脾臓の両方に濃縮されており、その移動は従来のT細胞を使わずに疾患を誘導するのに十分です。これらの所見は逆説的に見えますが、さらなる解析の結果、これらのTregを移植すると炎症が誘導されることが明らかになりました。単離されたTregの単一細胞転写解析および表現型解析により、Th17関連遺伝子、Helios、CD103やCD69を含む組織常在マーカーを発現し、 NF-κBの顕著な転写プロファイルを示す非リンパ組織　（組織常在）Tregの増殖が明らかになりました。したがって、IKK2は組織常在性Tregの分化を調節し、過剰な活性は用量依存性の皮膚および全身性炎症を引き起こします。今回の発見は、NLTのサブセットが、過剰なNF-κB活性によってエフェクター様機能へと誘導され、その恒常性維持作用を狂わせて病態を引き起こす可能性があることを明らかにしました。

感想

炎症や免疫に関わる実験方法について学ぶことができました。現在調べているマウスでも、尾や手先の腫れなど同様の表現型が見られないか観察したいと考えています。また、組織常在性のTregサブセットについて、組織ごとに性質が異なる点が非常に興味深かったです。さらに、Tregが対応するエフェクター細胞の転写プログラムの一部を利用しているという点も面白いと思いました。

OTU domain-containing ubiquitin aldehyde-binding proteins Otubain1 (OTUB1)は脱ユビキチン化酵素のOUTドメインファミリーのメンバーです。これまでの研究で、がんやDNA損傷応答、神経変性疾患、腎臓疾患、肺線維症におけるOTUB1の役割が指摘されてきましたが、骨の恒常性におけるOTUB1の生理的役割や分子メカニズムは依然として不明でした。本研究では、OTUB1がFGFR2タンパク質の安定化を介して骨芽細胞分化と石灰化を促進することで、骨の恒常性維持に重要な役割を果たしていることを明らかにしました。OTUB1の全身KOマウスでは骨芽細胞分化と石灰化が低下しており、E18.5で体長の減少と著しい骨形成遅延を示しました。骨芽細胞特異的Otub1欠損マウスは骨形成の減少による骨量減少を示しました。OTUB1が骨形成を制御するメカニズムとして、骨芽細胞においてOTUB1はE3リガーゼのSmurf1とE2のUbcH5cの相互作用を阻害することでSmurf1によるFGFR2のユビキチン化を阻害し、それによってFGFR2のリソソーム分解を阻害していることが示唆されました。骨芽細胞特異的Otub1欠損マウス骨量減少はAAV9-FGFR2投与によって回復しました。また、AAV9-OTUB1の投与は、卵巣摘出術による閉経後骨粗鬆症マウスモデルの骨量減少を緩和しました。まとめると、本研究は、OTUB1が骨形成の正の制御因子であることを明らかにし、骨芽細胞特異的なOTUB1の標的化が骨粗鬆症の治療戦略となり得ることを示唆しています。

感想

骨芽細胞における基質が分かっていない酵素について、相互作用するタンパク質や骨形成を制御する分子メカニズムまで詳しく解明しており、自身の研究にも非常に参考になる論文でした。この論文を参考に、骨での骨芽細胞マーカーの免疫染色や、骨芽細胞におけるCtdnep1相互作用タンパク質の同定も行っていきたいと思います。

間葉系幹細胞（MSC）の骨芽細胞分化は、骨粗鬆症や骨再生などの骨関連疾患の病態や治療に極めて重要な役割を果たしています。WWドメイン含有コイルドコイルアダプター（WAC）タンパク質は、主に転写制御やオートファジーと関連しているが、間葉系幹細胞の骨形成への関与は不明なままです。今回、骨粗鬆症患者と骨粗鬆症モデルマウスの両方において、WACのレベルが低下していることが明らかになりました。WACは、in vitroおよびin vivoの両方において、MSCの骨形成を促進し、新生骨形成を促進する上で極めて重要な役割を果たしています。

具体的には、in vivoにおいてPrx1-Cre; WACfl/flマウスでは骨量減少と骨欠損修復障害が見られました。特に、骨を標的としたrAAV9を介したWACおよびPINK1の過剰発現は、SAMP6早期老化マウスにおける骨量減少を改善しました。

対してin vitroでは、また骨粗鬆症患者におけるWAC発現の低下と、それがin vitroにおけるMSCの骨芽細胞分化に及ぼす重要な影響を明らかにしました。WACのタンパク質レベルは骨芽細胞分化マーカー（RUNX2, Osterix, OCN）と正の相関関係にありました。またMSCにおいてWACをノックダウンしALP染色とARS染色で骨芽細胞分化能を検討するとALP、ARS陽性面積が低下しました。またMSCにおいてWACを過剰発現し同様な実験を行ったところ、ALP、ARS陽性面積が増加しました。

メカニズム解析の結果、WACは下流標的タンパク質PINK1と複合体を形成し、ユビキチン化を介した分解に対する保護因子として作用することが明らかになりました。この複雑な相互作用により、MSCにおけるマイトファジーレベルが維持され、ミトコンドリア機能が安定化し、骨芽細胞分化が促進されます。本研究の結果は、WACをMSCにおける重要な因子として位置づけ、その欠乏が骨粗鬆症の発症機序に関連し、骨芽細胞分化を促進する上でのWACの重要な役割を強調しています。本研究は、骨粗鬆症管理における革新的な診断・治療戦略への有望な道を示唆しています。

今回の論文ではMSCについて着目していましたが、マウス骨芽細胞株MC3T3-E1でもWACが同様の機序で骨芽細胞分化を制御するのか知りたいです。MSCのミトコンドリア機能について理解が深まりました。

本研究では、骨髄脂肪前駆細胞（MALPs）由来のRANKLが、成体マウスの海綿骨吸収においても重要な役割を果たすことを示しました。筆者らは、以前骨髄間葉系前駆細胞（MALPs）を同定し、Adipoq-Creを用いて、そのRANKL産生が若齢マウスの骨吸収を刺激することを示した。しかし、Adipoq-Creマウスでは産まれた直後からMALP細胞を標識してしまうため、発生過程での異常が影響を与える可能性があります。そこで、発育期の影響を排除し、成体骨におけるMALPs由来RANKLの役割を調べるため、誘導性レポーターマウス（Adipoq-CreER Tomato）とRANKL欠損マウス（Adipoq-CreER RANKLflox/flox, iCKO）を作製した。sc-RNAシーケンスデータ解析と系統追跡から、Adipoq+細胞にはMALPだけでなく、骨形成分化能を持つ一部の間葉系前駆細胞も含まれていることが明らかになった。しかし、In situハイブリダイゼーションにより、RANKL mRNAはMALPでのみ検出され、骨形成細胞では検出されないことが示された。生後3ヵ月で誘導したMALPのRANKL欠損は、骨吸収の減少により長骨および脊椎骨の海綿骨量を急速に増加させたが、皮質骨には影響を及ぼさなかった。また、卵巣摘出術（OVX）は、両方の部位で海綿骨量の減少を誘導した。OVX前またはOVX後6週間のRANKL枯渇は海綿骨量を保護し回復させた。さらに、iCKOマウスでは、ドリル穴損傷後の骨治癒が遅延した。以上の結果から、MALPは海綿骨吸収の制御において主要な役割を果たし、MALP由来のRANKLは、成体骨の恒常性維持、閉経後の骨量減少、そして損傷後の骨修復に不可欠であることが示されました。これまで、RANKLの発現は骨細胞とされてきましたが、本研究の結果、RANKLとCsf1は主にMALPsに発現し、骨芽細胞や骨細胞ではほとんど発現していないことが明らかとなりました。本研究は、現在臨床で使用されているRANKL阻害薬デノスマブに加え、MALPsを標的とする新しい治療法の可能性を示唆しており、より選択的かつ効果的な骨代謝制御への応用が期待されます。

この論文での知見は過去の認識を覆す面白い内容でしたが、不確実な部分はまだあるように感じました。また、研究室内でも、白色脂肪や褐色脂肪の組織の解析を行ってくれているので、さらにAdipo-Creを用いて脂肪に着目する研究があってもおもしろいかもしれないと感じました。

主要なtransient receptor potential cationチャネルの一種として知られるtransient receptor potential ankyrin 1 (TRPA1)はERストレスの誘導に関わることが報告されています。また、TRPA1は変形関節症による関節痛と軟骨変性を緩和することが分かっています。

この研究では、破骨細胞分化過程でのTRPA1の作用とその治療標的としてのポテンシャルを調べることに焦点を当てられました。

まず筆者らは、破骨細胞分化過程におけるTRPA1の発現量について遺伝子発現及びタンパク質発現をRAW264.7細胞を用いて調べ、TRPA1の発現が破骨細胞分化に伴って上昇していくことを示しました。

次に筆者らは、siRNAを用いてTRPA1をノックダウン（KD）した際の破骨細胞数や破骨細胞マーカーについて調査しました。結果として、TRPA1 KDは破骨細胞分化を顕著に抑制されることが確認されました。

また、TRPA1阻害はERストレスに関連する経路であることから、ERストレス応答によって更新されるPancreatic ER Kinase (PERK)経路について調べたところ、破骨細胞分化におけるTRPA1 KDはPERK経路の活性化を抑制することが明らかになりました。さらに、TRPA1 KDと同時にERストレス誘発剤を処理すると、TRPA1 siRNA単独処理の際に見られた破骨細胞分化抑制はレスキューされました。

次に筆者らは、TRPA1と破骨細胞分化の関連についてメカニズム解析を行うため、トランスクリプトーム解析によって、TRPA1が活性酸素種ROSの働きを負に制御し、抗酸化遺伝子であるSRXN1の発現を著しく上昇させることを示しました。

この結果より、TRPA1とSRXN1の関係を調べるため、TRPA1とSRXN1を同時にKDする実験を行うと、破骨細胞分化及びERストレスレベルはTRPA1を単独でKDした時と比べて上昇しました。

最後に、in vivoでのTRPA1の作用を調べるため、卵巣摘出マウスにおいてマクロファージ標的型アデノ随伴ウイルスを用いたTRPA1ノックアウト(KO)マウスを用いて、その表現型を調べました。結果として、TRPA1 KOにより破骨細胞分化と骨減少は、Ctrlと比較して軽減されることが示されました。

まとめると、TRPA1の抑制はROSのダウンレギュレーションを介したPERK経路の阻害によって破骨細胞分化を制止することを明らかにしました。この研究はTRPA1が骨粗鬆症に対する有望な治療標的になり得ることを示しています。

 ERストレスが発生しないと破骨細胞分化が正常に進行しないということ自体をあまり良く理解できていなかったので、ERストレスと破骨細胞分化について理解を深める良い機会となりました。シャペロンと破骨細胞の関係などについてももう少し深く勉強しなければならないと感じました。

　癌細胞の生存は、栄養素をはじめとする資源をめぐる厳しい競争に依存すると長らく考えられてきましたが、本研究では癌細胞間における協調的な相互作用が集団としての生存や増殖において重要な役割を果たすことを明らかにしました。特に、アミノ酸が不足する環境下において、癌細胞が相互に協調し集団として生存能力を高める仕組みが働いていることが示されました。その具体的なメカニズムとして、癌細胞がアミノペプチダーゼCNDP2を細胞外に分泌し、細胞外オリゴペプチドを加水分解することで、自他の細胞に遊離アミノ酸を供給し、増殖を促進することが明らかとなりました。さらに、CNDP2の機能を阻害することで、in vitroおよびin vivoの腫瘍増殖が有意に抑制されることが確認されました。以上の結果から、CNDP2は癌における栄養協調メカニズムの中核を担う酵素であり、癌治療の新たな標的となる可能性が示されました。

　本研究では、低密度環境でがん細胞の増殖が起こりにくいという現象に対し、その背後にある「細胞間協調」のメカニズムを探ることで、CNDP2という新たな因子を同定した点が非常に興味深いと感じました。CNDP2の癌種での役割が異なるという報告もあり、更なる機能の解明が期待されます。

細胞には核膜の完全性を保持する機序が備わっており、損傷を受けた核膜はいくつかの核膜修復タンパク質によって修復されます。核膜修復を担うESCRT-Ⅲ複合体は、LEMD2やCHMP7によって核膜破裂部位にリクルートされ、核膜修復に寄与します。これまでに、一次核の膜修復機構は良く研究される一方で、染色体を含む微小核の完全性を制御する機序については良く分かっていませんでした。微小核は、染色体異常の一つで、破裂することで染色体粉砕（Chromothripsis）を引き起こすことが知られています。Chromothripsisは遺伝子の変異が一斉に起こることで、がんの進行に寄与します。本研究では、微小核の破裂が、ミトコンドリア近傍で発生しやすいことを見出し、ミトコンドリア由来の活性酸素種(ROS）が微小核崩壊を引き起こす分子レベルのメカニズムを解明しました。

　まず筆者らは、微小核を3D観察し、ミトコンドリア近傍に存在する微小核が破裂しやすいことを示しました。微小核と一次核のプロテオーム解析とKEGG pathway解析では、微小核にてミトコンドリアに関連するタンパク質がエンリッチしていることが明らかとなりました。そこで、筆者らは、ミトコンドリア由来のROSが微小核崩壊に寄与していることを検討するため、過酸化水素を用いてROSを増加させ、微小核の変化を観察しました。数種類の組織由来のがん細胞でROSを増加させると、すべてのがん細胞において、非処理群と比較して微小核崩壊が有意に増加していることを明らかにしました。

　次に、ROSが膜修復タンパク質に与える影響を検討するため、膜修復タンパク質をコードするCHMP遺伝子を欠損させ、ROSによる微小核への影響を観察しました。するとCHMP7の欠損が、ROS増加による微小核崩壊を抑制させました。また、微小核におけるCHMP7を観察すると、CHMP7が蓄積していることを見出しました。このことから筆者らは、CHMP7の核外輸送について検討されました。先行研究から、ROSは核タンパク質の糖化であるO-GlucNACylationを促進することが知られています。そこでROS増加時のO-GlucNACylationを観察すると、核膜部でのシグナルが増加していること、XPO-1と核膜孔複合体が共陽性であったことから、輸送機能に干渉する異常な結合がROSによって増加している可能性が示唆されました。次に、CHMP7が核内に蓄積することが微小核崩壊に寄与するか検討するために、CHMP7の核外輸送シグナル(NLS)に変異を与えました。これによってROSが無くてもCHMP7が微小核に蓄積します。CHMP7のNLS変異は、ROSの増加無しで、微小核崩壊を増加させました。

　筆者らは、膜修復タンパク質のCHMP7の蓄積がどのように微小核崩壊を誘導しているのか検討するため、微小核由来のCHMP7と相互作用するタンパク質をプロテオーム解析によって探索しました。すると、ROSを誘導させた微小核において、LEMD2がエンリッチしていることを発見しました。そこで、仮説として、CHMP7-LEMD2の過剰な相互作用が、微小核膜を歪ませることで、微小核崩壊を起こしていると考え、LEMD2欠損を行いました。LEMD2欠損は、ROSによる微小核崩壊を軽減させ、さらにCHMP7（NLS）変異を導入したCHMP7蓄積微小核でもLEMD2の欠損は微小核崩壊を抑制しました。また、ROSによるCHMP7のジスルフィド結合の増加も微小核崩壊に寄与することが考えられたため、CHMP7のシステイン残基をセリンに置換しました。これによってCHMP7の高次複合体の形成が抑制され、実際にROS増加時の微小核崩壊が減少していました。これらのことは、CHMP7-LEMD2の過剰な相互作用を抑制することで、微小核崩壊を防ぐことが示唆されます。

　次に、実際のがん患者における微小核崩壊に着目しました。がん中心部では低酸素状態であり、ROSが産生されやすい状態でもあります。がん中心部では、cGAS陽性の微小核崩壊が見られていました。以上のことから、低酸素によるがんの進行に、微小核崩壊が関与していることが示唆されています。

　本研究は、ミトコンドリア由来のROSが微小核の崩壊を促進する分子レベルのメカニズムを明らかにしました。破裂した微小核によって引き起こされる病理学的プロセスを標的とすることは、広範な低酸素状態を特徴とする腫瘍における治療目標となる可能性があります。

　当研究室が着目している遺伝子も、核膜タンパク質をコードしており、核膜タンパク質について広く理解することは、今後の研究に役立つと思いました。がんに関連する微小核について、その周辺知識を勉強することは、基礎から応用まで知識を深めるいい機会でした。

大腿骨頭壊死（ONFH）は血流障害による壊死を特徴とする難治性疾患であり、その詳細な分子メカニズムは解明されていません。本研究は、ONFHの発症に好中球が重要な役割を果たしていることをscRNA-seqにより明らかにしました。

　好中球は骨免疫で働き、DAMPs刺激などにより好中球細胞外トラップ（NETs）を形成しネトーシスを起こします（NETosis）。また、NETs形成により内皮間葉転換(EndMT)を促進し内皮細胞による血管新生を負に制御することが報告されています。 大腿骨頭壊死モデルラットでは軟骨下骨の骨組織が崩壊し、ネトーシスが発生していることが確認されました。

　また、M2マクロファージから放出されるエクソソーム（M2-Exos）は好中球の活性化とNETosisを制御することが報告されています。本研究では、M2-ExosがNETosisを抑制し、内皮間葉転換を負に制御することで、内皮細胞の血管新生能を維持することが示唆されました。さらに、この機能はM2-Exosが含むmiR-93-5pに寄与するものであることが示唆されました。in vivo実験では、ONFHモデルラットの壊死領域にmiR-93-5pを処理すると骨量低下と骨構造の崩壊が改善されました。

本研究は、大腿骨壊死に好中球のNETosisが関与することを特定し、NETosisの抑制にM2-ExosのmiR-93-5pが役立つことを示唆しました。これら分子メカニズムは新たなONFH治療標的として役立つ可能性があります。

本研究は骨疾患における免疫細胞同士の作用とその機能について明らかにし、骨代謝制御をエクソソームやmiRNAの観点から解析する内容でした。自身の研究対象であるゴーハム病は骨溶解部位に血管新生が起こりますが、本研究のようにマクロファージやエクソソーム放出が関わっている可能性があり参考になるものでした。

筋と骨の全身的な損失は複雑な代謝性疾患であり、腸の機能不全に関連することが知られていますが、その詳しいメカニズムや治療法は不明です。そこで著者らは、腸の機能不全が筋と骨に及ぼす影響について調べ、さらにプロバイオティクスとして、Bifidobacterium animalis subsp. lactis A6 (B. lactis A6) による治療効果を明らかにしました。

著者らはまず、デキストラン硫酸ナトリウム（DSS）によりマウスに大腸炎を誘導したところ、マイクロバイオームの調節を伴って筋機能や筋量、骨量、骨密度などが減少していることがわかりました。次に、DSS投与マウスで減少していたBifidobacterium animalis subspeciesの中で、プロバイオティクス候補として期待されているlactis A6に着目したところ、B. lactis A6 がDSSによる筋骨格系への障害を軽減することがわかりました。また、混合抗菌薬ABXにより腸内細菌を除去したマウスにおいても、減少していたこれらの障害が、B. lactis A6 の投与によって改善されました。B. lactis A6 の作用としては、腸管における粘膜バリアの損傷や炎症を軽減させ、マイクロバイオームを調節することで筋骨格系への障害から保護していることが示唆されました。また、B. lactis A6 は、短鎖脂肪酸（SCFA）である酪酸の産生を増強しており、実際に酪酸の投与によっても筋骨格系への障害が改善されました。最後に、酪酸はNF-κB経路を抑制し、DSSによる炎症状態の緩和を通じて筋と骨の損失を軽減させることが示唆されました。

本研究から、腸機能不全によって引き起こされる筋骨格系の障害において、マイクロバイオームが重要な役割を果たすことが示唆されました。また、腸機能不全状態における、B. lactis A6のプロバイオティクスとしてのポテンシャルが明らかとなりました。本論文では、腸機能不全を介した筋骨格系の障害に対する効果が明らかとなりましたが、B. lactis A6が他のサルコペニアまたは骨粗鬆症モデルにおいてどのような効果をもたらすのかなど、B. lactis A6についてのさらなる機能の解明が期待されます。

骨髄間質細胞(BMSC) は、移植された際、分泌因子の産生によって骨再生を制御することができます。筆者らは、in vitroおよびin vivoにおいて、BMSCの分泌因子としてKIAA1199を同定しました。患者のKIAA1199の血漿レベルは骨粗鬆症骨折リスクと正の相関があり、患者のBMSCにおけるKIAA1199の発現レベルは骨形成分化能と負の相関がありました。KIAA1199 KD BMSCは、in vitroにおいて骨芽細胞分化能の上昇を、in vivoにおいて異所性の骨形成を示しました。また、KIAA1199 KOマウスでは骨量、骨強度、骨形成速度が増加しており、骨損傷後の治癒促進と、卵巣摘出術によるエストロゲン欠乏後の骨量減少の抑制を示しました。DNAマイクロアレイによってKIAA1199 KD hBMSCとコントロールhBMSCのトランスクリプトーム解析を行った結果、KIAA1199 KDによって最も発現が上昇した遺伝子として、OPNが同定されました。骨芽細胞やBMSCから分泌されたKIAA1199は、骨芽細胞に作用して何らかの経路でオステオポンチン産生を阻害することで、インテグリンを介したAKTおよびERKシグナル伝達経路を抑制し、骨芽細胞分化と骨形成を負に制御します。

以上より、KIAA1199は骨芽細胞分化と骨形成の制御因子であり、低骨量状態の治療標的となり得ることが示唆されました。

感想: BMSCの分泌因子による骨芽細胞分化制御についてとても勉強になりました。KIAA1199は以前からよく知られていたヒアルロン酸分解以外に、アクチン細胞骨格変化によるhBMSCの運動性制御や、本研究で示されたOPN産生抑制による骨芽細胞分化抑制など様々な機能が示唆されており、興味深いと思いました。

ミトコンドリアはエネルギー生成の役割に加えて、常に融合と分裂を繰り返し、細胞機能に影響を与える非常に動的な細胞小器官です。また骨芽細胞分化時に必要とされるリン酸カルシウムがミトコンドリアに含まれるという報告がありました。本研究では、骨形成中の成熟骨芽細胞において観察される独特の形態学的特徴であるミトコンドリアの断片化とドーナツ型形成がミトコンドリア由来小胞 (MDV) の生成を引き起こし、骨芽細胞前駆細胞や前骨芽細胞の分化と成熟を促進することを実証しました。尚、骨芽細胞特異的Col1a1-Creとミトコンドリアの標的配列を持つGFPを使用して、骨芽細胞のみがミトコンドリアマトリックスでGFPを発現する遺伝子操作マウスを開発し、頭蓋冠から抽出した骨芽細胞を使用しています。

骨芽細胞に分化誘導を掛け共焦点顕微鏡や走査透過電子顕微鏡等で観察したところ、分化誘導7日目にミトコンドリアの断片化とドーナツ型ミトコンドリアを確認されました。超高圧電子顕微鏡での観察においてドーナツ型ミトコンドリアからMDVが放出される様子も確認できました。

また骨芽細胞から分泌されたミトコンドリアとMDVを骨芽細胞に処理し、ALP染色と骨芽細胞分化マーカー遺伝子解析を行ったところ、in vitroで骨形成作用が促進することが分かりました。更にマウスの頭蓋冠に欠損手術を施しミトコンドリアとMDVを骨芽細胞に処理したところ骨再生が促進しました。

最近、CD38/cADPRカルシウムシグナルがアストロサイトからのミトコンドリアの細胞外放出を誘発することを報告されました(Hayakawa et al., Nature , 2016)。そこで、CD38/cADPRシグナルがミトコンドリア分泌の調節を通じて、骨芽細胞の成熟に重要な働きを果たすか調査したところ、Cd38ノックダウン骨芽細胞やcADPRを処理した骨芽細胞のALP染色や分化マーカーの解析から、骨形成誘導はCD38/cADPRシグナルを介してミトコンドリアの断片化とドーナツ型形成、およびミトコンドリアの分泌を促進することを示しました。

そしてミトコンドリア融合遺伝子Opa1ノックダウンとミトコンドリア分裂遺伝子Fis1過剰発現を介してミトコンドリア分裂とドーナツ型形成を促進すると、ミトコンドリアの分泌が増加し、骨形成が促進することも確認されました。更に筆者らは、Opa1発現を誘導するミトコンドリア融合プロモーターM1は骨形成を阻害するが、一方骨芽細胞特異的Opa1欠損は骨量を減少することも示しました。

以上より、成熟骨芽細胞のミトコンドリアが断片化またはドーナツ型形成をし、そこから出芽したミトコンドリア由来小胞（MDV）がCD38／ADPRシグナルによって細胞内に放出され、骨芽細胞前駆細胞と前骨芽細胞に取りこまれることでそれらの分化と成熟を促進することが示唆されました。

本論文は参考できる点が多く、特にエネルギー代謝だけでなくミトコンドリアの動的行動にも着目しようと思いました。

MALAT1は、高度に保存された数少ない核内ロングノンコーディングRNA (lncRNA) の一つであり、正常組織で豊富に発現しています。先行研究において、MALAT1が乳がんの肺転移を抑制することが同定されていました。一方、MALAT1ノックアウトマウスは生存可能で、発育も正常です。

生理学的および病理学的プロセスにおけるMALAT1の基本的な役割を明らかにするために、筆者らはハイスループットRNA-Seq解析をおこない、このlncRNAがヒトおよびマウスにおいて破骨細胞形成時に発現低下することを発見しました。

破骨細胞形成と骨粗鬆症におけるMalat1の役割をin vivoで検討した結果、驚くべきことに、マウスにおける Malat1 の欠損は、メラノーマや乳腺腫瘍細胞の骨転移や骨粗鬆症を促進しますが、これはMalat1 の遺伝的追加によって回復しました。また、骨粗鬆症と骨転移におけるMALAT1の臨床的関連性を検討した結果、破骨細胞系統におけるMALAT1発現の低下が、骨粗鬆症や、乳癌骨転移や骨肉腫を含む骨病変と関連していることが示唆されました。

Malat1欠損による破骨細胞形成促進のメカニズムを検討したところ、Malat1 KD細胞では破骨細胞形成が亢進しましたが、さらにNfatc1をKDすると破骨細胞分化がControlレベルまで抑制されたことから、Malat1欠損はNfatc1を介して破骨細胞形成を促進することが示唆されました。Nfatc1と結合するタンパク質として、Malat1との相互作用が報告されているTeadファミリータンパク質のうち、マクロファージ・破骨細胞特異的に結合するTead3タンパク質が同定されました。

したがって、Malat1はマクロファージ・破骨細胞特異的なTead3に結合することで、破骨細胞形成のマスターレギュレーターであるNfatc1へのTead3の結合と活性化を阻害し、その結果Nfatc1を介した遺伝子転写と破骨細胞分化が阻害されるというメカニズムが明らかになりました。

以上の結果から、MALAT1は骨粗鬆症と骨転移を予防するlncRNAであることが明らかになりました。

今回の論文では、今後の自分の研究にも生かせそうな内容が多く、非常に勉強になりました。特に、様々な実験法を用いて遺伝子・タンパク質間の相互作用を調べていて、Nfatc1とCtdnep1についても適切な方法で検討したいと思いました。

脂肪酸の取り込み、脂質の産生と貯蔵、脂肪滴（LDs）の代謝制御は、脂質の恒常性、脂肪細胞の肥大化、肥満と密接に関係しています。本研究では、脂質ラフトの主要構成成分であるストマチンが、関連するシグナル伝達経路を調節することにより、脂肪形成と脂肪細胞の成熟に関与していることを報告します。脂肪細胞様細胞において、2つのLDが接触すると、ストマチンとペリリピンが接触部位に動員され、これらによる分子複合体の凝集がLD-LD融合を促進することにより、LDの成長や肥大を誘導します。さらに、FAT/CD36トランスロカーゼなどのエフェクター分子を脂質ラフトにリクルートすることによって、細胞外環境からの脂肪酸取り込みを促進します。

ストマチン遺伝子導入マウスに高脂肪食を与えた場合、肥満、インスリン抵抗性、肝障害が認められますが、通常食ではこれらの表現型は観察されません。これらの結果は、肥満の発症メカニズム解明に新たな手がかりを与えるものです。普通食では、STOM Tgマウスにおいても、過剰なエネルギー供給がないため、体重は維持されますが、高脂肪食を与えると、過剰なストマチンが余剰栄養素とエネルギーを利用して脂肪組織の増加を促進します。ストマチンの上方制御は、脂肪酸取り込みとLDの成長を促進することにより、過剰な遊離脂肪酸を脂肪組織に蓄積させ、生体保護に寄与すると考えられます。遺伝子ノックダウンやOB-1によるストマチンの阻害は、PPARγ経路の抑制を介して脂肪分化とLD成長を阻害します。ストマチンによるPPARγへの作用にはERKシグナルが関与していますが、PPARγとは独立した別の経路が存在する可能性も示唆されます。

感想

脂肪細胞の成熟と機能について、とても勉強になりました。私が研究しているマウスでも脂肪形成関連遺伝子について調べてみたいと思いました。また細胞面積の分布を表すグラフについて参考にしたいと思いました。

• 私達は、破骨細胞分化におけるCpeb4という遺伝子の機能に着目して研究をしており、これまでに、Cpeb4が破骨細胞分化に必要とされる遺伝子であることや、核内で凝集体を作って、選択的スプライシングに関与しているのではないか、ということを報告してきました。

• 今回の論文では、Cpeb4タンパク質の神経細胞の細胞質での凝集のメカニズムと自閉症スペクトラム(ASD)との関連が明らかにされました。著者らの以前の論文では、ASD患者さんでは、Cpeb4 mRNAのマイクロエクソンという非常に短いエクソンが脱落している傾向があることが報告されていましたが、マイクロエクソンの有無がCpeb4タンパク質の性質にどのような影響を及ぼすかどうかは不明でした。

• 今回、神経細胞の脱分極後に、凝集体を作っていたCpeb4（機能的に不活性状態）が、細胞質に溶解することがわかりました（機能的に活性化状態）。また、凝集体形成には、Cpeb4のヒスチジンクラスターが関与していて、マイクロエクソン４があると、ヒスチジンクラスターと相互作用して、Cpeb4を溶解させることができますが、マイクロエクソン４がないと、Cpeb4は不可逆的な凝集体を作ってしまいました。そして、このマイクロエクソン４がないタンパク質の比率が上がってくると、正常なタンパク質も一緒に不可逆的な凝集体を形成してしまいました。このことは、マイクロエクソン４がないCpeb4の比率がある一定程度を超えると、自閉症を発症する患者が多いということと一致しています。

• 神経刺激に応答したCPEB4媒介遺伝子発現の可逆的制御を維持するために、神経細胞のCPEB4にマイクロエクソンが必要であると結論づけられました。

• なお、神経細胞以外では、マイクロエクソン４を持たないCpeb4転写産物が一般的で、少なくとも、破骨細胞の細胞質では、凝集体を作っておりません。神経細胞以外の細胞では、凝集体の形成は、リン酸化などで制御されているようです。今回の論文の内容を、今後の我々のCpeb4の研究に活かせればと思います。

オステオレクチンは最近同定された骨形成成長因子であり、インテグリンα11に結合し、骨髄間質細胞によるWnt経路の活性化と骨形成分化を促進します。オステオレクチンは、胎児期の骨格形成には必要ではなく、成人の骨量の維持には必要であることが分かっていましたが、今回成長期のマウスにおいて成長板軟骨の増殖を増加させることで骨の伸長を促進していることを明らかになりました。

ヒトにおけるゲノムワイド関連研究では、オステオレクチンの16kb下流に、身長および血漿オステオレクチン濃度の低下と関連する一塩基変異体（rs182722517）があることが報告されています。本研究では、rs182722517の変異体を含むように編集されたヒト骨髄間質細胞は、対照細胞に比べてオステオレクチンの産生が少なく、骨形成分化も少ないことが示されました。これらの研究により、オステオレクチン／インテグリンα11は、マウスおよびヒトの骨伸長と体長を制御する因子であることが明らかになりました。

SNPに関する変化について着目した論文は自分で読んだことがなかったのでクロマチンのアクセシビリティに注目するような方法を知れて面白かったです。

多発性骨髄腫（MM）細胞は、破骨細胞（OCL）形成を促進する因子を放出して骨疾患を引き起こします。このような骨疾患に対する既存の薬剤は、破骨細胞の機能を標的としたものが多く、MM-OCL間の情報伝達に直接作用するような新規の薬剤の開発が求められています。

本研究では、MMP-13という分子がMM細胞由来の破骨細胞分化に重要であるという報告に基づき、その情報伝達について調査を行いました。

結果として、免疫チェックポイント分子であるPD-1HがMMP-13の結合パートナーとなり得ること。

MMP-13処理により、WTでは細胞骨格の再構成を経て細胞融合と骨吸収が誘導されるが、Pd-1h をノックアウトした細胞では骨吸収が誘導されないこと。

MMP-13/PD1Hのシグナルにより、c-Src/Rac1が活性化されてOCL分化やポドソーム成熟が制御されること。

MMモデルマウスにおいて、Pd-1h を欠損させるとMM由来骨溶解が軽減されることを明らかにしました。

以上のことから、MMP-13が単核細胞のPD-1Hに作用すると、c-Srcシグナルの活性化を介して、破骨細胞分化と骨吸収の亢進が誘導されると考えられます。また、今回報告されたMMP-13/PD-1H軸をターゲットとして多発性骨髄腫における骨疾患と免疫抑制の両方に対しての治療戦略の開発をもたらす可能性も考えられます。

免疫抑制に関連した分子とプロテーゼ活性を持つ分子が、それぞれの本来の活性と関係なく破骨細胞分化にかかわるという知見がとても興味深く感じました。

破骨細胞は骨吸収中にカテプシンK（CTSK）などを含むリソソームを吸収間隙へ分泌しますが、リソソームをRuffled borderへ輸送するメカニズムは深く理解されていません。本研究は、破骨細胞のエクソサイトーシス経路を制御する新規因子としてRUFY4を同定しました。Rufy4 KOマウスは生理学的条件下でコントロールと比べ海綿骨量が増加しました。また、炎症性および閉経後骨粗鬆症モデルにおける病理学的骨量減少を改善しました。メカニズムとしては、RUFY4は後期エンドソーム上のRab7とリソソーム上のLAMP2との間のアダプタータンパク質として働き、それによってエンドリソソーム輸送、リソソーム成熟、CTSK分泌を制御し、骨吸収を促進します。したがって、RUFY4は骨量を制御する重要な因子であり、骨関連疾患の新たな治療標的となりうる可能性があります。

GSDMDも同じく破骨細胞のエクソサイトーシスを制御する因子として報告されています。RUFY4が後期エンドソームと一次リソソームの融合を促進するのに対し、GSDMDはその前の段階である初期エンドソームから後期エンドソームへの変換を抑制していました。既存の骨粗鬆症治療薬は破骨細胞と骨芽細胞のカップリングを阻害することが問題になっていますが、エクソサイトーシス経路の制御はこの課題を解決する方法として着目されていることが分かりました。

世界中の女性に最も一般的ながんの1つである子宮頸がんは、原発腫瘍の早期転移を伴う場合、予後不良や治療転帰不良に関連します。転移にはEMTが関連すると考えられていますが、子宮頸がんにおけるEMTの根本的な分子メカニズムは完全には理解されていません。

本研究では、著者らはまず、TGF-βによって子宮頸がん細胞のEMTを誘導し、環状RNAの発現を解析しました。その結果、EMTの誘導によってCDR1asの発現が有意に上昇することが示されました。また、RIPアッセイにより、CDR1asはIGF2BP1(Insulin-like growth factor 2 mRNA-binding protein 1)と結合すること、IGF2BP1はm6A修飾を受けたSlugのmRNAに優先的に結合し、Slugの発現を安定化させることが分かりました。

以上のことから、著者らの研究は、CDR1asとm6AがTGF-βシグナル伝達を活性化し、子宮頸がんの転移を促進することを示し、これらが子宮頸がんの治療標的となる可能性を示唆しています。

環状RNAが、miRNAではなくタンパク質と相互作用することで、がんの転移を促進するという点が興味深かったです。Transwell assayや創傷治癒アッセイの方法について勉強になりました。今後、自分の研究でもEMTを検討してみたいと思いました。

生体における腸内細菌叢の重要性は近年さらに注目されており、腸内細菌叢が乱れた状態であるディスバイオーシスは、身体全体の生理学的応答を引き起こすことが報告されてきています。また、抗生物質の使用による影響など、母親のマイクロバイオームが子孫に影響を与えることも報告されています。しかしながら、父親が子孫の健康に与える影響は、母親による影響よりも間接的であると考えられ、父親のマイクロバイオームが子孫の健康に与える影響はほとんど不明でした。

本研究では、抗生物質などによりディスバイオーシスを引き起こしているオスマウスの子孫は、低出生体重や重度の成長制限、早期の死亡となりやすいことが明らかになりました。ディスバイオーシスさせたオスでは、レプチンシグナルの障害や精巣代謝プロファイルの変化、精子中のsmall RNAペイロードの再マッピングなどが引き起こされました。また、ディスバイオーシスさせたオスマウスの精子は、母親となるメスマウスの胎盤重量を減少させ、胎盤の機能不全を引き起こすことが示唆されました。さらに、一度ディスバイオーシスを引き起こしても、マイクロバイオームを回復させると、子孫への悪影響がレスキューされることが分かりました。

今回の結果から、父親のマイクロバイオームが母親の胎盤機能に影響し、さらに子孫の適応性をプログラムすることが示唆されました。今回紹介した論文の約1ヶ月後に、父親の食生活が精子RNAを介して子孫の健康に影響を与える、という論文がNatureに報告されており、その注目度が窺えました。したがって、父親のマイクロバイオームが子孫に影響を与える、詳細なメカニズムについて解明されることが期待されます。また、妊娠中では、マウス及びヒトにおいて、抗生物質の曝露が子孫の身体に様々な影響を与えることが報告されており、今回のオスマウスの結果が、ヒトにどれほど当てはまるのかといった点も興味深いと思いました。

脊髄性筋萎縮症(SMA)は、SMN1の突然変異によって引き起こされる、子供や若年成人に影響を与える重度の常染色体劣性神経筋疾患です。SMAは、脊髄α運動ニューロン(αMN)の変性をはじめとして、筋麻痺や萎縮、その他の末梢の変化を引き起こします。成長ホルモン放出ホルモン(GHRH)とそのアゴニストMR-409は、筋萎縮を抑制し、神経保護や抗炎症機能を発揮します。今回の論文では、MR-409による治療が体重増加の誘発、運動行動の改善、筋線維の萎縮の抑制、神経筋接合部の成熟を促進したことが報告されました。さらに、MR-409はαMNの喪失を防ぎ、脊髄の神経炎症を減少させました。これらの結果は、MR-409がSMAの重症度を軽減し、この疾患の新しい治療法を表す可能性があることを示しています。

GHRHがSMAモデルマウスの骨格筋や運動神経の形態をレスキューすることが興味深かったです。また、SMAモデルマウスはCtdnep1 cKOマウスと表現型が近く、参考になることが多かったです。既存の治療薬との併用で、新規の治療法につながることが期待されます。

Pyle病は皮質骨の菲薄化を伴った骨系統疾患で、Sfrp4が原因遺伝子です。以前筆者らは、Sfrp4全身KOマウスを作成し、海綿骨では古典的Wntシグナルの上昇が、皮質骨では古典的・非古典的Wntシグナルの両者が上昇していることを発見しましたが、Sfrp4 KOで皮質骨・骨膜が減少するメカニズムは良く分かっていませんでした。骨膜には、皮質骨の恒常性や修復、骨同化薬への応答に重要な骨膜幹細胞が存在しています。しかし、その骨膜ニッチの幹細胞を支配する局所またはパラクリン因子については未だに明らかではありません。そこで筆者らは、Sfrp4が局所因子として、骨膜幹細胞を介して皮質骨を制御すると考え、骨膜におけるSfrp4の機能を解析しました。

　まず、Sfrp4が骨膜で発現していることをRNA-scopeで示しました。Sfrp4全身欠損マウスの骨膜の細胞はコロニー形成能が低下していること、骨芽細胞分化能が低下していることを明らかにしました。次に、骨膜の幹細胞に着目するため、先行研究で行われたCtsk陽性の骨膜の幹細胞(PSC)についてのRNA-seqを再解析しました。すると、分化ヒエラルキーが最も高いPSC、分化能が低下したPP1, PP2細胞において非古典的Wntシグナルに重要な遺伝子(Wnt5b, Ryk, c-Junなど)の発現が高いことが明らかとなりました。一方で、Wnt1やAxinといった古典的Wntシグナルに重要な遺伝子の発現はほとんどありませんでした。次に、Sfrp4 KOによる骨膜幹細胞への影響を検討するために、骨膜の細胞をフローサイトメトリーによって、幹細胞の割合を解析しました。Ctsk系譜の細胞数に変化はなかったものの、Sfrp4 KOではPSCの割合が減少していました。さらに、骨-軟骨前駆細胞のマーカーであるTHY1.2陽性の細胞が減少していることも明らかにしました。これらの結果をin vitroでも解析するため、PSC, PP1, PP2をソートしてコロニーを形成させた後、シングルクローンを再度培養することで、分化ヒエラルキーについて解析しました。ソートしたPSCは、分化ヒエラルキーの低い細胞に変化していることを明らかにし、特にPP2の割合が高いことを明らかにしました。さらに、これら幹細胞の自己複製能と多分化能について検討するため、それぞれのコロニー形成アッセイ(CFU)を行うと、通常のCFU-Fでは変化がなかった一方で、骨芽細胞・軟骨細胞に関するCFU-OB・Chondroでは、KOでコロニーが低下していること、脂肪細胞に関するCFU-Adipoでは、KOでコロニーが増加していることを明らかにしました。以上のことは、Sfrp4が、Ctsk系譜骨膜幹細胞において正しく骨芽細胞系列に分化する能力を維持する役割を示唆しています。

　より詳細なSfrp4 KOによる骨膜細胞への影響を明らかにするために、バルクRNA-seq解析とGO解析およびReactome解析を行いました。KOでは、細胞外基質、Wnt、PTH関連遺伝子の減少が見られ、特に、組織修復や骨石灰化などの経路の低下が見られました。以上を踏まえて、骨折とPTHによる骨膜の応答を解析することにしました。Sfrp4 KOでは骨膜幹細胞の応答の低下を伴った骨折治癒が不全となることが観察されました。PTH応答に関しては、PTHで通常増加するPSCが、KOでは増加しないことと、PTHによる皮質骨の骨同化作用がKOで起こらないことを明らかにしました。以上のことから、可溶性WntアンタゴニストであるSfrp4が、Ctsk系譜の骨膜幹細胞/前駆細胞の機能を調節することを明らかにしました。本研究は、骨膜の幹細胞と前駆細胞を制御するシグナル分子と経路を解析し、これらは骨恒常性の維持、骨再生、骨同化薬物への応答などに関与するメカニズムの理解を深め、骨の脆弱性や骨再生の障害に関連する疾患に対する治療法を提供する可能性があります。

　骨膜幹細胞のオートクリン/パラクリン因子に関する議論・展望が挙げられ、Pyle病を含む皮質骨脆弱性・骨再生不全に対する新たな治療薬への応用が期待される論文だと思いました。本研究は、今年のBone Biology Forumで講演を行ったRoland Baron先生の研究で、講演内でも少し取り上げられていました。骨膜研究を行っている自分にとって興味深い内容でした。

タイトジャンクションの主要な構成要素であるClaudin-1は様々な腫瘍において二重機能を有すると報告されており、膵臓癌におけるその重要な役割は不明です。本研究では、Claudin-1が膵臓癌組織で抑制されており、不良な予後と関連していることを見出しました。さらに、KPCマウスで膵臓特異的にClaudin-1をノックアウトすると、膵臓病変の発生が早まり、悪性度が高くなり、全生存期間が短縮することを示しました。同様に、Claudin-1ノックダウンもin vitroで膵臓癌細胞の増殖、遊走、幹細胞化を促進しました。したがって、Claudin-1が膵臓における極めて重要な癌抑制因子であることを報告しました。またClaudin-1の抑制が、異常なDNMT1およびDNMT3AのアップレギュレーションとClaudin-1プロモーターの過剰メチル化を誘導することを見出しました。さらに、DNMT阻害剤SGI-1027が、膵臓癌細胞の増殖、EMTおよび幹細胞性を阻害し、抗膵臓癌作用を有することを示しました。

以上より、本研究は、Claudin-1が膵臓癌における新規腫瘍抑制因子であり、DNMT1／3A異常によるエピジェネティックな抑制が膵臓癌の発症と進行を促進する重要な因子であることを示しています。また、DNMT阻害によるClaudin-1の抑制を標的とすることが、より効果的な膵臓癌治療のための戦略である可能性も示唆されました。　

Claudin-1やDNMTの発現量に合わせて様々な膵臓癌細胞を用いていた点が興味深かったです。抗クローディン18.2抗体であるゾルベツキシマブが胃癌に対して化学療法との併用で有効性を示しており、Claudinが効果的な癌治療に繋がることが期待されます。

加齢やストレスによって組織に老化細胞が蓄積し、それによって引き起こされる慢性炎症が、加齢関連疾患の発症・進展に関わっていることが明らかになってきましたが、病的な老化細胞を除去する薬剤で、大きな副作用の懸念がなく、臨床応用可能なものはありませんでした。以前より、カロリー制限によって寿命が延長することが知られていますが、カロリー制限によって寿命が延長した個体では、加齢に伴う老化細胞の蓄積が抑制されていることも知られていました。本研究では、糖尿病の治療薬として開発されたSGLT2阻害薬が老化細胞の除去を誘導するかどうかを検証し、老化細胞除去の基礎的メカニズムを解明することを目的としました。

高脂肪食によって肥満させたマウスにおいて、短期間のSGLT2阻害薬の投与を行ったところ、内臓脂肪に蓄積した老化細胞が除去されるとともに内臓脂肪の炎症が改善し、糖代謝異常やインスリン抵抗性の改善がみられました。これとは対照的に、短期間のインスリン投与によって肥満マウスの高血糖を改善しても、内臓脂肪に蓄積した老化細胞は除去されず、内臓脂肪の炎症も改善しないため、SGLT2阻害薬による老化細胞除去効果は、血糖の改善とは関連なく、特有の効果であることがわかりました。その作用機序を明らかにするためにメタボローム解析を行ったところ、SGLT2阻害薬の投与によって、AICARというAMPKを活性化する代謝産物が増加していることがわかりました。さらにAMPKの活性化は、特に悪性度の高い老化細胞でその発現レベルが上昇している免疫チェックポイント分子PD-L1を抑制することで、老化細胞除去機構を担う免疫系を活性化し、老化細胞除去を促進することが明らかとなりました。以上から、SGLT2阻害が老化細胞の内因性免疫監視を増強することにより、間接的な老化細胞除去効果を有することを示唆しています。

SGLT2阻害薬の投与は、高コレステロール血症によって形成が促進された動脈硬化巣から老化細胞を除去することで、動脈硬化プラークの縮小を促進しました。SGLT2阻害薬の投与によって、加齢に伴うフレイルの改善や早老症マウスの寿命の延長などを確認しました。本成果は、アルツハイマー病を含めた様々な加齢関連疾患の治療への応用の可能性を示唆するものです。

感想

細胞老化や、老化細胞の蓄積が発症に関与する加齢関連疾患についてとても勉強になりました。ブドウ糖負荷試験（GTT）、インスリン負荷試験（ITT）やカロリー制限など、自分の研究に活かしていきたいです。免疫についての勉強もするべきだと感じました。

高脂肪食 (HFD) は肥満やそれに関連する代謝常症を引き起こすだけでなく、骨量の大幅な減少を誘発し、肥満者の骨折リスクを高めます。そのため、HFD誘導性の肥満と骨量減少を同時に抑制できる新たな治療戦略の開発が望まれています。グルココルチコイド (GC) 過剰は様々な代謝異常と関連しています。本研究では、HFD 誘導性骨量減少と代謝異常における骨格の 11β-HSD1  (GC活性化酵素)の役割を解明することを目的とし、さらに、11β-HSD1 が骨量減少とグルコース処理障害の両方に対処するための治療標的となり得るか検討しました。

HFD または 通常食を与えた WT マウスの骨において、GC シグナルの過剰な活性化を伴う 11β-HSD1 の異常な発現上昇が起こることと、この現象は、グルコース処理障害 → GC シグナルの過剰な活性化を伴う 11β-HSD1 の異常な発現上昇 → 骨量減少 の順に起きることを明らかにしました。また、骨芽細胞特的 Hsd11b1 cKOマウスでは、HFDによる骨量減少とグルコース処理障害が改善したことから、骨芽細胞 11β-HSD1 が HFD 誘導性骨量減少と全身性代謝異常に関わっていることが示唆されました。続いて、11β-HSD1 を過剰発現させたMC3T3-E1 細胞 (MC3T3-HSD1) とコントロールの細胞 (MC3T3-GFP) のRNA-Seq とATAC-Seq を行い、差があった遺伝子のうち「インスリンへの応答」「骨芽細胞分化の制御」「骨化の制御」の全てに関わる遺伝子である Egr2 に着目しました。MC3T3-HSD1 で低下した石灰化と Bglap mRNA 発現が、Egr2 過剰発現によって回復しました。また、MC3T3-HSD1では Glut4 と Pik3Cb 発現が減少し、グルコース取り込みが低下しましたが、Egr2 過剰発現によって回復しました。これらのことから、過剰な 11β-HSD1 による GC シグナルの過剰活性化は、 Egr2 の発現を抑制し、骨芽細胞の骨形成活性とグルコース取り込みを阻害することが示唆されました。最後に、骨芽細胞 11β-HSD1 の薬理学的阻害が HFD 誘導性骨量減少と代謝異常を改善できるかを検討するために、WT マウスに骨標的 11β-HSD1 阻害剤 (DSS)6-AZD8329を投与する実験を行いました。その結果、骨標的 11β-HSD1 阻害剤投与によってHFD誘導性の骨量減少とグルコース処理障害が改善しました。

以上より、骨芽細胞の11β-HSD1 発現上昇による GC 過剰活性化は、骨芽細胞のグルコース取り込みと骨形成活性を抑制し、HFD 誘導性の骨量減少、肥満、グルコース処理障害に寄与することが明らかになりました。また、骨芽細胞の 11β-HSD1 の標的化が肥満者の体重を減少させ、グルコース代謝を改善し、骨を強化するための有望な戦略になる可能性が示唆されました。

感想

骨芽細胞と全身の代謝との関係についてとても勉強になりました。In vivo と In vitro でのグルコース取り込みアッセイやエネルギー摂取量･消費量の測定方法など、今後の研究に活かしていきたいと考えております。

NAD+依存性脱アセチル化酵素であるSIRT1は、オートファジーや代謝など、様々な生理学的・病理学的な細胞プロセスを制御することから、癌、神経変性疾患、心血管疾患などの老化関連疾患の予防および治療に役立つと報告されています。

実際に、SIRT1標的薬は、骨粗鬆症などの骨関連疾患に対する治療薬として注目されており、Prx1-Cre、Osx-Cre、またはCol1a1-Cre Sirt1ノックアウトマウスでは骨量の減少が報告されています。更に、骨リモデリングにおいて、骨芽細胞は大量の細胞外マトリックスを生成・分泌するために十分なエネルギーを必要なこと、更に解糖系は骨芽細胞の分化と機能にとって主要なエネルギー源の1つであることから、Sirt1と解糖系の関連があることも報告されています。しかし、Sirt1が骨芽細胞における解糖系をどのように制御し骨の恒常性に影響を与えるのか、その基本的なメカニズムについてあまり研究されていません。そこで筆者らは、タモキシフェン誘導性Col1a-cre/ERT2 Sirt1 cKOマウスを用いて出生後にSirt1を欠損することで、Sirt1が骨芽細胞における骨の恒常性の維持をするメカニズムの解明を試みました。

Col1a-cre/ERT2 Sirt1 cKOマウスは大腿骨遠位部において海綿骨と皮質骨は減少していました。また、Col1a-cre/ERT2 Sirt1 cKOマウスでは骨芽細胞の骨形成能と破骨細胞の骨吸収能が低下しており、前者が後者を上回った結果、骨量が減少することが明らかになりました。そして、メタボローム解析により、cKOマウスにおける解糖系の代謝産物が顕著に減少し、SIRT1が解糖系に影響を与えることが分かりました。更に、アセチローム分析によって、cKOマウスの大腿骨と頭蓋冠の両方でアセチル化レベルが上昇する11種類のタンパク質を発見し、その内、共通のリジンのアセチル部位を持つ4つのタンパク質（GOT1, MDH2, ATP5O, ATP5b）を選出しました。４つのタンパク質の内、SIRT1と共局在するグルタミン酸オキサロ酢酸トランスアミナーゼ1（GOT1）に着目し、骨芽細胞におけるSIRT1ノックアウト、SIRT1過剰発現、SRT2104（SIRT1活性促進薬）やEX-527（SIRT1活性阻害薬）の処理、など様々な条件下で免疫沈降を行いGOT1のアセチル化レベルを検出しました。その結果、SIRT1がGOT1のアセチル化レベルに影響を与えることが明らかになりました。更に、Col1a-cre/ERT2 Sirt1 cKOマウスにGOT1阻害剤であるAOAを処理し、骨芽細胞の骨形成能を検討したところ、骨芽細胞の分化や石灰化は改善しました。

以上のことから、SIRT1がGOT1を脱アセチル化することにより、骨の恒常性を維持する為に骨芽細胞の代謝を調節する重要な役割を担うことを示します。 

GOT1はクエン酸回路や電子伝達系と関連があることは報告されていますが、本論文では解糖系への影響を検討しており非常に興味深いと思いました。GOT1を研究する上で代謝経路全体に着目すべきであり、自分の研究に活かすべきだと感じました。

感覚神経は求心的な機能を持ちますが、近年、遠心的な作用を及ぼすことも報告されています。破骨細胞の生理的機能の制御において、間接的な感覚神経の役割が注目されています。しかしながら、破骨細胞に対する感覚神経の直接的な影響に関する証拠は不足しています。そこで本研究では、感覚神経の機能性神経ペプチドとその骨への影響に焦点を当てました。まず、iTRAQという質量分析法を用いてAxoplasm（神経軸索の細胞質）のタンパク質を同定しました。次に、感覚神経が骨恒常性に及ぼす潜在的な影響を調べるため、マウスに、イオンチャネルであるTRPV1に対する強力なアゴニスト作用をもつRTX (resiniferatoxin) を投与して感覚過敏を誘導しました。感覚過敏マウスは、骨形成能の低下と骨吸収能の上昇による骨質の低下が見られました。さらに、感覚ニューロンと骨髄単球を共培養させたところ、破骨細胞形成が有意に増加したことから、感覚神経が破骨細胞形成を直接促進することが示唆されました。iTRAQで同定されたAxoplasmタンパク質のうち、破骨細胞の増殖と分化に関連する17のタンパク質から、感覚神経の遠心性機能、特に破骨細胞形成の制御において重要な役割を担うCyp40を同定しました。さらに、感覚ニューロンから放出されたCyp40が破骨細胞に取り込まれる経路について検討した結果、Cyp40は非エクソソーム機構を介して移動することが示されました。次に、破骨細胞分化に重要な役割を果たすRas/c-Raf/p-Erk シグナルの関与を調べたところ、Cyp40がRas/c-Raf/p-Erkを負に制御することがわかり、またその上流の芳香族炭化水素受容体(AhR)と相互作用することにより、AhRタンパク質活性を負に制御し、その下流のRas/c-Raf/p-Erk シグナル伝達を抑制してNFATc1が活性化することで、破骨細胞形成が亢進することが示唆されました。これらの知見は、感覚神経が破骨細胞に作用する新規メカニズムについて新たな知見を与えるものであり、Cyp40阻害が骨粗鬆症における骨質の改善や骨損傷後の骨修復を促進する戦略としての可能性を示唆します。

本論文では、感覚神経による破骨細胞形成への影響がTRAP染色等で目に見えてわかり、興味深かったです。また、骨吸収活性評価の実験は、蛍光強度を測定するだけで評価でき、非常に簡単で便利だと思いました。

Ptenおよびp53は、子宮内膜がんで最も頻繁に変異する腫瘍抑制遺伝子の2つです。しかし、他の組織に影響を与えることなく子宮内膜上皮細胞の条件付きおよび誘導性欠失ができるCre発現マウスモデルは存在しません。そこで、著者らは子宮内膜特異的かつ誘導性に遺伝子をKOする方法として、細胞透過性TAT-CREリコンビナーゼタンパク質の子宮内送達、子宮内膜異種移植、およびCRISPR/cas9技術を使用しました。TAT-CreやCRISPER/cas9を介したPten/p53の欠失から4か月後、ほとんどのマウスが高悪性度のEECおよびUCSを発症しました。UCSが上皮起源であることを検証するために、Pten/p53二重欠失上皮細胞を野生型の間質細胞および子宮筋腫細胞と混合し、免疫不全マウスに皮下移植したところ、高い核多形性と転移性を示すUCSが発症しました。また、qRT-PCR解析により、Pten/p53の二重欠失がEMTを引き起こすことが示されました。

本研究では、Tat-CreおよびCRISPR/Cas9技術を使用して、EC組織病理学におけるPtenおよびp53欠損の役割を明らかにしました。しかし、これら2つの技術は補完的であり、著者らは将来的に、更に強力なツールを構成する必要があると考えています。

GSDMDは炎症性細胞であるパイロトーシスやサイトカイン放出に関わるタンパク質です。炎症性カスパーゼによって切断されるとGSDMD-NTとなり、大きな膜貫通孔を形成することが知られています。しかし、本論文ではGSDMDの細孔形成にはCys191のパルミトイル化が重要であり、非切断のGSDMDでもパルミトイル化によって細孔を形成できることが報告されました。

GSDMDのパルミトイル化はインフラマソーム刺激やROSによって増強され、パイロトーシスを誘導します。パルミトイル化部位C191を変異させると細胞死の誘導が阻害されました。また、切断に障害を与えるD275を変異させると、切断型と比べ効率は下がるものの、パルミトイル化後に細胞死を誘導しました。これらパルミトイル化反応はパルミトイルトランスフェラーゼであるADHHC5/9によって媒介されることが示唆されました。

本論文の内容はこれまでの定説を覆すものでした。非定型ゴーハム病はGSDMD D275H変異による切断障害が原因であると考えられていますが、孔形成以外の理由にも新たに着目すべき点が生まれました。マクロファージ内でパルミトイル化が起こるメカニズム、非切断型が切断型と比べて効率が下がる理由について今後注目していきたいと思います。

骨膜と汗腺は生後早期にアドレナリン作動性からコリン作動性へと神経が変換するCholinergic switchが行われます。IL-6ファミリータンパク質とその受容体gp130がこの変換に寄与することが知られていましたが、議論がなされていました。また、これまで交感神経は、骨異化作用を持つことが報告されていますが、骨膜のコリン作動性神経への変換による骨への影響や骨におけるコリン作動性神経の影響についても良く分かっていませんでした。本研究では、骨のコリン作動性神経の役割について着目しています。成体マウスには、コリン作動性神経マーカーであるVAChTが観察されており、これらは生後早期における交感神経除去剤の6-OHDAを投与することで骨幹部に見られなくなったことから、骨内コリン作動性神経は、交感神経由来であることが明らかとなりました。交感神経をコリン作動性神経へと変換する因子を探索するために、いくつかのIL-6ファミリータンパク質に着目しました。頸部交感神経から神経を採取し、IL-6を加えると、コリン作動性神経遺伝子の上昇、アドレナリン作動性神経遺伝子の減少が見られました。さらに、近接ライゲーションアッセイにより、IL-6の供給源を解析すると、骨膜近傍の骨格筋由来であることが明らかとなりました。次に、コリン作動性神経の維持に重要な全身Gfra2欠損マウスでの表現型を解析すると、メスマウスにおいて有意なコリン作動性神経の減少を伴った、骨量の減少が見られました。これは、破骨細胞に影響がなかったものの、骨細胞の形態異常とSost遺伝子の上昇が観察されました。この効果について、GFRα2-Nrtnシグナルを検討すると、骨細胞へのNrtn作用によって、骨細胞の生存が改善されました。また、Nrtn供給源について免疫染色で解析すると、コリン作動性神経由来であることが分かりました。最後に、IL-6は運動によって発せられるため、運動の効果を検討すると、運動によってコリン作動性神経の増加と骨量の増加を確認しました。一方で、IL-6を阻害して運動を行うと、これらの効果は見られなくなりました。以上のことから、運動によって上昇するIL-6が、コリン作動性神経の変換を上昇させ、これによるNrtn因子の供給が骨細胞の生存に関わっていることを明らかにしました。

骨膜の神経が特殊であることを学びました。運動による筋骨-神経連関は、インパクトが大きいと思います。また、今年のBone Biology Forumでは、佐藤信吾先生も骨膜の神経について発表されており、骨膜神経の興味が深まっています。

転移はがんによる死亡の主な原因であり、腫瘍の種類によって数か月から数十年続く休眠期を経て発症することが多いです。休眠中のがん細胞は、NK細胞活性化リガンドやMHCクラスI分子を低下させ、免疫を介した標的化を回避しています。一方、休眠から覚醒した細胞は再度、免疫監視を受けやすくなります。そこで、本論文では肺腺がん転移モデルを用いて、休眠中の転移進行抑制の免疫機構を明らかにしました。腫瘍固有の免疫調節因子の遺伝的スクリーニングによって、インターフェロン遺伝子刺激因子STINGががん細胞の休眠からの覚醒を抑制している因子として見つかりました。STINGの活性化は、細胞周期に再進入した転移前駆細胞で増加しており、転移した腫瘍細胞におけるSTINGのプロモーターやエンハンサーの過剰なメチル化や、TGFβに応答して休眠状態に再進入する細胞でのクロマチン抑制によって低下します。肺腺がんのマウスモデルにおいて、STINGアゴニストを投与すると、T細胞やNK細胞依存的に休眠細胞の転移再出現が抑制されました。したがって、STINGは休眠状態の転移の進行に対するチェックポイントとなり、腫瘍再発予防に対する治療的標的になり得る戦略を示しています。

発見したがん転移に関する因子STINGががん治療に繋がるという点が興味深かったです。この論文をはじめ、休眠転移やSTINGアゴニストに関する論文が増えてきているため、これらのトピックに注目していきたいです。

筋ジストロフィーの治療法の一つとして、筋肉に遺伝子を導入する方法があります。しかし、体内に広がるすべての筋肉に対し、筋肉特異的に遺伝子を導入することは非常に難解です。

今回の論文では、エンべロープウイルスであるVSVに注目し、筋肉の発生過程で細胞が融合する過程を調節するMyomakerとMyomergerの２種類の分子を融合因子として利用したレンチウイルスを開発しました。

この新しいレンチウイルスを用いて、生後２週間の筋ジストロフィーモデルマウスに、２週間ごとにマイクロジストロフィン遺伝子（小型化ジストロフィン）を導入した結果、全身の筋肉の20%から40%にジストロフィンが発現し、筋ジストロフィーの症状を緩和することが示されました。この送達方法は、筋肉への効果的な遺伝子送達の手段となることが期待されます。

今回の論文の内容は、様々な遺伝性筋疾患に応用可能な画期的な新規治療法となる潜在性をもつため、非常に興味深い内容でした。また、筋肉の病態評価を様々な観点から行っている点も、自分の研究に役立てたいと考えています。

非感染性の慢性炎症は、老化の重要な特徴です。今回の論文では、加齢にしたがってIL-11レベルが上昇すること、IL-11を遺伝学的及び薬理学的に阻害することで老化のスピードが遅くなり、寿命が延長することが示されました。

著者らはまず、肝臓、内臓脂肪、及び腓腹筋において、加齢とともにIL-11の発現が上昇し、IL-11の下流シグナルで、老化に関わることが知られているERK-AMPK-mTORC1軸が制御されることを示しました。Il11ra1またはIl11の欠損マウスでは、雌雄ともに加齢による肥満、代謝低下、老化マーカーの上昇、及びフレイルから保護され、テロメア長とmtDNAコピー数の改善が見られました。また、75週齢からのIL-11中和抗体の投与により、100週齢での代謝や筋機能が改善し、フレイルが減少しました。このメカニズムの一つとして、IL-11中和抗体により、内臓脂肪では白色脂肪のベージュ化に重要であるUcp1の発現が顕著に上昇していることを見出しました。実際に、内臓脂肪ではIL-11中和抗体の投与がベージュ化マーカーの発現を上昇させ、白色脂肪細胞のサイズを減少させました。最後に、IL-11中和抗体投与により、オスでは22.5%、メスでは25%平均寿命が延長することが分かりました。また、肉眼で観察された腫瘍はIl11ノックアウト又はIL-11中和抗体投与により減少することが分かりました。

今回の論文では、さまざまな手法による老化の評価方法を学ぶことができました。特に、qPCRによるテロメア長とmtDNAコピー数の定量方法が勉強になりました。また、２年齢のIl11ノックアウトマウスの毛並の良さと、IL-11中和抗体により寿命が20%以上延長した結果が印象的でした。一方で、今回の結果から、加齢によってIL-11レベルが上昇するメカニズムや、IL-11が全身的に影響を与え、寿命を延ばしたメカニズム、IL-11の生理学的な意義など、新たな疑問が多く提起され、さらなる研究が期待されます。

微生物叢は、多様な代謝産物の産生を介して宿主の生理機能や疾患を調節しますが、そのタンパク質標的や作用機序には不明な部分が多く残っています。

今回、光親和性レポーターを用いてケモプロテオミクスを行ったところ、腸内細菌叢の代謝物であるインドール-3-酢酸（IAA）が、代謝酵素やトランスポーターなどの他に、オーファンGPCRであるGPRC5Aと相互作用することが示唆されました。また、PRESTO-Tangoを用いることで、インドール代謝物の中ではトリプタミン（TA）のみがGPRC5A-βアレスチンのリクルートを活性化させることが分かりました。GPRC5Aシグナルを活性化する微生物種について調べたところ、Ruminococcus gnavus, Morganella morganii, Enterococcus faeciumなどの脱炭酸酵素による、TAやフェネチルアミンといった芳香族モノアミンの産生が重要であることが示唆されました。また、GPRC5Aのより強力なアゴニストを探索したところ、合成芳香族モノアミンである7-フルオロトリプタミン（7FTA）が、GPRC5AのシグナルをTAの約５倍強力に誘導することが分かりました。最後に、GPRC5Aをノックアウトした大腸がん細胞HT-29を作製し、RNA-seq解析を行ったところ、GPRC5Aの発現が、がんシグナル経路や細胞代謝の調節に関与することが示唆されました。

今回行われたケモプロテオミクスの手法は勉強になりました。また、TAはAhR（芳香族炭化水素受容体）のリガンドとして働くことが知られていますが、今回の論文では、ADRA2AやDRD2, HTR4といった複数の受容体にβアレスチンをリクルートすることが示されました。Discussionでは、TAがGPRC5Aのアゴニストとしてそれほど強力ではない可能性が言及されていましたが、GPRC5A以外にも複数の受容体シグナルを活性化させるTAが、骨代謝において担う機能を調べることは興味深いと思いました。

Schnurri-3-/- マウスは、白色脂肪組織 (WAT) の褐色化の増加によってグルコース恒常性とインスリン感受性が改善し、高脂肪食誘導性肥満 (DIO) に抵抗性を示します。骨芽細胞特異的Shn3 KOマウス (Shn3Osx) と脂肪細胞特異的Shn3 KOマウス (Shn3Adipoq)を作製した結果、 Shn3Adipoq マウスではなくShn3Osx マウスがShn3-/- マウスで見られたDIO抵抗性の表現型を示しました。このことからShn3-/- マウスのDIO抵抗性は骨格に起因する表現型であることが示唆されました。

In vitro でShn3f/f の脂肪細胞をShn3Osx またはShn3f/f の骨芽細胞と共培養した結果、Shn3Osx の骨芽細胞と共培養した脂肪細胞はcontrolと比較してベージュ脂肪細胞マーカー遺伝子の発現が高くなっていました。また、In vivo で、WTのWATをShn3Osx またはShn3f/f に移植して4週間後に取り出した結果、Shn3Osx に移植されたWATの方がControlと比較して褐色化が進んでいました。以上より、in vitroとin vivoの両方の系でSHN3を欠損した骨芽細胞が脂肪細胞の褐色化を促進することが示されました。

筆者らは骨芽細胞によって分泌されShn3 制御下でWATの褐色化を調節する因子としてSLIT2のC末端フラグメント (SLIT2-C)を同定し、骨芽細胞が高脂肪食に曝されている期間に全身を循環するSLIT2-Cの主要な供給源であることを見つけました。最後に、筆者らはrAAV9-amiR-Shn3 を用いてShn3発現を抑制したマウスが、インスリン感受性の減少やDIO抵抗性を示すことを見つけました。

まとめると、筆者らは本研究で骨芽細胞におけるSHN3のSLIT2-C産生制御を介した新しい骨-脂肪シグナル伝達軸を確立し、骨粗鬆症とメタボリックシンドロームの両方に対処できる可能性のある治療標的を示しました。

脂肪細胞特異的にKOしても脂肪細胞が小さくならなかったのに、骨芽細胞特異的にKOすると脂肪細胞が小さくなっていたのが興味深いと思いました。Col1a1-CreでDullardを欠損させたマウスで脂肪に変化があるか気になりました。

KRAS変異は約90%のPDACで見られるドライバー変異です。KRAS変異阻害剤は初期では抗腫瘍活性を示しますが、その後腫瘍は再発します。著者らは、がん関連線維芽細胞CAFを調べ、CAFがシグナル伝達物質AktおよびErkを活性化することを見出しました。AktおよびErkはERBB2/3の主要な下流標的であり、ERBB2/3のリガンドであるNRG1がCAFで発現していることから、KRAS変異非依存的な細胞増殖が引き起こされるメカニズムとして、CAF由来NRG1がERBB2およびERBB3受容体型チロシンキナーゼを活性化することを明らかにしました。ERBB2/3またはNRG1の欠損によって、KRAS変異非依存的な増殖は阻害され、KRAS変異阻害剤との併用でこの効果は増強します。本研究結果は、PDAC患者におけるKRAS変異阻害剤の有効性を向上させることが期待されます。

【感想】

KRASG12DやKRASG12Cを標的とした分子標的薬の有効的な使用法が明らかにされることは、個人の遺伝子異常に対応したテーラーメイド医療の質を非常に向上させると思いました。ERBB2/3の発現が過剰だったことから、NRG1やERBB2/3を標的とした分子標的薬の膵臓癌に対する治療有効性に関心を持ちました。

膵管腺がん（PDAC）では、上皮系と間葉系のがん細胞集団が見られます。PDACの細胞不均一性は、疾患サブタイプの特定において重要な特徴ですが、異なるPDAC亜集団が相互作用する仕組みや分子機構については、完全には理解されていません。本研究では、BMP阻害因子であるGrem1がヒトとマウスで膵臓がんの細胞不均一性の重要な調節因子であることを明らかにしました。

マウスで樹立されたPDACでGrem1を不活性化すると、数日以内に上皮系から間葉系のPDAC細胞への転換（EMT）が引き起こされ、上皮系PDAC亜集団の維持には持続的なGrem1活性が必要であることが示唆されました。対照的に、Grem1を過剰発現すると、間葉化したPDACがほぼ完全に上皮化しました。

機構としては、Grem1は間葉系PDAC細胞で高発現しており、隣接する上皮系PDAC細胞のBMPシグナル伝達経路を抑制することによって、上皮間葉転換転写因子のSnail とSlugの発現を抑制し、EMTを阻害します。さらに、Grem1とBMPは上皮系と間葉系の細胞間で負のフィードバックループを形成し、持続的なパラクリンシグナル伝達パターンでPDACの浸潤を制御することが示唆されました。

研究に用いる膵臓がんモデルマウスの作製方法やメカニズム解明の手法について大変勉強になりました。膵臓がんにおいて、私が着目している遺伝子がBMPシグナルに関与している可能性があるため、この論文を参考に研究の遂行に努めたいと思いました。

性的二型性組織は、性ホルモンによって制御される細胞によって形成されます。本研究では、エストロゲンなどの性ホルモンがどのように骨再生を制御しているのかを探るため、若年成体の雄、雌、卵巣摘出（OVX）マウスの骨折修復を解析しました。

まず、性ホルモンがマウスの骨折治癒に影響を与えるかどうかを調べるために、それぞれのマウスにピン固定された大腿骨を骨折させたところ、偽手術（Sham）マウスと雄マウスでは、OVXマウスに比べて大きいカルス（仮骨ともいう）が形成され、雄マウスとShamマウスを比較すると、Shamのカルスでは骨量と機械的強度が有意に減少していたことから、骨癒合は性的二型性を示す可能性があり、骨格再生は雌マウスの卵巣機能に依存していることが示唆されました。

筆者らの先行研究では、マウスの骨格幹細胞（mSSC）系譜と、骨折修復におけるその直接的な機能が明らかにされており、mSSCを枯渇させると、カルス形成が有意に減少し、骨折治癒が抑制されることを示されています。

そこで筆者らは、OVXマウスにおける骨治癒障害が、mSSCおよびその下流の骨・軟骨・間質前駆細胞（mBCSP）の数の減少によるものかどうかを調べました。その結果、骨折後のShamマウスに比較してOVXマウスのmSSCおよびmBCSPは有意に減少したことから、mSSC活性が雄マウスと雌マウスで異なる制御を受けており、特に、OVX環境に対する雌mSSCの細胞外応答は、増殖能と骨形成分化能を低下させ、OVX骨治癒障害の機序を提示する可能性があります。

筆者らは、卵巣摘出後のmSSCを介した骨格再生における変化は、エストロゲン依存的であると仮定し、OVX 骨折マウスにエストラジオール（E2）を持続投与した結果、完全にレスキューされました。しかし、精巣摘出（ORX）マウスに同様の処理をしても有意な変化は得られませんでした。

エストロゲン受容体依存性のSSC活性が、ヒトにおいても保持されているかどうかを調べた結果、Esr2（エストロゲン受容体２）の発現は閉経前女性に比べて閉経後女性および男性で減少していることがわかり、閉経後女性もE2濃度の増加に伴ってコロニー形成能（CFU）レベルと骨形成能の増加が見られました。

また、ESR2 KO mSSCにE2を投与しても反応しなかったことから、E2がSSCの活性を直接刺激する可能性があります。そこで、高度に局在化し、時間的に制御されたE2の送達が、OVX環境における骨折修復を改善しうるかどうかを検討した結果、局所的E2投与によって骨形成が増強され、SSCの増殖・骨形成能が増大することが示唆されました。

従って、エストロゲンを充填したPLGAナノ粒子によるSSCsの局所刺激は、骨折治癒から歯科インプラントに至るまで、様々な臨床場面において、女性の局所骨治癒を促進するための容易に適用可能な戦略であると考えられます。

感想

今回は、マウスへのE2の全身性の持続的投与と、局所的かつ一時的な投与をおこなっており、ホルモン療法の副作用に対する対策を取っていたり、OVXだけでなく老齢マウスを用いた自然閉経での治療効果も確認していて、穴のない実験をしていると思い、勉強になりました。また、それぞれの実験から何を調べたいのか、まだ勉強不足な点も多かったため、これから様々な実験の意義についても調べようと思います。

【概要】

筆者らの先行研究では、骨細胞におけるカルシウム/カルモジュリン依存性キナーゼ2(CaMKII)の役割とスクレロスチンの翻訳後制御の役割を確立しました。

本研究では、骨芽細胞と骨細胞における最も豊富なタンパク質であるデルタとガンマの条件付き共欠損（ Ocn-cre:Camk2d/Camk2g ダブルノックアウト(dCKO)）マウスを作製し、表現型について評価しました。

結果として、Ocn-cre:Camk2d/Camk2g ダブルノックアウトマウスは、重度の骨減少症および機械的特性が著しく低下した骨格の脆弱性を示しました。

また、dCKOマウスの骨芽細胞と破骨細胞の活性を解析したところ、controlと比べて、骨芽細胞の活性は低下、破骨細胞の活性は増加、破骨細胞分化を促進させるRANKLとその囮受容体であるOPGの比率は減少しました。

更に、リン酸の血中濃度が低下、FGF23レベルが増加したことから、表現型がFGF23関連低リン血症骨軟化症に類似していることが明らかになりました。

CaMKIIはニューロンや膵臓β細胞におけるタンパク質の輸送と分泌に重要な役割を担っていることは既知ですが、骨芽細胞における役割が未知な部分が多く、さらに解析する価値がありそうです。将来的には、Camk2d/2g dCKOマウスを用いて機械的負荷の役割を調べる予定のようです。

【感想】

CaMKⅡの基本的な役割を知ることが出来たこと、また新しい解析方法に触れることができ、勉強になりました。CaMKⅡの骨芽細胞と骨細胞での役割が解明されることを心より願っています。

完全な機能を持つ多核の骨吸収破骨細胞の形成には、単核破骨細胞前駆体の細胞融合が必須です。しかし、破骨細胞の融合を制御する正確な分子メカニズムは完全には理解されていません。本研究では、破骨細胞融合過程の初期段階において、RANKLを介したCaspase-8の活性化が起こることを特定しました。

scRNA-seqに基づく解析により、破骨細胞前駆体から成熟多核破骨細胞への分化過程において、アポトーシス機構の一部が活性化することが示唆されました。その後の破骨細胞前駆体の特性評価により、RANKLを介してCaspase-8が活性化されると、下流のCaspase-3が活性化されて原形質膜に移行し、スクランブラーゼXkr8を活性化することが確認されました。活性化Xkr8は、原形質膜の内葉に局在するホスファチジルセリンを外葉に転移させ、これを介して破骨細胞前駆体の細胞融合を促進します。in vitroでは、カスパーゼ-8の薬理学的阻害や遺伝的欠失により、破骨細胞の融合と骨吸収が妨げられることが確認されました。in vivoでは、単核破骨細胞前駆体特異的Caspase-8 cKOマウスにおいて骨量増加が確認されました。本研究は、破骨細胞機能を制御する新規経路の特定と、病的骨吸収を特徴とする疾患に対する新たな治療戦略の確立に繋がることが期待されます。 

本論文から、カスパーゼ経路が破骨細胞機能の制御に関わることが示唆されました。研究対象であるGsdmdはカスパーゼ経路に関与しており、ここから派生して、Gsdmdが破骨細胞の細胞死、破骨細胞機能の制御に関与する可能性が考えられました。実際に、炎症時、マクロファージでGsdmdをKOすると、パイロトーシスではなくアポトーシスが起こる報告を発見しました。今後はこれを参考に、Gsdmdが破骨細胞分化に関与するか調べていこうと思います。

SMN1遺伝子のホモ接合性欠失や変異により発症する神経変性疾患脊髄性筋萎縮症 (SMA)の重要な特徴として神経筋接合部(NMJ)の障害が挙げられます。複製依存性ヒストンmRNAの3’末端プロセシングにおいて機能するU7低分子リボ核タンパク質 (snRNP) の集合におけるSMNタンパク質の活性が、NMJの完全性に必要であることを示しました。U7特異的Lsm10及びLsm11タンパク質を共発現させたところ、U7 snRNP集合が選択的に増強され、ヒストンmRNAプロセシングの欠陥が補正されました。またNMJ脱神経、シナプス伝達の低下、骨格筋萎縮などの構造的及び機能的異常をレスキューしました。さらに、U7 snRNP機能障害は、SMAマウスの脆弱な筋肉を神経支配するNMJにおいてシナプス構成タンパク質Agrinの選択的喪失を引き起こします。これらの結果は運動ニューロンと筋肉間の機能的なシナプス結合の維持におけるヒストン遺伝子調節の役割を示唆します。

SMAでもニューロン間で影響の出方に差が出るのが興味深かったです。NMJの写真がかなりきれいだったのが印象的でした。胚の実験でもアグリンやSMNについて調べてみたいなと思いました。

1. Carol Wise-Variants associated with adolescent idiopathic scoliosis perturb an estrogen-sensitive Pax1-Col11a1-Mmp3 signaling axis

思春期特発性側弯症（Adolescent idiopathic scoliosis；AIS）は女性に多く発症し、世界人口の1.5~3%の有病率となっています。AIS患者のマトリソームについてゲノムワイド関連解析を行うと、MMP14とCOL11A1の1塩基多型がAISと関連することを見出し、さらに女性においてはCOL11A1が顕著でした。COL11A1は基質分解酵素のMMP3を制御することが知られていましたので、Col11a1を欠損させた軟骨細胞においてMMP3の発現を検討すると、MMP3の発現増加が見られました。AIS関連のCol11a1変異を軟骨細胞に導入すると、欠損と同様にMMP3の発現増加が見られました。また、以前に発表者らはPax1不全もAISの原因であることを報告しており、Pax1欠損マウスでのCol11a1の発現を確認しました。Pax1欠損マウスでは、Col11a1の発現が低くなっており、一貫する結果が得られました。次に、AISにおいて性差が確認されていることから、エストロゲンシグナルについて検討するため、Esr1, 2を軟骨細胞においてRT-qPCRを行うと、Esr2の発現が高いことが見られました（Yu H et al,. eLife. 2024）。そこで、Esr2をノックダウン（KD）し、Col11a1の発現を確認すると、KDで上昇することが見られ、MMP3の発現低下も確認しました。Col11a1とEsr2を同時にKDすると、Col11a1単独のKDで上昇するMMP3が見られなくなりました。以上のことから、Esr2を介したエストロゲンシグナルは、Col11a1の発現を抑制し、Col11a1低下によってMMP3が上昇することで、AISの発症とその性差に関わっていることを明らかにしました。

GWASデータを用いた遺伝性疾患であるAISの性差の原因などを明らかにしており、難病の病態生理を理解する研究となっています。

2. Ronald V. Swanson-TYRA-300 Demonstrates Significant Increases in Growth and Bone Length in a Mouse Model of FGFR3-Related Skeletal Dysplasia

線維芽細胞増殖因子受容体であるFGFRは４種類あり、それらFGFR阻害剤は、抗腫瘍薬で用いられています。しかし、FGFR1阻害による高リン血症やFGFR2阻害による皮膚・爪の毒性、FGFR4阻害による下痢といったような副作用が見られています。FGFR3の機能獲得型変異では、低身長を呈する軟骨無形成症を発症するため、FGFR3を選択的に阻害する医薬品が求められます。本研究では、FGFR3を選択的に阻害する新規医薬品としてTYRA-300を開発しました。この阻害剤のIC50を検討すると、FGFR3のみ活性を持つことが分かりました。軟骨無形成症モデルのFGFR3変異マウスに対して、TYRA-300を投与すると、頭蓋骨の正常な発達や二次骨化中心の形成、Col10a1で標識される肥大軟骨細胞の正常な発達など、成長障害の改善が見られました。

現在、臨床試験第2相に移っており、FGFR3による成長障害や腫瘍への新規治療薬として期待されます。

3. SHAWN HALLETT-Conditional Deletion of Runx2 in Cranial Base Chondrocytes Causes Midfacial Hypoplasia 

頭蓋骨は、軟骨結合といくつかの骨が形作っていますが、それらを制御する重要な分子経路は良く分かっていません。RUNX2の不全は頭蓋骨縫合早期癒合症を引き起こし、マウスにおいても頭蓋骨の異常が見られています。本研究では、Fgfr3-CreERT2を用いたRunx2の欠損を起こし、頭蓋骨の軟骨結合の表現型を解析しました。cKOマウスでは頭蓋骨のサイズが小さくなっており、軟骨結合部の骨化、軟骨の乱れを観察しました。細胞増殖の低下とアポトーシスの上昇も確認されました。肥大軟骨を観察するCol10a1に対する免疫染色を行うと、肥大軟骨細胞の増加が見られました。肥大軟骨細胞はRANKLを分泌することが知られているため、破骨細胞について観察すると、破骨細胞数の顕著な増加と骨芽細胞とのカップリングによる軟骨結合の異常が見られました。Runx2はFgfr3の発現を調整することが知られているため、FGFR3の発現を確認すると、cKOでFGFR3の発現上昇が見られました。これに伴って、FGFR下流のシグナルの増加が予想され、実際にErkシグナルの上昇が観察されました。以上のことから、軟骨結合におけるFgfr3陽性細胞は、Runx2によってFGFR3を調整することで、そのシグナル伝達を抑制し、軟骨結合の肥大軟骨細胞化とそれに伴った骨化を抑制することによって、正常な頭蓋骨形成に寄与していることが明らかとなりました。

頭蓋骨の発達にも重要なFGFR3とそれを制御するRunx2の働きが示されました。

過剰なFGFR3のシグナル伝達による頭蓋骨の異常について明らかにすることは、RUNX2変異やFGFR3変異における頭蓋骨形成不全への新規治療法の一旦を担うと思われます。また、頭蓋骨の発生について勉強する良い機会になりました。

4. Nicha Tokavanich-The Role of Salt Inducible Kinases in Alveolar Bone Development

骨形成促進薬であるPTHの下流では、cAMP-PKA経路が活性化されます。これによって、SIKと呼ばれるキナーゼが抑制されることが知られています。発表者らは以前、Sik2,3のKOがRANKL発現の抑制とSost発現の促進を伴った、骨量の増加を示したことから、SIK阻害剤が骨粗鬆症治療薬に応用できることを示唆しています。これまで、長管骨の表現型を観察してきていましたが、臼歯を支えるために重要な歯槽骨については不明でした。本研究では、Ubiquitin-CreERT2; Sik2, 3のKOが歯槽骨形成の遅延を示すという、長管骨の表現型とは反対であることが分かりました。歯の直下と歯の間における歯槽骨の骨化遅延、破骨細胞数の減少など、同様のマウスで見られた長管骨の表現型とは正反対でした。

部位によって作用が異なる点は興味深いと思いました。現在開発がなされているSIK阻害剤の歯における安全性について、さらに検討する必要があることが示唆されると思います。

5. Omar Al Rifai-Nfil3, A Novel PTH Target Involved in Bone development

PTHは間欠投与で、骨形成を促進することが知られています。そこで発表者らは、RNA-seq解析によって、骨芽細胞と骨細胞におけるPTH作用後の遺伝子発現を確認すると、Nfil3が両者でPTHによって上昇していることを見出しました。Nfil3はIL3によって活性化される転写因子で、特定の遺伝子の発現を抑制または活性化させることが知られています。Nfil3のChIPアッセイを行うと骨芽細胞において、Sp7、Runx2、Alplなどの骨形成関連遺伝子のプロモーターと結合していることが分かりました。骨芽細胞のNfil3を欠損させると、分化および石灰化の低下を観察しました。次にOsteocalcin-Cre; Nfil3 fl/flのcKOマウスを用いて、生体内における機能を検討すると、海綿骨の骨量に変化は見られませんでしたが、皮質骨において骨量の減少や断面積の低下、機械刺激への抵抗性が減弱していることが見られました。骨芽細胞、骨細胞マーカーの減少と血清の骨形成マーカーであるP1NPの低下も確認され、Nfil3が骨形成に重要な役割を持つことが明らかにされました。

PTHの標的遺伝子を同定し、骨形成促進薬の標的として開発を進めることは、当研究室でも行われています。本研究では、骨細胞でも上昇した遺伝子であるNfil3をピックアップし、その骨形成促進の機能を示しました。これらの研究は、新しい骨形成医薬に繋がり、骨粗鬆症治療薬などに応用されることが期待されます。

N6-メチルアデノシン（m6A）は、RNA代謝の多様な側面を制御する転写後RNA修飾です。運動神経におけるm6Aの機能を検討するために、細胞とマウスでm6Aメチル基転移酵素様3（METTL3）を欠損させました。

胚性幹細胞由来の運動神経細胞におけるMETTL3の欠損により、細胞の生存と神経突起伸長が減少しました。また、コリン作動性ニューロン特異的METTL3欠損マウスでは、神経細胞の消失と筋肉の脱神経を伴い、運動行動の進行性低下を示しました。m6Aの標的の中で、筆者らはTDP-43を同定し、その発現がエピトランスクリプトームの制御下にあることを発見しました。

したがって、m6Aシグナル伝達の障害は運動神経のホメオスタシスを破壊し、TDP43の調節不全を介して神経変性を引き起こすと考えられます。

RNA修飾の異常で、マウスの運動機能に大きな影響が出るという点が興味深かったです。行動実験や組織の解析、神経細胞へ分化させる実験など、自分の研究に活かせることが多く、勉強になりました。

[実験の概要]

自律神経系は骨代謝の調節に重要な役割を担っており、交感神経の活性化は骨吸収を促進し、骨形成を阻害します。筆者らは卵巣摘出（OVX）マウスにおいて、骨折が交感神経の活動状態の促進、破骨細胞による吸収を促進、骨芽細胞形成を低下、結果として全身性の骨量減少を促進することを発見しました。また、ノルエピネフリン(ノルアドレナリンと同じ)はアドレナリンβ受容体(βAR)シグナル伝達を介して骨芽細胞において、副甲状腺ホルモン(PTH)が誘導する概日時計遺伝子Bmal1とRunx2の発現の阻害し、破骨細胞分化誘導因子RANKLの発現を促進することによってPTHによる骨同化効果を阻害することが分かりました。また、その効果はβ遮断薬であるプロプラノロールによって回復することを実証しました。この修復効果はPTHまたはプロプラノロール単独投与より優れています。この結果により、PTHとプロプラノロールの併用が骨粗鬆症患者の全身の骨量減少と再骨折リスクの低減に有効である可能性が示唆されました。

[感想]

骨粗鬆症性骨折後、骨量が減少することが興味深かったです。また、骨髄マクロファージにおける細胞培養実験も実験で取り入れてみたいと思いました。

概要

アポトーシス中の骨芽細胞(apoOBs)のマクロファージによるエフェロサイトーシスは、骨の恒常性維持のために重要です。apoOBsは、しばしば老化した骨髄で蓄積し、炎症反応と進行性の骨量減少を引き起こします。本研究では、老化したマウスのapoOBsはCD47を高発現しており、CD47-SIRPαチェックポイントを介してエフェロサイトーシスによる除去を回避していることが同定されました。CD47とSIRPαの発現は、SIRT6が制御するPol Ⅱ pausing (RNA ポリメラーゼがプロモーター近傍で停止すること)によって調節されており、老化したマウスでは、SIRT6を発現しているapoOBsが減少しました。SIRT6を欠損したapoOBsは、miRNAを搭載したアポトーシス小胞(apoVs)を放出し、マクロファージの動員を遅延させました。

Cre依存性のrAAVベクターによるSIRT6の送達と、EC-ExosによるSIRT6活性化剤の骨組織への送達は、apoOBs除去を促進し、老化関連骨量減少を改善しました。

まとめると、今回の発見は、今まで知られていなかった骨免疫と骨の恒常性の関係を明らかにし、また、SIRT6が制御するメカニズムの標的化は、老化関連骨疾患に対する有望な治療戦略になり得ることが示唆されました。

 感想

rAAVベクターを用いてCre依存的に目的遺伝子を過剰発現させる仕組みがおもしろいと感じました。免疫にもともと興味があったので、骨に関わる免疫チェックポイントの話を知ることが出来てよかったです。

破骨細胞を含む、骨格系の細胞の適切な機能は、系統特異的な転写因子の活性化だけでなく、細胞の代謝にも依存します。遺伝子発現と代謝は相互に調節し合っており、外部刺激に応答して代謝酵素の発現が変化すると、細胞の同化と機能を支えるために必要な、特異的な代謝プロファイルがもたらされます。

破骨細胞前駆細胞がその分化を駆動する特異的代謝プロファイルを有するかどうかを検討したところ、破骨細胞の分化初期に、RANKLシグナルが、c-MYCを介したセリン合成経路関連酵素PHGDHとPSAT1の転写を介して、一過性にセリン合成経路を刺激することが示されました。

次に破骨細胞でPHGDHをノックアウトしたところ、ノックアウトマウスの破骨細胞形成と活性が低下したことから、破骨細胞形成初期におけるセリン合成経路の活性化が、生後の骨の恒常性を制御することが示されました。

セリン合成経路由来のアミノ酸であるセリンとグリシン、そしてPHGDHによって生成されるNADHやPSAT1によって生成されるαKGのようなセリン合成経路由来の代謝副産物に注目し、セリン合成経路がどのように代謝的に破骨細胞の分化を制御しているかをさらに調べたところ、SSP由来のアミノ酸や一炭素単位、およびNADH代謝ではなく、αケトグルタル酸(αKG)の添加によって、PHGDノックアウトマウスの破骨細胞分化が正常化しました。

さらに、破骨細胞形成初期にGluからαKGを生成するPSAT1の重要性を調べたところ、PSAT1をノックダウンした破骨細胞においても、αKG処理によって破骨細胞分化が正常化しました。したがって、破骨細胞形成の初期段階は、その分化に必要なαKGを産生するセリン合成経路の誘導に依存していることが示唆されました。αKGは、TCAサイクルの基質として機能するだけでなく、酵素反応の一部としてαKGをコハク酸に変換するジオキシゲナーゼの大きなファミリーの共基質でもあります。

PHGDノックアウトマウスの骨において、TCAサイクルにおけるαKGの下流代謝産物であるコハク酸で処理しても破骨細胞形成障害は改善されず、また 2-オキソグルタル酸依存性ジオキシゲナーゼ（2OGD）活性が損なわれ、セリン合成経路由来のαKGは抑制性シグナルのH3K9Me3, H3K27Me3の脱メチル化を促進しました。

また、セリン合成経路由来αKGは、JMJD3が介在するNfatc1遺伝子座のH3K27脱メチル化をサポートするのに必要であり、それによってNfatc1の転写が促進され、その結果破骨細胞の分化が促進されることが示唆されました。

最後に、PHGDH阻害剤のNCT-503によってPHGDH活性を薬理学的に低下させたところ、骨芽細胞の数や活性に影響を与えることなく、破骨細胞を介した骨吸収の増加を完全に抑制しました。

したがって、本研究では、破骨細胞分化におけるRANKL誘導性の代謝-エピジェネティック関連機構を明らかにし、セリン合成経路が骨粗鬆症治療の新たな治療標的であることが示唆されました。

破骨細胞分化にセリン合成経路やヒストン修飾が関連しているとは考えたことがなかったため、セリン合成経路関連酵素やヒストン修飾の機能などを調べるきっかけとなり、非常に勉強になりました。また、破骨細胞分化の過程で、早期分化と後期分化に分けてαKGやセリン合成経路関連酵素阻害薬の機能を調べる実験では、早期分化と後期分化で大きく違いが出ていたことから、自分が実験を行う際にも、気になる化合物があればぜひ取り入れたいと思いました。

脊椎骨と大腿骨などの長管骨は、発生学的に由来が異なります。しかしながら、これまでに、脊椎骨と長管骨の骨格系幹細胞は、同じ特性を持っているのかどうかは不明でした。今回の論文では、従来の骨格系幹細胞集団からをさらに厳密に「未分化な」幹細胞を定義することができるエンビギンというマーカータンパク質が同定されました。骨格系幹細胞として分取されていた細胞群には、エンビギンという遺伝子が高く発現する細胞と低く発現する細胞が存在していて、エンビギンを低く発現している細胞が、より未分化性の高い骨格系幹細胞でした。さらに、脊椎骨由来の骨格系幹細胞を特徴づける遺伝子として、Pax1とZic1が同定されました。

骨は、がん細胞が転移する臓器で、患者さんの生活の質を著しく低下させます。前立腺がん、乳がん、肺がんどの様々ながんは、長管骨よりも脊椎骨に転移しやすい傾向にありますが、その理由は不明でした。今回、脊椎骨の骨格系幹細胞には、Mfge8という細胞外タンパク質が多く発現していて、そのMfge8が、がん細胞を引き寄せているということがわかりました。

最後に、ヒトでもマウスと同じように、脊椎骨に特有の骨格系幹細胞が存在していて、それらがやはりMFGE8を発現していて、がん細胞を引き寄せているということがわかりました。

今回の論文も、様々な角度から研究がなされており、骨格系幹細胞の研究を進めるうえで、非常に重要な論文になると思われます。Mfge8のノックアウトマウスは、骨代謝に影響が出なかったので、脊椎骨の骨格系幹細胞になぜMfge8が発現していて、がん細胞を引き寄せてしまうのかは、今後の研究課題です。また、骨格系幹細胞がどのように未分化状態を保ち、またどのように分化を開始するのか、その制御機構も今後の課題であると思われます。

非常に重要な論文なので、Extended Figuresを含み、すべての内容を説明しましたので、二回に分けて論文抄読会を行いました。。。

長時間の抄読会、失礼しました。

ALSは進行性の運動機能低下、呼吸不全、発症から3~4年での死に特徴づけられる神経変性疾患です。ALSのほとんどすべての症例で、運動ニューロンやその他の細胞において、RNA結合タンパク質であるTDP-43の核内消失や細胞質内封入が見られます。TDP43をノックダウンもしくは機能障害させたとき、ヒト運動神経において最も下方制御されている転写産物としてSTMN２が同定されました。STMN2の欠損がALSの病態形成に寄与しているという仮説を検証するために、恒常的STMN2 KOマウスと条件付きSTMN2 KOマウスを作製しました。STMN2の恒常的な欠損は、早発性の感覚・運動神経障害を引き起こし、運動が障害され、ALSで選択的に脆弱となる速筋疲労性運動単位の遠位神経筋接合部が劇的に変性します。しかし軸索や運動ニューロンは変性しない。またこれらの重症度はSTMN2用量依存的であり、STMN2 KOヘテロ接合体マウスは機能障害とNMJ脱神経を伴う緩徐進行性の運動選択性神経障害を示します。運動ニューロンにおけるSTMN2の選択的欠損は、同様のNMJ病態を引き起こします。

このように、今回の研究結果は、TDP-43病態によるSTMN2の減少がALS病態形成に寄与しているという仮説を強く支持します。

カイモグラフを用いて伸長速度を算出するのが興味深かったです。以前発表されていた方ではウェスタンブロットを用いて重合について調べていたので、目的は同じでも解析方法は一つではないことを学ぶことができました。また、NMJが形がわかるくらい、はっきり染色されていてきれいでした。軸索を数える実験や生存率を調べる実験などはすぐにできそうだと思いました。

本日のEnglish seminarは、European Congress of Pathology 2022より、「希少骨疾患の診断で遭遇する共通課題の克服」の演題を取り上げました。当研究室で扱う疾患について、実際の症例や、診断における課題など、臨床的な視点から説明されていました。

1. 進行性骨化性線維異形成症（FOP）は、骨格筋や筋膜などの線維性組織が進行性に骨化する希少疾患です。その原因として、ACVR1/ALK2遺伝子変異が報告されています。X線写真では異所性骨化が観察されます。異所性骨化は免疫反応によって誘発されるため、侵襲的な医療処置は避けられます。しかし、がんと誤診され生検が行われるなどの事例があり、FOPの認知度の低さが課題になっています。

2. FGF23はリン代謝に関わる重要なホルモンです。FGF23が関わる疾患には遺伝性のX染色体連鎖性低リン血症性くる病・骨軟化症（XLH）や、腫瘍性低リン血症性くる病・骨軟化症（TIO）があります。特にTIOは、他の骨疾患と誤診されやすく、長期にわたって症状が悪化した事例があります。臨床基準に従うだけでなく、病歴や遺伝的背景も考慮した診断が求められます。

3. 低ホスファターゼ症は組織非特異的アルカリホスファターゼ酵素(ALP)の遺伝子変異を原因とする遺伝病です。ALPの機能喪失により、ピロリン酸からリン酸が生成されなくなります。ピロリン酸が蓄積し、血中や組織中のリン濃度が低下することで、骨の石灰化が阻害されます。骨以外にも、筋力低下や腎障害など全身に多様な症状が現れるため、患者に合わせた適切な治療法が必要とされます。

膵臓がん細胞は、GOT1駆動型の特徴的な代謝経路を再配線します。GOT1は非悪性細胞では不要ですが、膵臓がん細胞の酸化還元バランスと増殖に不可欠です。GOT1とそれに関連する代謝ネットワークは、魅力的な治療の標的となる可能性があります。そこで、膵臓がんのこの特徴を利用し、GOT1ノックダウン細胞における標的代謝阻害剤の検査により、外因性シスチン、グルタチオン、および脂質抗酸化機構がGOT1阻害後の生存に不可欠であることが発見されました。

GOT1阻害は、シスチンの取り込み阻害剤または脂質抗酸化機構との組み合わせにより、酸化的、非アポトーシス的、鉄依存性の細胞死であるフェロトーシスを引き起こしました。そして、GOT1の阻害がミトコンドリアの酸化的リン酸化を阻害し、異化状態を促進することを突き止めました。その結果、細胞は遊離鉄を増やし、フェロトーシスに対する感受性を高めました。

フェロトーシスにおけるGOT1の役割は、他のいくつかの腫瘍においても以前からの研究の対象となっています。フェロトーシス感受性に影響を与える因子を明らかにすることは、がん治療への応用のために重要です。

変形性関節症（OA）は、軟骨の摩耗や骨棘の形成などにより疼痛を伴う疾患であり、80歳以上ではほとんどの人が経験するとされています。これまでの治療薬としては、対症療法のみであり、局所へのヒアルロン酸注入を行うこともありますが、根本的な治療は出来ず、疼痛・軟骨どちらに対しても効果的な治療薬が求められます。疼痛は、末梢の温感に関与するTRPチャネルや電位依存性Naチャネル（VGSC）が関わっていますが、軟骨におけるVGSCの研究はほとんどされていませんでした。

本研究では、OA患者でRNA-seqを行い、上昇してきたVGSCであるNav1.7に着目しました。軟骨細胞の電気生理学についても解析すると、Nav1.7は軟骨細胞におけるVGSCで最も活性が強いことが明らかとなりました。バイオロジカルな機能を検討するため、Nav1.7を軟骨または後根神経節特異的にKOするためのAgc1-Cre、Nav1.8-Creを使用してKOマウスを作成し、さらにOAを誘発させる半月板損傷（DMM）またはヨード酢酸投与（MIA）モデルを利用して解析しました。Agc1-Cre、Nav1.8-Creを用いたKOマウスは、OAの軟骨の改善、疼痛の改善が見られました。単独でCreを用いた場合、Agc1-Creでは、軟骨・疼痛のどちらも改善することが出来ましたが、Nav1.8-Creでは、軟骨の改善は見られないものの、疼痛の改善は見られました。さらに、Nav1.7の選択的阻害剤および臨床で用いられるNaチャネル阻害剤のカルバマゼピンを投与すると、OAの軟骨・疼痛を改善することを確認しました。次に、Nav1.7阻害によるOA改善の機序を調べるために、Nav1.7阻害後の軟骨細胞培養上清で分泌されたタンパク質（セクレトーム）を分子量100kDa以上、100kDa-30kDa、30kDa-10kDa、10kDa以下の4つに分けてそれぞれを培養軟骨細胞に与え、機能を調べると、100kDa-30kDaにおいて軟骨関連遺伝子の上昇、30kDa-10kDaでは破軟骨関連遺伝子の減少を確認しました。これらに寄与するタンパク質を同定するために、LC/MSを行うと、HSP70とMidkineがそれぞれで上昇しました。HSP70とMidkineを阻害すると、Nav1.7阻害剤投与で見られたOAの改善が見られなくなりました。Nav1.7阻害で上昇するHSP70とMidkineの産生機序を検討するため、Caイオン濃度に着目すると、Nav1.7阻害でCaイオンの濃度が細胞内で低下していることと、HSP70、Midkineの産生がされなくなることを見出しました。さらに、Caイオンを制御するNCXファミリータンパク質に着目し、siRNAを用いたNCX1を枯渇させると、Nav1.7阻害を行ってもHSP70とMidkineが生成されなくなりました。

以上のことから、Nav1.7阻害は細胞内のCa濃度を高くすることで、HSP70とMidkineを産生させ、OAの病態を改善させていることが明らかとなり、Nav1.7阻害剤がOA治療薬になることを示唆しています。

セクレトーム解析は非常に興味深かったです。軟骨細胞の分泌タンパク質でOA改善機能を持つものを同定し、それらのOA軟骨における機能と分泌されるメカニズムを示しており、きれいな結果であったと思います。カルバマゼピンを用いるなどの臨床応用を視野に入れた研究は、高いインパクトを持つと思いました。

ALS-FTDの神経病理学的特徴として、TDP43の核から細胞質への 局在変化と細胞質内異常凝集があります。TDP43は通常、核内でRNAのプロセシングに関わっています。今回のセミナーでは、ALS-FTDにおけるTDP43病態とオートファジーによる異常凝集の除去について述べられています。

動画の前半では、TDP43の局在の異常とRNAのプロセシング異常の相互作用について示されています。TDP43標的RNAの大部分にメチル化（m6A修飾）を 見出し、孤発性ALS剖検脊髄で広範なRNAの過剰メチル化を発見されています。

動画の後半では、オートファジー抑制因子であるMTMR5の神経細胞における役割について説明されています。神経変性疾患で蓄積する毒性のあるタンパク質を除去する治療法としてオートファジーの活性化が期待されていますが、神経細胞ではオートファジー誘導されにくいことが知られています。発表者らは、神経細胞でオートファジーを抑制しているMTMR5という脱リン酸化酵素を見出しました。MTMR5の欠損はTDP43のオートファジーによる分解を促進することが示され、神経変性疾患の治療につながることが期待されます。

今回の動画で、TDP43の役割に関する知識が深まりました。TDP43の局在の変化について、オートファジーに着目することも面白いと感じました。

膵臓癌は致死率の高い消化管癌であり、生存率は７％未満です。ゲムシタビンベースの化学療法は膵臓癌の治療選択肢の中心ですが、ゲムシタビン耐性という課題があります。そのため、膵臓癌とゲムシタビン耐性の根底にある分子メカニズムの理解を深める必要があります。

snoRNA（核小体低分子RNA）は、リボソームRNAやその他の細胞内RNAの転写後修飾と成熟に関与しており、最近の研究では、膵管腺癌（PDAC）、乳癌、大腸癌などの様々な癌において、snoRNAが発癌性の役割がある可能性が提唱されています。RRP9/U3-55Kタンパク質はU3snoRNA関連タンパク質ですが、膵臓癌の薬剤耐性におけるRRP9の役割は不明です。

また、IGF2BP1（インスリン様成長因子2ｍRNA結合タンパク質）は、胚発生や発癌において重要な役割を担っており、AKTシグナル伝達経路を介してPDAC細胞の増殖を促進することが示唆されています。しかしながら、膵臓癌におけるゲムシタビン耐性の促進におけるIGF2BP1の役割については報告されていません。　　　　　　　　　

そこで著者らは、RRP9の発現が膵臓癌で増加し、RRP9がIGF2BP1のin vitroおよびin vivoでゲムシタビン耐性を促進することを発見しました。その機序として、RRP9がIGF2BP1のDNA結合領域と相互作用することによりAKTシグナル伝達経路を活性化することを示しました。本研究はRRP9を標的とすることにより、膵臓癌の潜在的な治療戦略を提供する可能性が期待されます。

健常な肝臓では、門脈を介して腸管から侵入してきた腸内細菌や関連物質による炎症を防ぐことができますが、そのメカニズムについてはほとんど不明でした。本研究では、門脈付近のクッパー細胞が、腸内細菌などによって引き起こされる炎症から肝臓を保護することが明らかになりました。

著者らは、肝臓の生体イメージング技術を用いることで、門脈域では中心静脈域よりも炎症反応が抑制されていることを見出しました。このことから、それぞれの領域の細胞を蛍光標識により回収する技術を確立し、シングルセルRNA-seqを行ったところ、門脈域には抗炎症性サイトカインであるIL-10とスカベンジャー受容体であるMarcoを高発現するクッパー細胞の亜集団が局在することが分かりました。この高発現していたMarcoは、細菌を捕食するとともに、IL-10の発現を増強させました。また、Marco陽性のクッパー細胞は、二次胆汁酸のイソアロリトコール酸によって増えることが明らかになりました。最後に、Marco欠損マウスでは、原発性硬化性胆管炎様の炎症表現型がもたらされることが示されました。

以上の結果から、常在細菌が門脈近傍の免疫抑制性クッパ―細胞を誘導し、その結果、肝臓の入り口で過剰な炎症を防ぐことが示唆されました。本研究において、門脈近傍の免疫抑制性マクロファージによる生体防御機構が明らかになったことで、肝臓の炎症性疾患に対する予防や治療法の開発への応用が期待されます。

本日のEnligsh seminarでは、「破骨細胞における代謝とシグナル伝達」という2023年のアメリカ骨代謝学会の口頭発表の録画を視聴しました。これまでは、破骨細胞の分化に関し、転写因子やシグナル伝達に着目されてきていましたが、最近では、代謝に着目した研究が盛んに報告されるようになってきました。１番と２番の演題は、それぞれNature Metabolism、Nature Communicationsに論文が発表されています。

1

本研究により、破骨細胞におけるRANKL誘導性の代謝-エピジェネティック連関メカニズムが明らかになり、セリン合成経路依存的なα-ケトグルタル酸の合成がヒストンの脱メチル化とNfatc1転写に関連していることがわかりました。さらに、律速酵素であるホスホグリセリン酸デヒドロゲナーゼ(PHGDH)の阻害はエストロゲン欠乏による骨量減少を抑制することから、セリン合成経路の調節が骨粗鬆症の治療戦略として有望であることが示唆されました。

2

骨髄細胞における脱ユビキチン化酵素BRCA1関連タンパク質1（Bap1）の欠失（Bap1∆LysM）が、破骨細胞の機能を停止させるが、形成は停止させないことを発見しました。Bap1欠損破骨細胞は、シスチントランスポーターであるSlc7a11のプロモーターのユビキチン化ヒストンH2Aの占有を増強することにより、その機能をアップレギュレートしました。Slc7a11は、細胞の活性酸素種レベルを制御し、ミトコンドリアの代謝産物をクエン酸回路から方向転換させます。このように、破骨細胞においてBAP1はエピジェネティックな代謝軸を制御しているようであり、骨粗鬆症患者において骨形成を維持しながら骨吸収を抑える潜在的な標的であると考えられます。

3

破骨細胞のシングルセルRNA-seq解析を実施し、代謝、吸収、免疫特性において明らかに異なる2つの破骨細胞の亜集団の存在を明らかにしました。その割合は卵巣摘出マウスとコントロールマウスで異なりました。これらの知見は、病的な骨喪失に対する治療アプローチを改善するために、病的な破骨細胞のサブセットを標的とする可能性を支持します。

4

NADHのNAD+への酸化は、複合体Iの活性と電子伝達連鎖によるATPの生成に不可欠です。本研究では、エストロゲンの抗破骨細胞形成作用に対するNAD+代謝の寄与を検討しました。マクロファージ系で、NAD+のレベルを低下させたマウスでは(LysM-Cre; Nampt)、卵巣摘出による骨減少が抑制されました。これらの結果は、破骨細胞におけるNAD+レベルの増加が、エストロゲン欠乏症における骨吸収の増加に寄与していることを示唆しています。

5

ビタミンKは、骨粗鬆症の治療薬としても知られています。作用機序は、オステオカルシンのγ―カルボキシ化を促進することによるものとされていますが、今回の研究では、オステオカルシンではない別のタンパク質Gas6が骨代謝改善作用に重要そうだということが明らかにされました。γ-カルボキシラーゼ(GGCX)遺伝子を骨芽細胞特異的に欠損したマウスの骨は、骨量増加を示しましたが、これは、破骨細胞の減少によるものでした。一方、この表現型は、オステオカルシン欠損骨芽細胞とは異なる表現型であることから、別のγ―カルボキシ化を受けるタンパク質であるGas6に着目しました。その結果、骨芽細胞において、Gas6というタンパク質がγ-カルボキシ化を受けて、破骨細胞の前駆細胞に働きかけて、前駆細胞の融合に必須であることが示されました。本研究により、Gas6が破骨細胞の成熟を制御する新規の骨芽細胞由来γ-カルボキシ化タンパク質であり、ビタミンKの骨代謝改善作用を仲介する可能性が明らかになりました。

骨格幹細胞/前駆細胞（SSPC）の老化は、加齢に伴う骨再生能力の低下の主な原因ですが、SSPCの老化の原因は依然として不明です。著者らのグループは以前、炎症促進性サブタイプや老化サブタイプによって産生されるGCAが、PLXNB2を介して骨の代謝回転を抑制することを報告しました。本研究では、カルスのマクロファージが加齢に伴いグランカルシン（GCA）を分泌することでSSPCの老化を引き起こし、骨折治癒を阻害することを明らかにしました。

若齢マウスにヒトrGCAを局所注射すると、SSPCの老化が誘導され、骨折修復が遅れました。また、単球/マクロファージにおけるGcaの遺伝子欠失は、SSPCの老化を軽減させ、高齢マウスの骨折修復を若返らせました。メカニズムとしては、GCAがプレキシンB2受容体に結合し、Arg2を媒介してミトコンドリアの機能不全を誘導することで、細胞老化や骨軟骨形成能の欠陥を引き起こすことが示唆されました。 一方で、GCAの中和抗体投与により、高齢マウスの骨折治癒は改善されました。

以上の結果から、カルス内の老化マクロファージがGCAを分泌し、PLXNB2を介してSSPCの老化を誘導することで、骨折治癒を阻害することが示唆されました。本論文において、GCAの中和抗体がSSPCの老化や骨折治癒を改善したことから、高齢者の癒合不全または癒合遅延に対する有望な治療法として期待されます。また、GCAが他の組織の老化に与える影響や、GCAの中和抗体が他の骨系統疾患に与える影響について、さらなる研究が期待されます。

頭蓋骨縫合早期癒合症は頭頂部の縫合部が早期に癒合する疾患群です。頭蓋骨縫合早期癒合症において、癒合を促進する骨芽細胞を産生する頭蓋側頭骨幹細胞の正体はまだ十分に解明されていません。本研究では頭蓋骨縫合早期癒合症における生理的な頭蓋骨の石灰化と病的な頭蓋骨の癒合の両方が、２つの異なる幹細胞系の相互作用を反映していることを示しました。それは以前に同定されたカテプシンK系統の幹細胞と本研究で同定したディスコイジンドメイン含有受容体２(DDR2)系統の幹細胞です。ヒトの頭蓋骨縫合早期癒合症に関連する遺伝子であるTwist1をCTSK+のCSCｓのみで欠失させることはマウスで頭蓋骨縫合早期癒合症を起こすには十分ですが、癒合する運命にある部位においてはCtsk＋CSCsの予期しない枯渇とそれに対応するDDR2+CSCsの拡大が見られ、DDR2+CSCsの拡大はCtsk+CSCsの枯渇に対し、直接的に適応していない反応です。DDR2+CSCsは完全な幹細胞性を示し、私たちの結果は縫合には２つの異なる系統の幹細胞系が存在し、両方の集団が生理的な頭蓋骨の石灰化に寄与していることを立証しました。DDR2+CSCｓは典型的な造血骨髄形成を伴わない別の軟骨内骨化を媒介します。縫合部へのDDR2+CSCsの移植は癒合を誘導するのに十分であり、この表現形はCTSK+CSCsの共移植によって阻止されました。最後にヒトのDDR2+CSCｓとCTSK+CSCsは異種移植アッセイにおいて保存された機能的特性を示しました。これら2つの幹細胞集団の相互作用は頭蓋骨の石灰化と縫合の開存性を調節するための新しい生物学的インターフェースを提供します。

ヒト上科動物は進化に伴い尾を喪失しましたが、その遺伝的メカニズムは未解明です。本研究は、ヒト上科動物とそれ以外の霊長類を比較したゲノミクス解析により、ヒト上科動物特異的に、TBXT遺伝子の特定の部位にAluY配列が挿入された配列が存在することを同定しました。この挿入により、TBXTのExon6が欠損する選択的スプライシングが誘発されます。この変異が尾の表現型に影響するかを調べるために、TBXTの完全長型、エキソン欠損型の両方を発現するマウスモデルを作製しました。この結果、表現型として尾を持たない、もしくは喪失したマウスが確認されました。したがって、エキソン欠損型Tbxt遺伝子の転写産物が尾の喪失に関わる可能性が示唆されました。ただし、安定して尾が欠損する表現型を示すようになるには、他の変異が関与していると推測されます。

骨の発生では、間葉系細胞の凝集後に軟骨細胞へと分化し、肥大化軟骨細胞になるとVEGFを発現することで、血管をリクルートしますが、これには軟骨部位へと浸潤する必要があります。しかし、これまで軟骨の分解に寄与する細胞は議論がなされており、血管内皮細胞や破軟骨細胞、セプトクラストが挙げられてきていました。特にセプトクラストについては、in vivoまたはin situの評価がなされず、良く分かっていませんでした。

本研究では、発生・再生における軟骨基質の分解に寄与する細胞として、脂肪酸結合タンパク質Fabp5陽性のセプトクラストの由来と分化について解明しました。

セプトクラストは成長板付近の骨・軟骨境界部に存在しており、内皮細胞に隣接していました。また、セプトクラストは血管壁の幹細胞マーカーであるPdgfra, Fabp5陽性でした。電子顕微鏡での観察によると、小胞体が肥厚しており、アクチンフィラメントが豊富でした。3週齢マウスの大腿骨における希少細胞のセプトクラストについて調べるため、scRNA-seqを利用した細胞系譜を検討すると、セプトクラストは造血幹細胞系ではなく、骨端幹細胞由来であることが分かりました。

遺伝子発現に関して、基質分解に関するマトリックスメタロプロテアーゼ、Notch関連遺伝子が高いことが分かりました。そこで、Notchシグナルによってセプトクラストが分化するかを検討するため、血管内皮細胞由来のNotchリガンドであるDll4を骨端幹細胞に投与すると、Notch関連遺伝子だけでなく、セプトクラストで上昇していたFabp5, Mmp9の上昇を確認しました。In vivoの系についても検討するため、血管特異的なDll4の欠損を行うと、セプトクラストが見られなくなりました。以上のことから、セプトクラストの分化には、血管内皮細胞由来Dll4によるNotchシグナルが必要であることが明らかとなりました。

以上は、発生・成長段階でのセプトクラストについて見られており、成体マウスについては、セプトクラストが消失することを示していました。しかし、骨折を起こすと血管の形成に伴って、セプトクラストが再出現することが見られました。本研究は、骨発生・再生における疾患の病態解明に加え、骨折治癒の改善に関する治療戦略に役立つことが期待されます。

セプトクラストの系譜が、造血幹細胞系ではないことが印象的です。セプトクラストの働きとしては、軟骨分解のみが挙げられていましたが、その他にも軟骨細胞の脱分化といった別の役割があると、よりセプトクラストの重要性が示されると思います。まだ知名度が低い細胞ですが、研究対象としては興味深いと思います。

Lindsay Dawson, PhD-Inducing joint regeneration at digit amputation wounds in mice

「マウスの指切断創における関節再生の誘導」

事故後の四肢切断は米国で190に1人起こっているとされており、十分な再生は出来ません。しかし、幼児の指先の切断後にはほぼ再生する事例も報告されています。マウスの研究においては、マウスの指先端であるP3での再生はされますが、第一関節より内側に位置するP2での切断では、十分な再生が起こらないことが見られています。

発表者は、マウスの第二指骨を切断し、成長因子ごとの再生への寄与について研究しました。

BMP2は軟骨細胞の増殖を促進し、内軟骨性骨化中心を形成することが明らかにされています。しかし、関節形成は出来ないため、発生段階で関節形成に関与するとされるBMP9による再生を検討すると、BMP9の投与は指先の関節腔の形成が成されました。さらに、FGF8の投与も、内軟骨性骨化中心の形成と関節の形成が成されました。FGF8の投与によって、関節に関するGDF5や関節腔に関するHes2、軟骨関連のPrg4とSox9の遺伝子発現が上昇していることを示しました。以上のことから、組織再生に関わる成長因子とその再生に関わるメカニズムについて示されました。

BMPは局所投与で異所性に骨化を起こすことが出来ますが、軟骨を形成させることについてはほとんど知らなかったです。BMPは14種類あり、BMP2, 4, 6, 7, 9には骨・脂肪分化を起こせますが、BMP3, 8についてはそういった機能はないといったように、それぞれ特徴があります Stem Cells and Development (liebertpub.com)また、BMP9はSox9などの軟骨関連遺伝子をノンカノニカルなシグナル（特にp38）で上昇させることが報告されているようでした。 Wiley Online Library、ScienceDirect今回の発表では、BMP9がPrg4発現を促進することで、関節腔を形成させることを示していました。BMPによる関節・軟骨形成について良く学ぶ機会となりました。さらにFGF8の投与も関節形成などの指骨再生に寄与することが示されており、四肢再生に関する重要な知見が得られました。

Yuuki Imai, MD, PhD-Maintenance DNA methylation in skeletal muscle regeneration

「骨格筋再生におけるDNAメチル化の維持」

筋肉の再生にはPax7陽性のサテライト細胞が必要です。サテライト細胞に関する研究は筋再生に重要で、一般的にサテライト細胞特異的なKOを行うことで、筋再生について検討しますが、サテライト細胞特異的Pax7-Cre（Fan）はCre-controlでも筋再生能が低下していることが報告されているため、コントロールマウスについてよく検討するべきことが示されました。現在は、Pax7-Cre（Gaka）を用いることで、Cre-controlの表現型が出ないようにもされています。

本研究は、DNAメチル化に重要なDnmt1をリクルートするUhrf1の筋再生における機能を示しました。Uhrf1は、DNA片側のみメチル化されているヘミメチル化状態の複製DNAにおいて、Dnmt1のリクルートによるメチル化を起こすような働きを持ちます。これにより、標的遺伝子は転写されなくなり、細胞機能へと影響を与えます。Uhrf1は筋再生時に上昇してくる遺伝子で、これのPax7-Creを用いた欠損は、筋再生が出来ていないことが明らかとなりました。さらに、Uhrf1欠損の筋肉を用いたMBD2-seq解析を行い、標的遺伝子に関してGO解析を行うと、骨化に関する遺伝子が上昇していることが分かりました。さらに、Uhrf1欠損細胞では、Sox9などの発現が上昇していることが見られ、筋分化の低下と増殖抑制が見られました。以上のことから、Uhrf1の欠損は筋再生がうまくいかないことと、DNAのメチル化が筋再生に重要であることが示されました。

Creを入れただけでも表現型が出るということは、これによって実験結果の解釈が大きく変わることもあるので、注意するべき点であった。表現型が出る理由としては、Cre遺伝子の挿入のされ方であり、遺伝子組み換えマウスのノックインのされ方や標的遺伝子の性質によって、表現型が出てしまうようです。Pax７－Creに関しては、ハプロ不全になるためPax7のエクソン部位に挿入されると生体に影響が出てしまいます。遺伝子組み換えについて考えさせられる内容でした。

Sox9の発現が上昇していることは、自分の研究と共通している点であるため、エピジェネティックについても興味を持ちました。

加齢は脊髄関連疾患において重要な因子ですが、この関係のメカニズムはまだ理解されていません。これを解決するために、本論文ではヒト以外の霊長類（NHP）である、カニクイザルを用いて、シングル核RNAシーケンス解析と行動・神経生理学的解析を行っています。

その結果、運動ニューロンの老化とミクログリアの過活性化を伴う神経炎症が、脊髄老化の特徴であることが明らかになりました。メカニズムとして、老化した脊髄ではCHIT1（分泌型哺乳類キチナーゼ）の発現が上昇した神経毒性ミクログリアが存在していました。CHIT1陽性のミクログリアが運動ニューロンの周囲に局在し、pSmad2の亢進を介してSMADシグナルを活性化して、老化を誘発していることが明らかになりました。

さらに、ヒト運動ニューロンに対しても分泌型CHIT1が運動ニューロンの老化を促進する役割を果たすことを検証しました。

また、老化防止化合物であるアスコルビン酸が、CHIT1の老化促進作用を打ち消し、老化したサルの運動ニューロンの老化を緩和することを明らかにしました。

今回の研究結果は、老化した霊長類の脊髄の運動神経老化のメカニズムの一端を明らかにし、脊髄変性の新たなバイオマーカーと標的を同定するものとなります。

CHIT1によるpSmad2の亢進が運動神経細胞の老化につながるという点で勉強になりました。

多発性骨髄腫の特徴の一つに骨溶解があります。これは骨細胞を介した、破骨細胞による骨吸収の活性化、骨芽細胞による骨形成の減少によって起こることが知られています。しかし、骨髄腫の微小環境において、骨細胞がそれらを制御する詳しいメカニズムは完全に理解されていません。

本研究は、骨髄腫から分泌された2DDRが骨細胞CⅡTA発現を上昇させることで、骨溶解を悪化させることを示唆しました。詳しいメカニズムを調べた結果、2DDRはSTAT1/ IRF1シグナルを介してCⅡTA発現を上昇させ、CⅡTAはAP2αと共役してTnfsf11, Sostプロモーター領域に結合することが分かりました。プロモーターにおいては、H3K14アセチル化レベルを上昇させることで、それらの転写を活性化し、これによって破骨細胞の骨吸収促進、骨芽細胞の骨形成抑制が引き起こされることが示唆されました。また、骨髄腫患者の骨破壊と骨細胞発現CⅡTAの臨床的関連性について調べると、二つの間に正の相関関係がありました。

　以上から、骨髄腫に誘発される骨細胞のCⅡTA発現は、骨溶解を悪化させることが示唆されました。この研究は、インテグリンαv/STAT1/CIITAシグナル伝達経路を標的とした、新たな骨髄腫誘発性骨疾患の治療戦略を提示します。

　多発性骨髄について知ることで、骨溶解が起きるプロセス、ゴーハム病による骨溶解との違いについて理解を深めることが出来ました。先行研究にてゴーハム病患者さんが後に多発性骨髄腫を発症したと報告されていたので、共通点がないか探ろうと思います。

本日は、ASBMR 2023 Annual Meetingの前日に開催されたASBMR 2023 Symposium: Osteocytes in Bone Health and Disease and as Therapeutic Target CellsのSession 2: Osteocytes and Hormonal Actions: In and Outを視聴しました。

PTHやPTH受容体についてのイントロから始まり、骨の恒常性やリモデリングにおけるPTHの役割について、8KbDmp1-caPTH1Rマウスや10KbDmp1-PPRKOマウスの表現型を交えながら紹介されました。また、lacuno-canalicularのリモデリングや機械的負荷による骨同化作用にもPTHが重要であることなど、これまで明らかになってきた骨細胞におけるPTHの作用が詳しく紹介され、勉強になりました。

FGF23は、腎臓のリン酸塩（Pi）の再吸収と1, 25 (OH)2 Dの産生を減少させることで、血中リン酸塩レベルを制御する骨由来のホルモンです。しかしながら、FGF23の産生を調節する因子については不明な部分が多く残っていました。FGF23が腎臓で作用することから、演者らは、腎臓がFGFを合成する調節因子を放出していると仮説を立てました。そこで、被験者の大動脈及び腎静脈サンプルを用いて、プロテオミクス及びメタボロミクスのスクリーニングを行ったところ、腎臓由来のグリセロール-3-リン酸（G-3-P）がFGF23レベルと強く相関することが分かりました。また、外因性のG-3-Pは、局所的なG-3-Pアシルトランスフェラーゼ媒介リゾホスファチジン酸（LPA）の合成を介して、骨及び骨髄のFGF23産生を促進することが示唆されました（Simic et al, 2020）。次の研究では、リン酸塩が腎臓の解糖系を亢進させてG-3-Pの合成を増加させることで、FGF23の産生を刺激することが明らかになりました（Zhou et al., 2023）。

腎臓における解糖系の亢進が、間接的に骨のホルモン分泌を促進し、さらに腎臓に作用するという臓器連関が非常に興味深い研究発表でした。

本口演では、骨細胞や骨芽細胞などで発現する骨保護因子Semaphorin 3A (Sema3A)について、globalノックアウトマウスの他にCAG-CreER+やDmp1-Creなどのノックアウトマウスによって明らかにされてきた役割が概説されました。また、骨芽細胞におけるSema3Aの発現制御や機能についても紹介されました（Hayashi et al., 2019）。最後に、骨細胞におけるRANKLのイントロンエンハンサーを同定し、そのイントロンエンハンサーをノックアウトさせた12週齢のマウスでは、破骨細胞形成の減少により骨量が増加することを示した論文についても紹介されました（Yan et al., 2023）。これまで明らかになってきたSema3Aの機能について広く理解することができ、大変勉強になりました。

 今回選んだシンポジウムでは、骨細胞の多彩な機能について紹介され、どの発表も大変勉強になりました。これまでの研究から、骨細胞は、骨代謝制御だけでなく他の臓器にも影響を与える重要な存在であることが明らかになってきました。骨細胞特異的な欠損マウスには、8 kb Dmp1-CreやSost-CreなどのCreが用いられていますが、いずれも骨細胞以外の細胞での発現することが報告されていることから、やはり特異的なCreが必要とされていると感じました。近年広まりつつあるシングルセルRNA-seqなどの解析により、骨細胞でのみ発現するCreの樹立が期待されます。

小胞体ストレス応答は、小胞体内腔における誤って折りたたまれたタンパク質の蓄積によって引き起こされます。一方、ハッチンソンギルフォード症候群(HGPS)は早老症であり、LMNA遺伝子内の点突然変異によりプロジェリンと呼ばれる異常物質が産生されます。本研究では、HGPSにおける小胞体ストレス応答の活性化のメカニズムを検討しています。

核周縁部のプロジェリンによって、小胞体シャペロンであるGRP78を核周縁部で蓄積させ、小胞体ストレス応答関連遺伝子の発現が上昇することが分かりました。その際の誘導に、核膜タンパク質であるSUN2のクラスター化が必要であることが示唆されました。これらの結果から、核と小胞体の間のコミュニケーションの新たなメカニズムを明らかにし、HGPSの分子疾患メカニズムの一部を解明しました。

Ctdnep1がSUN2の分解を制御していることから、本論文を紹介しました。Ctdnep1の核膜の制御についてさらに検討したいと思います。また、SUN2の局在やタンパク質レベルについても着目していきたいと思いました。分子シャペロンや小胞体ストレス応答の詳細なメカニズムについても勉強になりました。

筋再生は広く研究されており、サテライト細胞が重要であることが知られていますが、筋線維の自己修復については全く知られていません。本研究では、筋線維による筋細胞核が損傷に応答して、カルシウムシグナルを介して筋細胞核を集合させ、損傷部への修復mRNAを送達させることで、筋線維修復を促進させることを明らかにしました。この筋細胞核の集合はサテライト細胞とは関係なく起こっており、カルシウムシグナルによって核遊走が行われ、特にその下流Cdc42, PKCシグナルの阻害は核遊走を抑制しました。微小管の動きをEB3-Cometで観察すると、損傷後には核から損傷部位への方向に動く微小管が減少していました。筋細胞核の損傷部位への遊走をPKC, FAK阻害剤で抑制すると、筋修復が遅れていることに加え、転写抑制剤を投与することで全く修復が進まないことを見出しました。さらに、核遊走阻害剤を投与した状態で、核近傍に損傷を与えると、阻害剤の非投与と同等であったため、損傷部位に核が存在することが、修復を早めるために重要であることが示唆されました。以上のことから核がmRNAを送達することによって修復を促進していることが予想されたので、翻訳が促進されているかをPuromycilationassay、mRNAの集積があるかをin situ hybridizationによって検討すると、核の有無に関わらず、損傷部位は翻訳ホットスポットでした。しかし、mRNAについては、核非存在下では、損傷部での修復関連RNAの集積が減少し、核の遊走が行われることで、mRNAの集積が良く見られました。以上のことから、筋線維損傷では、自身の核が損傷部位へ移動し、修復関連RNAを送達することで、筋線維自己修復が行われていることが明らかとなりました。 

筋肉についてよく勉強できました。核位置が筋修復に関連していることは興味深く、現在着目している核膜脱リン酸化酵素のCtdnep1も核位置を制御するLINC複合体形成に重要であることが報告されているため、核位置関連はよく勉強しておくべきと思われました。核位置は、発生段階から細胞増殖、遊走、組織再生においてダイナミックに変化するため、核位置の研究は面白いと思われました。mRNA送達についてもほとんど考えたことがなかったのですが、別の研究ではmRNAの細胞内局在がZipcodeタンパク質などによって制御されていることや、mRNA誤局在は疾患（Cellの報告ではアルツハイマー病）にも関与することから、非常にミクロな細胞内局在の研究も興味深いと思えました。

かなり難しかったですが、筋肉や核位置、mRNA局在などの分子生物学だけでなく翻訳活性やOptogeneticsといった実験手法も非常に勉強になりました。核構造の違いについても非常に興味が湧き、例えば、腱細胞核は軟骨細胞核より細長いので、核構造の違いと生理学的な意味について研究したいと思えました。

ハダカデバネズミは、非常に長命なげっ歯類で、無視できる程度の老化を示すとともに、加齢に伴ういくつかの疾患から保護されることが知られています。著者らはこれまで、ヒトやマウスよりも分子量の大きい高分子ヒアルロン酸（HMM-HA）がハダカデバネズミの組織で豊富に蓄積していることや、ハダカデバネズミでは早期接触阻害と呼ばれる抗がん機構があること、この機構にHMM-HAが必要であることなどを報告してきました。また、HMM-HAには抗炎症・抗酸化作用があることから、HMM-HAが老化防止機能を持つ可能性が考えられました。以上のことから、HMM-HAの利点が他の動物種でも再現できるかどうかを調べました。

著者らはまず、ハダカデバネズミのヒアルロン酸合成酵素2（Has2）を過剰発現させたトランスジェニックマウス（nmrHas2マウス）を作製しました。nmrHas2マウスは、いくつかの組織でヒアルロン酸レベルの上昇を示し、自然発生および誘発性がんの発生率が低く、健康寿命が向上しました。nmrHas2マウスで観察された最も顕著な変化は、複数の組織にわたる炎症の抑制であり、HMM-HAは、免疫細胞に対する直接的な免疫調節作用、酸化ストレスからの保護、加齢に伴う腸管バリア機能の改善など、いくつかの経路を通じて炎症を抑制していました。これらの知見は、ハダカデバネズミで進化した長寿メカニズムが他の種でも応用可能であることを示唆しました。

豊富なHMM-HAが全身性の抗炎症作用をもたらすことを示した今回の結果は、健康寿命の向上や加齢に関連した炎症性疾患の治療のためのHMM-HAの可能性を示唆しました。

骨粗鬆症は大きな公衆衛生問題です。現在、骨形成を増加させる経口で利用可能な治療法はありません。間欠的な副甲状腺ホルモン(PTH)の投与は、塩誘導性キナーゼアイソフォーム2および3(SIK2およびSIK3)の阻害を含むシグナル伝達経路を介して骨形成を刺激します。本研究では、SIK2/SIK3が成体マウスで全身性に欠失すると、骨格外の毒性を伴わずに骨形成が促進されることを実証し、骨粗鬆症の創薬標的としてさらに検証しました。骨形成を刺激するためにこれらのキナーゼを標的とする以前の努力は、薬理学的に許容され、特異的で経口的に利用可能なSIK2 / SIK3阻害剤の欠如によって制限されてきました。ここでは、構造ベースの創薬設計とそれに続く反復的な創薬化学を用いて、SK-124をSIK2およびSIK3を強力に阻害するリード化合物として同定しました。SK-124は、インビトロおよび細胞ベースのターゲットエンゲージメントアッセイで1桁のナノモル効力でSIK2およびSIK3を阻害し、許容可能なキノーム選択性と経口バイオアベイラビリティを示しました。SK-124は、ヒトおよびマウス培養骨細胞におけるSIK2/SIK3基質リン酸化レベルを低下させ、PTH様様式で遺伝子発現パターンを調節しました。マウスの3週間の1日1回の経口SK-124治療は、カルシウムと1,25-ビタミンDの血中濃度の上昇と内因性PTHレベルの抑制を含むミネラル代謝に対するPTHのような効果をもたらしました。さらに、SK-124治療は、短期間の毒性の証拠なしに、骨芽細胞による骨形成を増加させ、海綿骨を増加させました。まとめると、これらの知見は、経口投与可能なSIK2/SIK3阻害剤SK-124によるin vivo治療による骨およびミネラル代謝におけるPTH様効果を示しています。

今回の論文で作っていたような経口投与で骨粗鬆症を治療できるような治療薬を作れれば多くの高齢者のQOLを向上させることができると思うので開発を進めるのはおもしろいと思いました。

近年、骨格系幹細胞の研究がホットトピックになっています。Prrx1-Cre, Prrx1-CRE-ERT2というトランスジェニックマウスを用いた研究から、Prrx1という転写因子は、胚発生の非常に早い時期に側板中胚葉に発現します。Prrx1を発現した細胞は、その後、軟骨細胞、骨芽細胞、鼠径部脂肪細胞、腹皮の線維芽細胞、骨膜/軟骨膜の形成層に分化しますが、それ以外の結合組織には分化しないと考えられてきました。しかし、実際のPrrx1の発現をin situ hybridization法で検出すると、生体のマウスでは、骨組織以外にも、脂肪組織、真皮組織にもPrrx1の発現が認められました。そこで、著者らは、新たに、生体のPrrx1の発現を模倣した、Prrx1-Cre, Prrx1-Cre-ERT2ノックインマウスを作製して、Prx1陽性細胞の特性解析を実施しました。その結果、Prrx1を発現する細胞は、骨、脂肪、真皮において、長寿命の幹細胞として存在し、Wntというシグナル分子を分泌することで、組織恒常性の維持、組織損傷時の修復において機能していることが明らかになりました。また、これまでに報告されてきた、グレムリン1、レプチン受容体、ネスチン陽性骨格系幹細胞とは異なる、新規の幹細胞集団であることもわかりました。

今回の知見により、難治性の組織損傷に対して、Prrx1陽性細胞を患者さんから取り出して、移植するという、新たな細胞治療が可能になるのではないか、と思いました。骨格系幹細胞の分野は非常に活発に研究がされており、今後も新たな研究結果が出てくるのではないかと思います。

破骨細胞による炎症性骨量減少は、関節リウマチ(RA)など多くの炎症性疾患で見られます。しかし、TNFなどの炎症刺激による破骨細胞形成メカニズムは知られていません。本研究では、TGFβ存在下でTNF がRANKL経路非依存的に破骨細胞形成を誘導することを明らかにしました。また、ミエロイド系統特異的にTGFβⅡ型受容体を欠損させたマウスでは、炎症性破骨細胞形成と骨吸収が抑制されることが示されました。さらに、ATAC-seqとCUT&RUN-seq解析の結果から、TGFβは、ヒストン修飾をリモデリングしクロマチン構造を変化させることでTNFに対するマクロファージ応答を変化させ、細胞運命を破骨細胞形成にシフトさせることを発見しました。このメカニズムを標的とすることで、RANKLによる骨リモデリングに大きな影響を与えることなく、炎症性骨減少を抑制する治療が可能になると予想されます。

ゴーハム病発症前に怪我を負ったという患者の報告がありました。因果関係は特定されていませんが、今回の内容は怪我による骨溶解発症を説明する手がかりになると考えます。

JAK2はサイトカインと成長因子のシグナルの重要な調節因子です。しかし生体内の破骨細胞でのJAK2の役割は解明されていません。そこでJAK2の役割を解明するためCre-LoxPシステムを使い破骨細胞JAK2 KOマウスを作りました。JAK2 KOマウスは顕著な出生後成長抑制を示しました。しかし、それは骨の密度、微小構造、生体力学的強度とは関連しませんでした。JAK2 KOマウスでは破骨細胞特異的IGF1の発現が減少しており、このことは、破骨細胞由来のIGF1が体のサイズ決定に役割を持っていることを示唆しました。破骨細胞由来のIGF1の役割を直接的に評価するため、破骨細胞特異的IGF1KOマウスを作りました。それはJAK2 KOと類似した成長抑制を示しました。最後に、ヒト導入遺伝子で循環IGF1を過剰発現させた結果、成長障害からレスキューされました。まとめると、本研究でのデータは破骨細胞JAK2とIGF1の体のサイズ決定における破骨細胞の吸収機能とは無関係の新しい役割を示しました。

　骨折は高齢になるにつれて頻度が高くなり、しかも骨折治癒が遅れることは経験的にもマウスの実験においても分かっておりますが、高齢者への骨折治癒促進を起こす治療薬はありません。また、高齢での骨折治癒遅延の分子メカニズムも良く分かっていません。先行研究では骨髄の老化細胞が細胞老化随伴分泌現象（SASP）と呼ばれる炎症性サイトカインを放出することで、その近傍の骨髄幹細胞の老化を促進し、骨折治癒に重要な幹細胞の数を減少させることが報告されましたが、直接的なカルスにおける老化細胞が骨折治癒遅延を起こすかは不明でありました。

　本研究では、4か月齢の若年マウスと20か月齢の老齢マウスを用いた骨折治癒の実験を行い、カルスにおける老化細胞が産生するSASPのうち、TGF-βが骨折修復に関与するカルス間葉系前駆細胞の増殖を抑制することで、骨折治癒の遅延が起こっていることを明らかにしました。

　まず、使用した老齢マウスの骨折部位で細胞老化が上昇していることを確認し、その老化細胞を除くことで骨折治癒が促進されるか観察しました。最も一般的なSenolytic Drugであるダサチニブとクエルセチン（D+Q）を用いた老化細胞の除去は、老齢マウスにおける骨折治癒を促進したため、老化細胞は骨折治癒を遅らせることが示唆されました。

   次に、カルスにおける前駆細胞が老化細胞からのSASPの影響を受けるか検討するため、カルス前駆細胞の培養を行いました。得られたカルス由来の前駆細胞は他の骨髄や脂肪組織由来の幹細胞と比較して、骨再生能が高いことが幹細胞の移植実験で明らかとなり、これをCaMPCと名付けました。これに、若年または老齢マウス由来のカルス組織を直接培養した培養液（CM）を投与し、そこに含まれているSASPがCaMPCに影響与えるか検討したところ、CaMPCの増殖能が老齢カルス由来のCM投与で有意に減少していることが分かりました。次に、SASPの中でも最も重要な分泌因子を同定するため、老化カルス組織のRNAを用いてRT-qPCRを行うと、IL1αやケモカインと比べても、TGF-β1の発現が非常に高いことが確認されたため、TGF-β1が骨折治癒遅延に寄与するSASP因子であることが示唆されました。そこでTGFβの中和抗体1D11を用いたレスキュー実験をin vitro/vivo両方で行うと、1D11投与がCaMPCの増殖を伴って骨折治癒を促進することが分かりました。

　以上のことから、本研究では、高齢者における骨折治癒遅延の分子メカニズムが老化細胞由来TGFβによるものであることに加え、Senolyticsが高齢者に対して骨折治癒を促進する新規治療薬になり得ることが示されました。

　今年のBone Biology Forumでも中西先生のご発表で老化細胞が扱われ、老化細胞に興味を持ちました。また、老化細胞を除くことは有望な治療薬であり、Senolyticsはジェフ・ベゾス含む投資家の出資を受けているようで、老化細胞の研究は今後重要になっていくと思われました。本研究もSenolyticsが高齢者の骨折治癒を促進する初の医薬品となり得るものでありました。今後は運動器の老化細胞にも注目していきたいです。

結核は主要な死亡原因の一つですが、その病因については十分に理解されていません。本研究では、結核菌の全ゲノム解析を行うことで、宿主因子に作用する可能性があるタンパク質を予測しました。この結果、PtpBが、宿主のインフラマソームを介したIL-1β放出を抑制することを特定しました。その後の実験で、PtpBは宿主マクロファージの細胞膜成分であるPI4PとPI(4,5)P2を脱リン酸化することで、GSDMD-N末端の細胞膜局在を阻害し、サイトカインの放出とパイロトーシスを抑制することを明らかにしました。また、哺乳類はタンパク質のユビキチン系を制御することで多様な免疫反応を調節していますが、PtpBは宿主のユビキチンと結合することで脱リン酸化機能を高めることを示しました。これらの発見は、結核の病因についての理解を深めるとともに、薬剤耐性のある結核菌も標的とした、新しい抗結核療法の開発に繋がると予想されます。

本日のセミナーの発表者であるB. Ajamiは免疫学および行動・システム神経科学について研究をしています。彼女の研究は、さまざまな神経変性疾患において免疫細胞がどのように病態を引き起こすかに焦点を当てています。

初めに、ミクログリアの由来について、ALSのような神経変性疾患でも、血液から来るのではなく、脳と脊髄に存在して組織の中で自己複製することを明らかにしました。また、三つの異なる特性を持つ集団が存在することが分かりました。

次にALSモデルマウスを用いてシングルセルプロテオミクス解析を行ったところ、α5インテグリンが上昇していることが分かりました。α5インテグリン陽性のミクログリアや坐骨神経のマクロファージは炎症性サイトカインの発現が上昇していました。そこでα5インテグリンに対する抗体をALSモデルマウスに投与したところ、生存日数が伸び、運動能力が回復しました。また脊髄のミクログリアの数が減少していることが分かりました。ALSのミエロイド細胞でのα5インテグリンの発現が、治療ターゲットになることが示唆されました。

最後に、組織によってミクログリアが保護的に働く場合と毒になるときがある場合について述べられました。脊髄においてミクログリアは神経に炎症を誘発するのに対し、動眼神経ではミクログリアは神経に対して保護的に働きます。

本セミナーで神経変性疾患におけるミクログリアの働きについて学ぶことができました。自分の研究でも、ミクログリアや炎症性サイトカインの解析を行おうと考えました。

運動は、骨粗鬆症を予防し免疫機能を向上させますが、そのメカニズムは未だ不明です。本論文では、力学的刺激によって、骨髄マクロファージからreticulocalbin-2 （RCN2）が分泌され、骨髄の脂肪分解とそれに続く骨形成及びリンパ球産生を促進することが示唆されました。

筆者らは、運動負荷マウスで発現上昇し、老齢マウスで発現減少するタンパク質としてRCN2を同定しました。recombinant RCN2投与によって、脂肪分解酵素の発現が上昇し、BMSC由来脂肪細胞上清中のグリセロール及び遊離脂肪酸が増加することが示されました。RCN2の発現については、骨髄では特にマクロファージにおいて、力学的刺激や運動負荷により誘導されました。マクロファージ特異的Rcn2欠損マウスの解析から、運動時に、Rcn2が骨髄脂肪の分解を介して骨形成やCLPの頻度を上方制御することが示唆されました。メカニズムについては、RCN2がNRP2とITGB1から成るコレセプターに結合し、cAMP-PKA経路を活性化させることで、脂肪分解が促進されると推測されました。最後に、尾部懸垂モデル及び老齢マウスではRCN2発現が低下しており、rRCN2を投与することで、骨髄脂肪増加や骨量減少、CLP減少といった表現型が改善されることが示されました。

以上のことから、RCN2が新規の力学的刺激感受性脂肪分解因子であり、骨形成とリンパ球産生を促進することが示唆されました。

尾部懸垂モデルや老齢マウスへのrRCN2投与は体重や血清トリグリセリドに影響しないという結果でしたが、RCN2がユビキタスに発現することから、他臓器や老化におけるRCN2の発現制御や機能のメカニズム解明が期待されます。

本日は，イタリアのパドヴァ大学のStefano Piccolo教授によるセミナーを視聴しました。Piccolo教授は，YAP/TAZという機械刺激を感知する転写因子に着目して，これまでに数多くの興味深い論文を発表されています。先日のJCでも，Piccolo教授の最近のNatureの論文[YAP/TAZ activity in stromal cells prevents ageing by controlling cGAS-STING]を取り上げましたが，この分野の先駆者であります。今回は，これまでに発表した論文のレビュー的なセミナーでした。幹細胞，がん，間質細胞の老化との関連が取り上げられました。例えば, Cell Stem Cell. 2016の論文からは，YAP/TAZを発現させると，分化した乳腺細胞を乳腺幹細胞に変えるという紹介がありました。Cell. 2014の論文からは，腸の上皮細胞で，APCという遺伝子を欠損させると，がん化するのですが，YAP/TAZをノックアウトすると，がん化がおきないことが紹介されました。Nature Cell Biology (2015)の論文からは，発がん物質で皮膚がんを誘発する条件で，YAP/TAZをノックアウトすると，発がんが抑制されることが示されました。他にも，肝臓がん，膵臓がんでも同様の現象が見られました。

YAP/TAZを阻害するような薬物は，がんを抑制する効果があると期待されますが，YAP/TAZは，転写因子なので，創薬標的分子になりにくいという弱点があります。しかしながら，細胞の形態を変化させるような経路を阻害するようなSrc阻害薬，ROCK阻害薬などが，YAP/TAZを抑制するのと同じような効果をもつかもしれません。

YAP/TAZは，加齢とともに，細胞の核から除外されるようになってしまいますが，YAP/TAZを再活性化することで，幹細胞性を取り戻し，細胞は若返ることができるようになることも皮膚の真皮の細胞や動脈壁で示されました。

Take-home-messageとしては，BACK TO THE STEMNESS -A YAP time machine^「幹細胞性へ戻す」でした。

GSDMDはパイロトーシスやサイトカイン分泌に関わると考えられていますが、骨折治癒における役割はほとんどわかっていませんでした。この論文では、GSDMDの欠損によって骨折治癒が障害され、骨再生の機能が低下することを見出しました。また、骨折によるIL-1β, IL-18の分泌が低下することを示唆しました。このことから、GSDMD-IL-1シグナル経路によって誘発される炎症反応が骨折後の治癒を促進することが明らかになりました。この結果は、筋骨格系におけるGSDMD機能のための有望なアプローチとなり、骨癒合不全やGSDM関連疾患の治療法の発見に繋がる可能性があります。

1. Veronica Mendoza Reinozo- Efferocytic Bone Marrow Macrophage Drive Inflammation in Skeletal Metastasis
骨はがん細胞にとって“肥沃な土地”と表現されます。前立腺がんの骨転移の治療については不明なことが多い現状です。骨に存在する細胞がアポトーシスを起こすとき、M2マクロファージのエフェロサイトーシスによってホメオスタシスを保ちますが、骨転移したがん細胞に対するエフェロサイトーシスではCxcl5などを放出することが知られています。しかし、それによる炎症のメカニズムなどは不明でした。

マウス由来マクロファージと前立腺がん細胞の共培養系によるscRNA-seq解析では、免疫系のシグナルに加えて、エフェロサイトーシスのマクロファージにおいてHypoxia（低酸素）シグナルの上昇を確認しました。特に転写因子Hypoxia Inducible Factor 1a(Hif1a)の安定性が上昇しており、それはリン酸化STAT3とHif1aの相互作用によるものでした。エフェロサイトーシスによる骨転移がんは、Hif1aを介したMifの上昇と、Mifのパラクリン作用で病変部におけるCD74陽性マクロファージでのERK, NFｋBシグナルの上昇で炎症の上昇や腫瘍の増加に寄与することが分かりました。

マクロファージががん細胞を取り込んで、パラクリン的に腫瘍形成を促進する機序は興味深く、今後の研究でもマクロファージのエフェロサイトーシスによって生じるサイトカインに着目することは重要と思えました。

2. Loic Gaweda- A spliced variant of axon guidance receptor ROBO4 drives breast cancer cell colonization in bone
ROBOはいくつか種類があり、神経発達に寄与することが知られていますが、ROBO4はその役割を持ちません。これまで、ROBO4には内皮細胞の遊走や造血幹細胞の接着に関与していることが知られています。発表者は、ROBO4の新たなアイソフォームを発見し、それががんに寄与していることが分かりました。

新たに発見されたROBO4のアイソフォームは、がん細胞で特に見られており、がん患者でもROBO4が高いと予後不良の乳がんや骨転移を引き起こすことを発見しました。これのKOは乳がんだけでなく骨転移がんを抑制しました。In vitroでのスフェロイドアッセイでは、ROBO4 KO細胞において細胞同士のスフェロイド形成が低下しており、腫瘍の増大に関連していることが示唆されました。さらにROBO4の下流シグナルを介したICAM1の上昇に関連していることが見られ、ICAM1がTNFαの炎症を誘導していることも示唆されました。

スフェロイド形成アッセイなどを行うことで、細胞間相互作用に着目しており、膜タンパク質を着目する際には参考になる発表でした。

3. Vera M. Todd- Hypoxia-inducible factor signaling in breast tumors controls site-specific dissemination to bone and lung
高いレベルのHif1aは乳がん患者の予後が不良になることが知られています。またHif1aの欠損は、肺への転移を抑制することが知られていますが、Hif1a活性化によってがん転移が促進するかは不明でした。Hif関連タンパク質を欠損することで、がんの形成・転移にどう影響するかを研究したところ、Hif1a欠損では乳がんサイズが小さくなりましたが重量の増加を確認しました。骨転移に関しては、Hif1a, 2aの欠損では抑制し、Vhl欠損で上昇しましたが、Hif1aに関しては骨量減少が見られました。さらに、先行研究とは異なりますが、Hif1a欠損で肺への転移が上昇していることが見られました。

ある部位の腫瘍にとっては抑制因子であったものが、別の部位では腫瘍形成を促すといったがん治療の複雑さを実感したとともに、Discussionでの肺と骨のクロストークに少し触れていたことは興味深く、骨と肺の関連性の研究は重要になってくるかもしれないと思いました。

 4. Ahmad Othman- Runx2 Regulates Cytoskeletal Dynamics in Bone Metastatic Breast Cancer Cells
Runx2は骨芽細胞分化の転写因子としての役割が一般的ですが、今回の発表では微小管のアセチル化を制御し、オートファジーを促進することで乳がん細胞を生存させる機序を持つことが分かりました。しかも、これはRunx2の転写因子としての働きではなく、タンパク質相互作用によるものでした。

Runx2のKDは微小管のサブユニットであるαチューブリンのアセチル化を抑制し、オートファジーマーカーLC3B2が蓄積していることを観察しました。オートファジーフラックスを確認すると、Runx2のKDでは減少しており、Runx2がオートファジーを正に制御することが示唆されました。微小管形成阻害のビンブラスチンと変異Runx2（転写活性に寄与するDNA結合ドメイン“DBD”または、タンパク質相互作用に重要とされるC末端の変異）を用いて観察すると、C末端変異Runx2のみビンブラスチン投与に関わらず、αチューブリンの安定性が低下していることが分かりました。よって、Runx2の転写活性ではなく、タンパク質相互作用のC末端が重要であることが分かりました。さらに、微小管形成に重要な因子として、チューブリンのポリマー化に寄与するαTAT1と微小管の分解に寄与するHDAC6に着目すると、Runx2のC末端と結合することが見いだされました。HDAC6によるチューブリンのアセチル化が微小管によるオートファゴソームの流動性に寄与していることが示唆されました。さらに、MSによって熱ショックタンパク質HSP90とRunx2が相互作用することを示しており、HSP90がMAPをリクルートすることでαチューブリンの安定性を上昇させていることが示されました。以上のメカニズムによってRunx2は、特に転移がん細胞におけるオートファジーを促進させ、がん細胞の生存戦略に寄与することが示されました。

転写因子であるRunx2が転写活性でなく、タンパク質のリクルートの働きをすることで細胞内の動態を変化させていることは意外でした。微小管に注目するのは、マニアックな印象があり、複雑に感じました。

5. Joy Y Wu- PTH acts on PTH1R in both osteoblasts and breast cancer cells to reduce bone metastases
乳がん患者は、抗がん剤などの影響によって治療過程において骨粗鬆症になることが知られています。ビスホスホネート製剤を用いることは顎骨壊死などを起こす可能性があり、骨形成を促進させないと根本治療にならないことも問題です。本研究では、PTHが乳がん患者へ適用できるか、その安全性などに着目しました。

骨芽細胞におけるPTHRの下流Gsα KOは乳がん細胞の遊走を上昇させ、骨転移の上昇を示唆しました。同様に乳がん細胞におけるPTHRの下流Gsα KOはその遊走を上昇させ転移を促進しました。次に、乳がん細胞においてPTHの応答でPthrpの遺伝子レベルが減少していることを確認し、Pthrpが乳がんの抑制に寄与するか検討したところ、PthrpのKDが乳がんの遊走能を減少させることが分かりました。臨床関連では、乳がん患者においては、PTH1Rの発現が減少しており、PTHは骨芽細胞に作用することで、がん細胞の転移を抑制していました。さらに乳がん細胞自体にもPTHがPthrpの抑制を介して、乳がんの転移を抑制することが分かりました。

基礎研究的な側面を持ち、明確な臨床のための研究であり、理想的なストーリーであると感じました。今後の臨床現場において、乳がん患者にとってPTHがより重宝されるのではないでしょうか。

がんと骨転移について学ぶいい機会になりました。がんの転移は奥が深く、複雑でした。骨のNicheは、他の臓器での疾患（がん）に影響を受けやすいことが感じられました。がんになったから骨に影響が出たのか、骨に影響が出たからがんになったのか、特に3番目の発表ではそんなことを考えさせられました。また、10月でのASBMRの発表の参考にもなりました。

1. type C protein phosphataseであるPhlpp1/Phlpp2はそれぞれ海綿骨と皮質骨で発現してリモデリングをコントロールすることが示唆されました。また、Phlpp2の欠損は破骨細胞のコレステロール反応性を増強させることが明らかになりました。

2. 細胞質における脂肪分解は、骨芽細胞形成において、脂肪酸をエネルギー通貨として供給するために重要な役割を担うことが示唆されました。また、細胞質での脂肪分解の抑制は、骨芽細胞形成や生体内での骨形成に悪影響を及ぼし、逆に脂肪分解を促進することで、高脂肪食による海綿骨量の減少が抑制されました。

3. CypDの機能獲得マウスは、in vitroおよびin vivoにおいて、骨芽細胞活性の低下と有機マトリックスの欠乏を示しました。また、CypD/MPTP活性によって制御されたミトコンドリアの代謝は、発生、維持、骨折修復のいずれにおいても、骨の表現型を制御する重要な因子であることが示唆されました。発生と修復におけるエネルギー代謝と骨形成シグナルの分子動態や制御の影響を明らかにするためには、さらなる研究が期待されます。

骨芽細胞での研究の中でも、今まであまり触れてこなかった脂肪やミトコンドリアとの関係を勉強することができました。特に、二つ目の発表では、骨芽細胞における脂質分解の役割とその重要性が示されており、新たな着眼点を得るとともに、勉強になりました。

神経と筋肉のつなぎ目には多様なタンパク質が集積していて、神経筋接合部位の形成と維持に寄与しています。これらのタンパク質をコードする遺伝子に変異があると、先天性筋無力症という深刻な神経筋疾患が引き起こされます。先天性筋無力症の中で、DOK7タンパク質のC末端側に4塩基が重複する変異があるというタイプがあり、先天性筋無力症患者の10~20%にDOK7変異があることが知られている。しかし、DOK7変異が筋無力症を発症させる機序はよく分かっておらず、DOK7がMUSKと結合することでリン酸化シグナルをさらに下流の分子に伝える機構に異常を来すのではないか、と考えられていました。

今回、その仮説も検証するため、DOK7のC末端の4塩基を重複させたマウスと、C末端領域のリン酸化部位を点変異させたマウスを作製したところ、予想外にC末端領域のリン酸化部位を点変異させたマウスでは筋無力症の症状を示しませんでした。そこで原因として、MUSKに結合するDOK7の量が足りないのではないかと考えました。結果は予想通りで、4塩基重複変異体のDOK7の量は、野生型の約3分の1でした。量が足りないためにMUSKを安定化させることができず、MUSKのリン酸化が阻害されていたと考えられました。

次に、変異したDOK7の代わりにMUSKを安定化させることができる抗体をファージディスプレイ法を用いて抗体ライブラリを構築し、特異性の高い抗体を選択しました。この抗体を腹腔内に投与したDOK7変異マウスは、寿命が大きく伸び、運動能力も野生型マウスに近くなりました。

この論文を通してアセチルコリン受容体の維持機構のメカニズムについて深く学ぶことができて、自身の研究につなげたいと思いました。今回の治療は、2週間ほどしか生きられないマウスが繰り返し抗体を投与することによって通常通り成長するというインパクトがあるものでした。臨床への応用が期待されます。

本論文は、イタリア パドヴァ大学のステファノ　ピッコロ教授のグループによるものです。昔、ピッコロ教授は、UCLAのEddy De Robertis labで カエルの発生の研究をして、イタリアに戻ってからは、癌や機械シグナルに関する研究を精力的に行っておられます。自分がまだカエルの発生の研究をしていたときに、ピッコロ教授が国際学会で自分のポスターのところに来てくださり、ディスカッションしたことがあります。先方は覚えていないと思いますが。。。

加齢は、細胞の老化と密接な関係がありますが、今回、機械刺激を感知して核内に移行して機能するYAPとTAZという転写因子が、細胞老化の抑制に関与しているということが明らかになりました。

老化マウスでは、若いマウスに比べると、特に、間質細胞や、血管平滑筋細胞、心筋細胞、骨格系幹細胞で、YAP/TAZの活性が低下していることがわかりました。

YAP/TAZを線維芽細胞や血管平滑筋でノックアウトすると、若いマウスでも、細胞の老化現象が確認されましたが、逆に、老化したマウスの細胞に、YAPの発現をもどしてやると、細胞が若返りました。

さらに、YAP/TAZの細胞老化抑制機構には、自然免疫に関与するcGAS-STINGという経路が関わっていることが示されました。

YAP/TAZによる機械刺激シグナル伝達が低下すると、自然免疫の柱であるcGAS-STINGシグナルが放出され、老化が進むことがわかりました。

YAP/TAZによる機械刺激シグナル伝達を維持したり、STINGを阻害することは、老化に関連する炎症を抑制し、老化を改善するための有望なアプローチとなる可能性があります。

この論文では、ガスダーミンD (GSDMD)が骨のエンド-リソソーム成熟を制御することで、破骨細胞の骨吸収能を制限していることが報告されました。GSDMDはこれまで炎症性の細胞死であるパイロトーシスに関与するタンパク質として着目されてきましたが、今回、破骨細胞の恒常性にも関与していることが分かりました。 

マクロファージでは、活性化したカスパーゼ-1/11によるGSDMDの切断が、N末端（p30 NT）と自己抑制性のC末端（CT）の接合部位で起こり、それによってp30 NT産物が放出され、これが細胞膜上の酸性リン脂質に結合してオリゴマー化し孔を作ってパイロトーシスを引き起こすことが知られています。しかしながら、破骨細胞の分化過程で、さらに短いp20産物が生成されていることがわかりました。破骨細胞では、GSDMDはRIPK1依存的にカスパーゼ8, 同時に活性化するカスパーゼ3によって切断され、p20 フラグメントが産生されることが分かりました。また、GSDMD p20の骨吸収への影響を調べたところ、GSDMD p20は破骨細胞分化に影響せずに、骨吸収活性を抑制していることが示唆されました。

定量的プロテオーム解析を用いてGSDMD欠損で発現が変動するタンパク質について調べたところ、GSDMDが欠損した破骨細胞で、「リソソーム」「グリコサミノグリカン分解」の経路が濃縮されていることがわかりました。さらにGSDMDとリソソーム生合成との関連を調べると、GSDMD p20 は脂質膜PI(3)Pとの結合を介して初期エンドソームに局在し、エンド・リソソームへの輸送と成熟を制限し、破骨細胞の骨吸収活性を抑制していることが示唆されました。 

本論文はGSDMDの破骨細胞内における動きを新たに示した大変興味深い内容でした。また、セミナーでもお話がありましたが、破骨細胞分化ではなく骨吸収活性を制御する機能を持つという点で、骨粗鬆症治療などの新たな戦略となりえます。

この論文では、これまでリンパ管がほとんどないと思われていた組織の一つである骨に、リンパ管が存在していることが透明化技術によって３Dで示されました。さらに、Gorham-Stout症候群にも見られるように、骨のリンパ管は有害であるという考えがありましたが、これを覆すように、放射線による骨髄損傷と骨量減少において、放射線によって上昇・拡大したリンパ管が、それらの修復に重要であることが分かりました。

そのリンパ管を形成しているリンパ管内皮細胞（LEC）は、IL6, Vegfr3によって制御されることが知られていますが、放射線によってIL-6が上昇することで、LECの増殖を伴ったリンパ管形成が促進されました。その放射線によって増加したLECが、Cxcl12を産生することで、造血幹細胞（HSC）の修復や骨量減少の改善に寄与していることが分かりました。さらに、細胞系譜解析によってMyh11, Cxcr4陽性の周皮細胞が、Cxcl12と相互作用することで、骨髄抑制の改善と骨系細胞への分化を伴った骨修復に寄与していることが分かりました。

また、加齢と遺伝毒性の関連も示しており、老化したLECでは休止マーカーの上昇と細胞増殖マーカーの減少が示され、さらにCxcl12の産生も低下することが分かりました。この老化したLECではCxcl12の産生が低下するために、放射線による障害が強く現れますが、若年のマウス由来のLECを移植することで、この表現型の改善が見られたことから、若年期におけるLECの重要性を示しました。

今回の研究では、骨のリンパ管の遺伝毒性に対する修復の役割を見出しており、これまで骨のリンパ管は有害とされてきた考えを覆す結果となっており、非常に面白い論文でした。石灰化組織を透明化し、3Dで観察することは技術的に困難とされてきていましたが、今回の論文の手法やCUBIC-Bなど、近年の技術的進歩を感じました。そこで、石灰化組織の内部の観察について研究することは、インパクトが高い論文を書くことが出来そうなので、検討しようと思いました。

最後に、今回のJournal Clubでは、留学生を交えましたので、初めて英語で説明しました。拙い英語だったかもしれませんが、最後までお付き合いいただきありがとうございました。いつも以上の達成感でした。

加齢によるmTOR複合体1調節不全は、神経筋接合部（NMJ）の構造不安定化を引き起こします。しかし、この現象を仲介している下流のターゲットは解明されていません。本論文では、mRNAの翻訳のためのmTORC1のリン酸化ターゲットである、リボソームタンパク質S6キナーゼ1（S6K1）と真核生物翻訳開始因子4E結合タンパク質1（４EBP1）の役割を調査しています。

まず、mTOR経路上流のTSC1をKOしたマウスでは、mTORC1が活性化され、除神経が引き起こされました。そのマウスから筋線維特異的にS6K1を欠損させると、NMJの構造やリモデリングに影響を与えませんでした。しかし、筋線維で４EBP1が常に活性しているTSC1 KOマウスを作製したところ、NMJのリモデリングを誘導してアセチルコリン受容体(AChR)のターンオーバーが促進され、除神経している筋線維が減少しました。

また、筋線維で４EBP1が常に活性しているマウスのNMJのリモデリングの要因はサテライト細胞活性の増加によるものであることが示唆されました。

これらの結果と、AChRの筋核の減少やNMJのターンオーバーの低下が加齢の特徴であるということから、4EBP1活性化をターゲットとすることが、サルコペニアを緩和するための新たな戦略となると示されました。

本論文では、NMJのリモデリングや除神経を評価する実験を数多く行っていて、自分の研究に活かせるものもあり、勉強になりました。NMJの安定化にはmTORC1活性の厳密な制御が必要であり、そのメカニズムは完全には解明されていません。今後、サルコペニア治療に応用されることが期待されます。

身体運動は、一般的にヒトを含む動物の健康に有益であり、認知的な老化と神経変性を遅らせることが知られています。この認知機能への効果は、海馬の可塑性向上や炎症抑制に関連することが報告されていますが、詳細なメカニズムについては不明な部分が多くあります。

まず著者らは、エクササイズ血漿を同腹仔に移植すると、エクササイズ血漿が海馬における神経可塑性及び認知機能を向上させ、さらに炎症性遺伝子の発現を減少させることを示しました。また、エクササイズ血漿の移植は、急性誘発性の炎症を引き起こしたマウスの神経炎症に対して拮抗的に作用しました。エクササイズ血漿のプロテオーム解析から、エクササイズ血漿ではクラスタリン を含む補体カスケード阻害因子の発現が協調的に上昇していることが分かりました。エクササイズ血漿からクラスタリン を除くと、海馬における炎症性遺伝子レベルは高いままでしたが、急性脳炎症モデルマウスやアルツハイマー病モデルマウスに組換えクラスタリンを処理すると、インターフェロンシグナル伝達に関与する遺伝子等の異常な発現上昇が抑えられました。さらに、半年間運動を継続したヒトでも、クラスタリンの増加が見られました。以上のことから、自発的に走るマウスのエクササイズ血漿が神経炎症遺伝子発現のベースライン及び脳炎症を抑制し、このプロセスにクラスタリンが深く関与する可能性が示唆されました。

本論文では、Single-cell RNA-seqやプロテオーム解析といったシーケンスが多く用いられており、データの見せ方という点でも勉強になりました。本論文で示された結果から、組換えクラスタリンを認知障害のある個体に処理すると、実際に認知機能の回復や脳の若返りのような現象が見られるのかという点が気になりました。また、エクササイズ血漿には、大部分が肝細胞で産生される補体及び凝固タンパク質が多く含まれているという点が興味深かったです。運動が認知機能の維持に効果的であるということは広く知られており、そのメカニズムに迫る研究も進んでいますが、未だ不明な部分も多く、さらなるメカニズムの解明が期待されます。

 本日の論文は、当研究室が長年着目してきたCtdnep1遺伝子が、小児の悪性腫瘍である髄芽腫を引き起こすメカニズムを解明したものです。膨大な実験量と、私が長年取り組んでいたけど、うまく行かなかったことが、この論文では、全てうまく行っていて、脱帽的な論文です。

そもそものきっかけは、CTDNEP1遺伝子が、悪性度の高いグループ３の髄芽腫で遺伝子欠損しているということが、2012年と2017年にNatureに報告されたことに始まります。今回の論文の著者は、その時の論文の著者ではないので、このNatureの論文を見てから、研究に着手したと考えられています。Ctdnep1 floxマウスは、私達の長年の共同研究者の熊本大学の西中村教授から供与されています。

今回の論文では、グループ３の髄芽腫の全エクソーム解析のデータを解析して、Ctdnep1遺伝子欠損を再確認しています。興味深いことに、CTDNEP1欠損で、MYCという発がんに関わる遺伝子の染色体領域が増幅していることがわかりました。G3の髄芽腫の細胞を用いた実験により、CTDNEP1 mRNAを減少させると、細胞増殖が亢進し、反対に、過剰発現で細胞増殖が抑制されました。

次に、Nestin-CreとCtdnep1 floxマウスを用いて、神経前駆細胞でCtdnep1をノックアウトしたマウスでは、脳の形成が低下し、マウスが早い時期に死亡することがわかりました。癌と反対の表現型です。しかし、彼らは驚くべきことを見つけました。マウスの脳から取り出した細胞は、培養初期では、細胞増殖が低下するのですが、培養後期で、細胞増殖が増加したのです。

さらに、トランスクリプトーム解析、相互作用するタンパク質の同定、脱リン酸化する標的タンパク質の同定などを行い、CTDNEP1が、MYCのS62を脱リン酸化をするということがわかりました。CTDNEP1がないと、Mycが安定化して、染色体不安定性を引き起こし、さらに、p53遺伝子欠損を引き起こして、mycの増幅が起こるというのです。

また、CTDNEP1の標的として、染色体分離に関わるタンパク質を同定しました。そして、彼らは、Mycの発現を低下させるJQ1というブロモドメインの阻害剤と、細胞分裂のチェックポイントに関わるCHEK1阻害剤（prexasertib 現在臨床試験進行中）を併用することで、がん細胞の増殖を効率的に抑制することに成功しました。

以上の結果から、CTDNEP1がMYC活性と有糸分裂の忠実性を制御することにより、非常に悪性度の高いMYC駆動型の髄芽腫における腫瘍抑制因子であること、さらに、CTDNEP1欠損の髄芽腫に対しては、動物モデルと細胞モデルで、JQ1とprexasertibの併用療法が効果的であることが示されました。

最後に、グループ３の髄芽腫では、TGF-βシグナル伝達経路も上昇しているということが今回の論文でも再確認されていましたが、TGF-β受容体の阻害剤で処理しても、野生型とCtdnep1 cKOマウス由来の腫瘍細胞の細胞増殖には変化がなかったことが示されており、髄芽腫の細胞増殖の促進には、TGF-βシグナルは関係ないということも示しています。私たちは、発生初期の間葉系細胞でCtdnep1を欠損させたマウスでは、TGF-βシグナルが亢進して、軟骨の過形成と骨化遅延が起きることを過去に報告しましたので、Ctdnep1は、細胞の種類によって、制御するシグナル伝達が異なることが示唆され、大変興味深いです。

本当に脱帽です。当研究室にとって、バイブル的論文になりそうです。

1. Non-catalytic function of Dot1L histone methyltransferase regulate endochondral bone growth and development.

2. Phosphate-mediated activation of VEGFR2 induces Caspase-9 mediated apoptosis of hypertrophic chondrocytes during endochondral bone formation.

3. Reducing Smad2/3 Signaling by Deleting Alk4 in Skeletal Progenitors Increases Bone in Adult Mice.

TDP43はRNA結合タンパク質であり、RNAの代謝に関わっています。孤発性筋萎縮性側索硬化症(ALS)モデルの運動神経では、本来核に局在するTDP43が細胞質で封入体として蓄積しているということが知られています。ヒトSTMN2はTDP43によって発現調節されている遺伝子で、軸索再生関連分子であるstathmin2を発現しています。また、ヒト幹細胞由来の運動ニューロンでTDP43をノックダウンするとSTMN２の発現量が減少します。しかし、in vivoでのStmn2オルソログの役割については知られていません。本研究ではStmn2機能欠損マウスを作成し、in vivoでのStmn2の役割を解明することを目的としています。Stmn2欠損マウスを作成したところ、運動障害が見られました。神経筋接合部ではシナプスの接続に異常が見られ、除神経に特徴的なアセチルコリン受容体の断片化、筋修復に特徴的な核の中心への移動が見られました。また、Stmn2欠損マウスの腰髄では重合しているβ-Ⅲチューブリンが減少していて軸索の伸長に異常があることが示唆されました。一方、運動ニューロン、アストロサイト、ミクログリア、TDP43の量や局在には変化が見られませんでした。これらから、Stmn2が欠損することで神経での微小管伸長が障害され除神経が起きるというメカニズムによって、運動障害が見られたということが示唆されました。また、Stmn2欠損マウスにヒトSTMN2遺伝子を導入すると、運動障害、神経筋接合部の表現型ともにレスキューされました。この結果はTDP43 の異常があるALS患者における STMN2 発現の回復が、運動軸索機能を改善するという治療戦略ができる可能性を見出し、Stmn2欠損マウスが前臨床評価のためのモデルとなることを示しています。神経筋接合部の実験については自身の研究に活かせることが多く参考になりました。TDP43が制御している遺伝子は他にも知られており、それぞれがこのような複雑なメカニズムで神経障害を起こしていると考えるとALSの病態の解明は難しいなと感じました。

　傷害後に安静にすることは、傷害部位の保護と痛みの減少、回復の促進といった効果があることは知られていますが、そのメカニズムは不明でした。安静にしている場合、生体内への機械刺激が減少しますが、この機械刺激の研究は3D培養といった様に人工的な条件で研究されていることが多く、生体内の細胞外基質の状態などは模倣しきれていませんでした。

　本研究では、重症誘発性の異所性骨化(HO)を用いてscRNA-seqの結果より上昇した機械刺激に関して着目し、その機械刺激シグナルに関するFAKやYAP/TAZの阻害、外科的な関節固定によってHO形成を抑制しました。このことから機械刺激の抑制がHOの治療に貢献することが示唆されます。

　さらに、関節不動状態における生体内の細胞外基質の状態について観察すると、運動したマウスと比べて、細胞外基質が乱雑かつ高密度な状態となっており、細胞形態に関しても遊走能や広がりの減少などが観察されました。この細胞についてみると、TAZのシグナルが減少しており、タンパク質レベルでは軟骨形成のTGF-βシグナルの減少と脂肪転写因子のPPARγの上昇が確認され、骨ではなく脂肪形成に寄与していることが分かりました。また、scRNA-seqやscATAC-seqで解析すると骨よりも脂肪形成に関する遺伝子の上昇が見られ、関節不動が細胞外基質の様子を変化させ、その環境における細胞の脂肪形成の遺伝子レベルを上昇させることで異所性骨化を抑制するといったメカニズムを解明することができました。

　この研究結果から、FAK阻害剤を含む機械刺激の変化が医療へ応用されることが期待されます。

　機械刺激に関する実験は検討中で考察の仕方や実験の進め方は参考になりました。機械刺激シグナル伝達について理解を深める良い機会となりました。細胞外基質の様子が幹細胞へ影響すること、組織切片の空間を脂肪と予想して実験を進める点も興味深かったです。

グルココルチコイド（GC）は様々な臓器で遺伝子発現を制御することから、多くの生理学的プロセスに影響を与える生体恒常性の重要な調節因子とされています。骨において、GCがオステオカルシンの発現を阻害することは知られていますが、骨が副腎機能を調節することについてはあまり知られていません。本論文では、マウスとサルにおいて、オステオカルシンがGCと古典的な内分泌フィードバックループを形成し、副腎ステロイド産生を促進することが示されました。

成体マウスやアカゲザルにオステオカルシンを投与すると、副腎ステロイドの血中濃度及び副腎ステロイド生成酵素などの遺伝子の発現が顕著に上昇しました。胎生期におけるオステオカルシンの曝露は副腎の成長を促し、出生後の副腎皮質ホルモン産生を促進しましたが、逆に胎生期にオステオカルシンが阻害されると、成体で副腎ステロイドによって制御される生理機能が阻害されたことから、胎生期のオステオカルシンが生体恒常性にまで影響を与えることが示されました。加えて、この内分泌フィードバックループにおけるオステオカルシンが視床下部-下垂体-副腎系とは無関係に制御されていることが示唆されました。

以上から、胎生期のオステオカルシンが副腎の成長を介して成体の生理機能に影響を与える、というオステオカルシンの新たな機能が示されました。出生後の副腎の大きさや血中K+濃度などが、胎生期のオステオカルシンに依存するという点が興味深かったです。出生後にオステオカルシンを投与することで副腎ステロイド産生が顕著に上昇したことから、副腎機能不全の治療開発につながる可能性があるのかが気になるところでした。また、サルを用いた実験やホルモンの測定方法などといった実験手法を学ぶことができ、勉強になりました。

Ca2+依存性Cl-チャネルAnoctamin 1が、破骨細胞の酸分泌に必要なCl-の細胞外排出を促進するだけではなく、RANKL刺激依存的にRANK受容体と結合することで、下流のCa2+シグナル経路の活性化を促進したり、RANKとTraf6との結合性を強めることで、Nf-kB経路、AKT経路、MAPK経路の活性化を促進した結果、破骨細胞分化を促進することを明らかにした内容でした。これまでのCl-チャネルの研究と異なる点として、酸分泌のみならず破骨細胞の分化そのものにも寄与している点が興味深かったです。また、破骨細胞特異的Ano1マウスの骨表現型を解析し、Ano1 KOで破骨細胞数の減少、それに伴う骨量の増加を示しただけではなく、破骨細胞特異的Ano1過剰発現Tgマウスも作製することで、一貫した表現型のデータを示していました。さらに、骨粗鬆症との関連として、骨粗鬆症患者ではAno 1が高発現していることを示しており、イオンチャネルはGPCRに続いて、治療標的となりえる膜タンパク質であるため、Ano1は骨粗鬆症の有望な治療標的であると考えられます。

今回の論文は，かつての共同研究者のピッツバーグ大学のJean-Pierre Vilardaga教授の論文です。副甲状腺ホルモン（PTH）は，骨吸収を促進することで，血中カルシウム濃度の調整に重要な役割を持つホルモンです。不思議なことに，副甲状腺ホルモン製剤は，一日一回または週に一回皮下投与されると，骨量が増加することから，骨粗鬆症の治療に用いられています。副甲状腺に関わる病気としては，副甲状腺機能低下症や副甲状腺機能亢進症が知られています。

副甲状腺ホルモンは，アミノ酸からなるペプチドで，胃や腸で消化されてしまうので，経口投与できません。そこで，経口投与可能な副甲状腺ホルモン受容体に作用する低分子化合物の開発が大いに求められています。

今回の論文では，複雑な分子動力学シミュレーションを用いて，低分子化合物が結合しやすいアロステリック部位（受容体の基質が結合する本来の場所とは違う場所）の同定とそこに結合する低分子化合物の同定に成功しました。その結果，Pitt8とPitt12という低分子化合物が，PTHのシグナル伝達を抑制する効果を持つことが示されました。実際に，Pitt12を動物に投与すると，PTH投与による血清カルシウム濃度の上昇を抑えられました。このことから，今回発見した低分子化合物は，副甲状腺機能亢進症の治療薬の候補として期待されます。

今回，非常に複雑なシミュレーションや受容体の立体構造に関する内容で，理解するのが非常に困難でした。ハイスループットスクリーニングという，ある意味ランダムな手法に比べて，非常に効率的に，創薬標的分子に結合する化合物を見出すというエレガントな手法に感銘を受けました。特に，ペプチドホルモンが結合するようなクラスBのG-タンパク質共役型受容体（GPCR）に対しては，経口投与可能な薬物が求められており，今回の手法を他のクラスBのGPCRにも応用できるのではないかと思いました。

　関節リウマチ(RA)はいまだに原因がよくわかっていない自己免疫疾患で、ヒュミラ（アダリムマブ）といった抗体医薬などが利用されますが、高価であることなどの難点がまだあります。RAは滑膜の線維芽細胞が一つの原因とされており、本研究ではこの滑膜線維芽細胞に着目しました。

　これまで、解剖学的には、滑膜直下の線維芽細胞をPRG４陽性のライニング（表層）線維芽細胞、さらにその内側に存在するTHY1陽性のサブライニング（深層）線維芽細胞の存在が知られていました。そのうちのTHY1陽性線維芽細胞の方が悪玉であることが報告されましたが、その実際の病態への寄与や分化メカニズム、シグナル伝達などは不明でした。

　その線維芽細胞は内皮細胞に近づくほどにTHY1の遺伝子発現が高く、解剖学的な位置と遺伝子発現の勾配が相関することが分かりました。さらに、血管内皮細胞由来のリガンド(DLL4, JAG1)が、線維芽細胞上に存在する受容体(NOTCH3)に作用し、THY1遺伝子発現を上昇させ、サブライニング線維芽細胞のプールをつくることで、RAの症状を発症させることを解明しました。マウスへのNotch阻害でRAのレスキューが出来たことから、RAへの新たな治療標的として、Notch阻害剤が示唆されました。

　動脈が存在すると、そこからNotchリガンドがでることで、線維芽細胞へ影響を与えることが分かったことは、今後血管浸潤といった表現型に対する考察の幅が広がりました。また、原因細胞の同定ができたとしても、悪玉サブセットの存在を考慮すべきと思えました。

　原因細胞とそのシグナルを同定する手順や示し方は、とても綺麗なものでした。対して、scRNA-seqの強さとハーバード大学の研究の大胆さに圧倒されました。

RNA結合タンパク質(RBPs)の凝集は、RNA-タンパク質複合体の濃度や局在を調節しています。筋萎縮性側索硬化症(ALS)の病態の中心はRBPであるTDP43というタンパク質の変異です。TDP43の多くの変異はC末端ドメイン(CTD)で起きていることが知られています。この研究ではCTDのうちいくつかの領域を欠損させた変異体を作成したところ、conserved region(CR)という領域欠損の変異体で、TDP43の核内での凝集が起きにくくなることが分かりました。

次に、タンパク質のRNA上の結合部位を決めるiCLIP法を用いて、WTとCR欠損変異体を比較しました。すると、CR欠損により結合しづらくなる部位とCR欠損しても結合できる部位があることが判明しました。同様にRNAの長さによる結合のしやすさについてWTとCR欠損変異体で比較すると、100nt以上の長いRNAではCR欠損により結合しづらくなり、それ以下の短いRNAではCR欠損しても結合することが判明しました。これらの結果から、長いRNAの特定の配列ではCR依存的にTDP43がRNAに結合することが分かりました。

このようなCR依存的な配列はTDP43をコードするTARDBPにも含まれており、通常はTDP43がTARDBPに結合してRNAプロセシングを制御しているものの、CR欠損変異体ではRNAプロセシングが亢進しTDP43タンパク質が増加することが分かりました。この研究の成果はTDP43のRNA制御のメカニズムの一部を解明していて、ALSなどの病態治療に応用されることが期待されます。また、TDP43については多くの論文が書かれているものの機能の全貌が明らかになっておらず、興味深いタンパク質だと感じました。

「SLPIは、PTH誘導性の骨形成を制御する重要なメディエーターである」

PTHは、骨吸収から骨形成への移行を促進して骨形成を促進することから、骨粗鬆症の治療薬として用いられています。PTHの同化作用には破骨細胞による骨吸収が必要であるとされていますが、PTHが骨芽細胞及び破骨細胞を協調的に制御するメカニズムは不明です。

今回の論文では、網羅的遺伝子発現解析から、セリンプロテアーゼ阻害作用を持つSLPI（secretory leukocyte protease inhibitor）の発現がPTHによって上昇することを見出しました。SLPIは、骨芽細胞自体の中で作用して遺伝子発現を制御することで、骨形成を促進しました。また、生体多光子顕微鏡を用いて、骨芽細胞と破骨細胞による骨リモデリングを可視化したところ、SLPIが骨芽細胞の破骨細胞に対する接着能を増強し、骨芽細胞と破骨細胞の細胞間コミュニケーションを促進することを示しました。この研究グループは以前、骨芽細胞と破骨細胞の直接的な接触が、破骨細胞の骨吸収活性を阻害することを報告しました。

これらのことから、SLPIは、骨芽細胞による骨形成を促進すると同時に、骨芽細胞の周りに破骨細胞を引き寄せることで、骨吸収を抑制することが示唆されました。PTHがSLPIを標的とし、骨芽細胞と破骨細胞の細胞間コミュニケーションを促進するという結果でしたが、SLPIがこれらの細胞を制御する、より詳細なメカニズムの解明が期待されます。

今回の論文を発表した研究グループは、生体の骨内部の観察を世界に先駆けて行っており、今回の論文でも生体の骨芽細胞及び破骨細胞を観察することで、SLPIの役割を明らかにしました。骨は石灰質に囲まれた硬い組織であるために、これまで生体での観察は困難でしたが、生体の多光子励起イメージングの活用により、今までは見えなかった生体における骨や骨髄のさらなる機能が明らかになることと期待されます。

「頭蓋縫合再生により、頭蓋縫合早期癒合症における頭蓋骨および神経認知障害が緩和する。」

本研究では、冠状縫合の早期癒合を呈するTwist1+/-マウスにおいて、頭蓋内圧亢進による認知機能低下を明らかにし、頭蓋縫合早期癒合症のモデルマウスとして有用であることを明らかにしました。また、このマウスに対して、Gli1＋間葉系幹細胞とゼラチンベースのGel-MAを組み合わせた縫合再生手術を行うことで、6か月以上維持される縫合が再生され、その結果、頭蓋骨形成異常・頭蓋内圧亢進や脳体積低下が改善され、認知機能が向上するという内容でした。特に、縫合再生には硬膜組織の内在性Gli1+細胞が移植組織中に動員されることが必須であり、外因性Gli1＋を含む移植組織が内在性Gli1＋細胞を誘導するニッチを形成していることが興味深かったです。縫合再生のさらなる分子メカニズムが明らかになれば、より簡便で侵襲性の低い治療法確立が期待されるため、今後の研究が興味深いです。

「RANKL刺激による骨吸収の際に破骨細胞はオステオモルフを介してリサイクルする」

一年ほど前にCellに掲載されたオステオモルフ発見の論文です。破骨細胞は，骨を吸収する細胞ですが，破骨細胞分化誘導因子RANKLの刺激によって，単球・マクロファージ系の細胞が融合して，巨大で多数の核をもつ破骨細胞へ分化します。破骨細胞は，骨粗鬆症，関節リウマチ，骨パジェット病，癌の骨転移等の病理学的なプロセスにおいて，重要な役割を持っており，生体内での破骨細胞の活動を理解することは臨床的にも重要です。今回の論文では，二光子励起顕微鏡という特殊な顕微鏡を用いて，破骨細胞の生体内ライブイメージングが行われました。その結果，破骨細胞がRANKLで刺激されると，一部が，分裂と融合を繰り返すということが発見されました。著者らは，破骨細胞から分裂した小さな細胞をオステオモルフと名付けました。興味深いことに，RANKLのシグナル伝達を阻害した後，しばらくすると，破骨細胞が非常に活性化されるということも見いだされました。このことは，デノスマブなど抗RANKL抗体休薬後に，骨折や著しい骨減少が起こるという臨床報告と関連している可能性が示唆されました。オステオモルフを単離する方法を開発して，シングルセルRNA-seqを行った結果，オステオモルフは，破骨細胞とも単球・マクロファージとも異なる遺伝子発現パターンを示していました。さらに，著者らは，オステオモルフで発現が上昇している遺伝子に着目し，ノックアウトマウスのデータベースを検索すると，それらの遺伝子の内17遺伝子が，骨量および骨強度に関与することが判明しました。さらに，著者らは，ヒトのバイオバンクのデータベースを検索することにより，オステオモルフで発現上昇する遺伝子の内，22個が，単一遺伝子による骨系統疾患と関連し，71個の遺伝子がヒトの骨密度の変化と相関がありました。今回，これまで骨代謝と関連するとは知られていなかった遺伝子を複数発見されましたが，オステオモルフ遺伝子が，単一の遺伝子変異で起こる骨系統疾患と骨粗鬆症など多因子でおこる骨格疾患のどちらにも関与していることが示されたのは興味深いと思います。オステオモルフが骨の恒常性と疾患において重要な役割を果たすことが示され，将来の創薬のための貴重な資源となることが期待されます。

破骨細胞の研究は，非常に盛んに行われていますが，このようにまだまだ新しい現象が見つかるとは驚きです。破骨細胞研究は奥が深いですね。

本日は、２０２１年のアメリカ骨代謝学会のMusculoskeletal Development（筋骨格系の発生）の口頭発表のセッションを視聴しました。内容は以下の４つの演題でした。今年は、当研究室から１名が参加しますが、その予行練習にもなりました。

1. 細胞張力に関係するYAP/TAZの骨芽細胞前駆細胞における機能を解析したところ、YAPとTAZは、出生前の骨形成において、骨芽細胞による自律的な骨形成と骨・血管形成の結合の重要なメディエーターであることが明らかとなりました。

2. Matrix Gla タンパク質（MGP）は、細胞外マトリックス（ECM）の石灰化を強力に抑制するタンパク質ですが、最近、MGPの細胞外への分泌に必要なシグナルペプチドの切断部位に突然変異を持つ骨系統疾患の患者が報告されました。今回の発表では、同じ変異をもつマウスを作製し、この変異体では、シグナルペプチドが保持され、タンパク質の分泌障害、細胞内タンパク質の蓄積、小胞体ストレス、細胞死が引き起こされることが明らかにされました。

3. 400人以上の患者から採取した骨格系幹細胞を用いて、シングルセルトランスクリプトーム解析を行った結果、加齢に伴う骨格の脆弱化や非組織化、線維性異形成症や腫瘍性骨格疾患の発症には、骨格系幹細胞の多様性の変化が重要であることが示唆されました。

4. キャッチアップ成長とは、一時的に成長が阻害された後に、生物の成長が加速されるという現象です。この現象には、成長板軟骨の静止領域の細胞が関与している可能性が示唆されていましたが、その背景にある細胞・分子機構は不明でした。成長版の静止領域の幹細胞を標識する事ができるマウスを用いて、実験を行ったところ、カロリー制限すると、幹細胞の増殖が加速され、増殖軟骨細胞への分化が抑制されていることがわかりました。カロリー制限を解除すると、幹細胞が速やかに増殖軟骨細胞への分化を再開し、対照群のマウスに成長が追いつきました。どのようなメカニズムでカロリー制限が、静止領域の幹細胞の増殖と分化を制御するのか、解明が期待されます。

1. Collins, Joseph, et al. "YAP and TAZ mediate osteogenic-angiogenic coupling during prenatal development." JOURNAL OF BONE AND MINERAL RESEARCH. Vol. 37. 111 RIVER ST, HOBOKEN 07030-5774, NJ USA: WILEY, 2022.

2. Gourgas, Ophelie, et al. "Understanding how a novel heterozygous variant in matrix Gla protein gene causes skeletal anomalies." JOURNAL OF BONE AND MINERAL RESEARCH. Vol. 37. 111 RIVER ST, HOBOKEN 07030-5774, NJ USA: WILEY, 2022.

3. Ambrosi, Thomas, et al. "Tractable Human Skeletal Stem Cell Diversity Shapes Bone Development and Regeneration." JOURNAL OF BONE AND MINERAL RESEARCH. Vol. 37. 111 RIVER ST, HOBOKEN 07030-5774, NJ USA: WILEY, 2022.

4. Oichi, Takeshi, et al. "Lineage tracing of Axin2+ cells revealed dynamic behavior of chondroprogenitor cells in the growth plate during temporal growth inhibition and catch-up growth." JOURNAL OF BONE AND MINERAL RESEARCH. Vol. 37. 111 RIVER ST, HOBOKEN 07030-5774, NJ USA: WILEY, 2022.