蛋白質溶液学（酵素とLLPS）

酵素と液-液相分離

液-液相分離（LLPS）は、物質が均一な一相でいるよりも、二相に分かれた方が熱力学的に安定なときに起こる現象です。水と油のような混ざりにくさに加えて、特定の分子同士の好ましい相互作用によって集合しやすくなる場合にも生じ、タンパク質の相分離は主に後者の機構に基づきます。生命科学では、タンパク質やRNAが特異的な複合体形成だけでなく、よりゆるやかで流動的な、五次構造の階層に位置する液滴（ドロプレット）を作って機能する点が注目されています。酵素も細胞内ではLLPSした状態で働く例が多く、希薄な試験管内溶液で調べられてきた姿とは異なる状態こそが本来の姿だと考えられます。ドロプレット形成には、天然変性領域をもつタンパク質やRNAが足場分子として関与し、酵素や基質、低分子、イオンなどを集めることがあります。またLLPSは熱力学的に安定な状態の一つであるため、ドロプレットの成分や濃度に応じて安定性や性質が変化します。

参考：液-液相分離（脳科学事典）

◆一般論としての液-液相分離と酵素活性

液-液相分離によるドロプレットの状態を形成した酵素は、反応にどのような影響があるだろうか。高分子電解質を添加することで、酵素・基質・高分子電解質の液-液相分離により液滴（ドロプレット）が形成された場合、酵素活性に与える影響は複雑だが、促進的要因と抑制的要因のいずれもあり得る。

活性化については、主に２つの要因が考えられる。液-液相分離によって形成されるドロプレットは、外部のバルク溶液（すなわち外部にある通常の水相の環境）と比べて、分子の種類や濃度、溶媒和の状態が大きく異なる。ドロプレットは高濃度の高分子やイオンが詰まった溶液であり、自由水の割合が少ない環境である。まず、区画化による高濃度効果が考えられる。すなわち、酵素と基質がドロプレット内に濃縮されることで、実効的な濃度が上昇する。とりわけ基質がKMよりもかなり低濃度の条件では、濃縮された分だけ活性が増加する。基質の濃度が極端に薄い条件では、ドロプレットを形成することで数十倍も活性が高くなるように観察されるケースもあるだろう。さらに、ドロプレットの内部は外部と比較して疎水性が高く、混み合った環境である。このような溶液環境では酵素の活性部位の配置が安定化され、酵素構造がより触媒に適した状態になる可能性があるだろう。このケースではkcatの増加として観察される。また、疎水性の基質の場合、水溶液中と比較してドロプレットの内部の高い疎水性によって分散性が高くなり、KMが低下することもあるだろう。

活性の抑制効果についても３つの要因が考えられる。まず思いつくのは拡散制限である。ドロプレット内部は粘度が高く、混み合った環境であるため、酵素と基質の会合頻度が減少して反応速度が下がる可能性がある。この影響が出る場合にはKMの増加として現れる。さらに、酵素のネイティブ構造の不安定化がある。高分子電解質による静電的ストレスや非特異的相互作用により、酵素が部分的にアンフォールドすることもあるだろう。このケースではkcatの低下として観察される。また、基質が濃縮されることで、基質阻害や生成物阻害のような悪影響が出る可能性もある。

◆ドロプレットによる酵素活性化のメカニズム

液-液相分離によってドロプレットを形成すると、酵素などの分子が高濃度で局在するため、一般的には粘度が上昇する傾向がある。これは分子同士の衝突頻度が高まり、拡散係数が低下するためである。しかし興味深いことに、酵素が反応することによってドロプレットの粘度が逆に低下するという報告もある（7）。これは、酵素の触媒作用に伴って基質や生成物の濃度が変化したり、さらに酵素自身の構造が柔軟化したりすることで、分子レベルの動態が変化し、ドロプレット内部のネットワーク構造が緩むためと考えられる。つまり酵素を含むドロプレットは、単なる高濃度の反応場としてだけでなく、酵素活性に応じて粘度や分子の可動性が動的に変化する性質を持つ可能性がある。

酵素活性には、ある程度の構造的な揺らぎ（フレキシビリティ）が必要とされる。例えば、20 kDa程度の小型酵素であるアデニル酸キナーゼでは、尿素を約1 M添加すると活性がむしろ高まるという報告がある（8）。これは、尿素がタンパク質間の弱い相互作用を部分的に解離させることで、酵素分子に柔軟性を与え、立体構造の動的変化を促進しているためと推察される。このように、ドロプレット内部においても、タンパク質間の結合を弱める溶質が濃縮されることで、酵素活性に必要な揺らぎを生み出し、活性を高める可能性がある。

さらに、酵素ではなく短鎖ペプチドにおいても、ドロプレット形成による活性向上の例が示されている（9）。脱リン酸化活性をもつペプチド（KVYFSIPWRVPM-NH₂）は、ペプチド濃度やNaCl濃度を調節することで相分離し、ドロプレットを形成する。このドロプレットはリン酸化アルブミンを効率的に取り込み、基質濃度を局所的に高めることで反応を加速する。実際に、KMが2桁低下し、kcatが2桁増加するという大幅な活性化が報告されており、結果的に15,000倍も活性化した。もともと活性が低い系では、こうした濃縮効果による劇的な活性化がより顕著に現れるのかもしれない。

参考文献

1. 浦朋人, 白木賢太郎. 液 - 液相分離による酵素連続反応 細胞内にある代謝の理解. 実験医学 37 (18) 3083-3088, 2019.

2. Tsang B, Pritišanac I, Scherer SW, Moses AM, Forman-Kay JD. Phase Separation as a Missing Mechanism for Interpretation of Disease Mutations. Cell. 2020 Dec 23;183(7):1742-1756.

3. Aumiller Jr, W. M., & Keating, C. D. (2016). Phosphorylation-mediated RNA/peptide complex coacervation as a model for intracellular liquid organelles. Nature chemistry, 8(2), 129-137.

4. Nobeyama T, Furuki T, Shiraki K. Phase-Diagram Observation of Liquid-Liquid Phase Separation in the Poly(l-lysine)/ATP System and a Proposal for Diagram-Based Application Strategy. Langmuir. 2023 Dec 5;39(48):17043-17049.

5. Patel A, Malinovska L, Saha S, Wang J, Alberti S, Krishnan Y, Hyman AA. ATP as a biological hydrotrope. Science. 2017 May 19;356(6339):753-756.

6. Klein, I. A., et al., & Young, R. A. (2020). Partitioning of cancer therapeutics in nuclear condensates. Science, 368(6497), 1386-1392.

7. https://www.biorxiv.org/content/10.1101/2024.09.28.615560v2

8. Rastogi, H., Singh, A., & Chowdhury, P. K. (2023). Towards the energy landscape of adenylate kinase in crowded milieu: Activity, conformation, structure and dynamics in sequence. Archives of Biochemistry and Biophysics, 743, 109658.

9. Reis, D. Q., Pereira, S., Ramos, A. P., Pereira, P. M., Morgado, L., Calvário, J., ... & Pina, A. S. (2024). Catalytic peptide-based coacervates for enhanced function through structural organization and substrate specificity. Nature Communications, 15(1), 9368.

◆乳酸酸化酵素と液-液相分離

乳酸酸化酵素（lactate oxidase）は、乳酸をピルビン酸に酸化し、同時に酸素を過酸化水素に還元する酸化還元酵素である。常温での活性は、KMがおよそ0.1 mM程度、kcatが数百/sec程度である。補酵素としてフラビンモノヌクレオチドを用いる。ホモ四量体を形成して働く酵素で、単量体に解離すると立体構造が不安定化されて酵素活性が著しく低下する。代表的な産業応用例として、乳酸酸化酵素は血中や食品中の乳酸濃度を測定するバイオセンサーがある（1）。

乳酸酸化酵素はドロプレットを作らせると酵素活性が増加することが報告されている（2）。乳酸酸化酵素とポリリシンを混合すると、両者はドロプレットを形成する。このドロプレットは比較的小さく硬いものだが、ここに5 mMの硫酸アンモニウムを加えるとゲルのようなドロプレットになり、10 mMの硫酸アンモニウムを加えると見た目にも柔らかそうな球状になり、流動性の高いドロプレットになった。低イオン強度で硬いドロプレットができ、わずかにイオン強度を増加させる程度で柔らかく変化したことから、このドロプレットの安定化は静電相互作用が重要な役割を担っていると考えられる。

硫酸アンモニウムを加えない条件で、ポリリシンとドロプレットを形成した乳酸酸化酵素の活性を測定するとおよそ400倍にも増加した。ドロプレットを形成するとkcatが約6倍に増加し、KMが1.5%にまで低下した。kcat / KMで比較すると、分散した状態と比べてドロプレットを形成すると400倍も増加したことになる。kcat / KMの具体的な数値では、1.1 /mM/秒から420 /mM/秒であった。ここに硫酸アンモニウムを加えていくことで柔らかいドロプレットを形成させた場合、kcatが約4倍に増加し、KMもおよそ10分の1に低下した。このときでもなお、kcat / KMで比較するとドロプレットを形成すると活性が約40倍も増加した。

KMの低下については、ポリリシンとドロプレットを形成した酵素の周囲に基質となる乳酸が集まりやすくなったという理解でよいだろう。なぜなら、ポリリシンは正電荷を、乳酸は負電荷を持っており、静電相互作用により安定化されるからである。それにしても、KMはかなり小さくなることがわかる。一方、kcatの増加は、現時点ではまだ明らかではないが、ポリリシンを添加することで酵素反応の遷移状態が安定化し、反応が進みやすくなったことを意味する。構造を考えると、活性中心のアミノ酸残基の安定化や、酵素基質複合体の構造の安定化、多量体の安定化など複数の仮説が立てられるだろう。

なお、乳酸酸化酵素だけでなく、乳酸脱水素酵素やピルビン酸酸化酵素、アセトアルデヒド脱水素酵素などの酸化還元酵素も、ポリリシンと液滴を形成して活性が増加することが報告されている（3）。そのため、特定の酵素に対する特定のメカニズムではなく、ある程度の一般的な活性化メカニズムがあるのだと考えている。

参考文献

1. Moradi, S., Firoozbakhtian, A., Hosseini, M., Karaman, O., Kalikeri, S., Raja, G. G., & Karimi-Maleh, H. (2024). Advancements in wearable technology for monitoring lactate levels using lactate oxidase enzyme and free enzyme as analytical approaches: a review. International Journal of Biological Macromolecules, 254, 127577.

2. Ura, T., Kagawa, A., Sakakibara, N., Yagi, H., Tochio, N., Kigawa, T., Shiraki, K., & Mikawa, T. (2023). Activation of L-lactate oxidase by the formation of enzyme assemblies through liquid–liquid phase separation. Scientific Reports, 13(1), 1435.

3. Ura, T., Sakakibara, N., Hirano, Y., Tamada, T., Takakusagi, Y., Shiraki, K., & Mikawa, T. (2023). Activation of oxidoreductases by the formation of enzyme assembly. Scientific Reports, 13(1), 14381.

◆酵素の連続反応と代謝の理解

液–液相分離によって形成されるドロプレットは、特定の分子を選択的に濃縮あるいは排除する性質を持つ。この選択的な分配により、基質濃度を局所的に高めることや、生成物によるフィードバック阻害を緩和することが可能になる。また、複数の酵素が同一ドロプレット内に共存することで、連続酵素反応の効率が向上する可能性があるだろう。

代謝酵素が空間的に集合し、機能的な反応単位を形成するという概念は、Srere によりメタボロン（metabolon）として提唱された（1）。メタボロンは、代謝経路を構成する酵素群が動的に会合し、反応効率を高めるという機能的集合体の概念である。近年では、酵母において代謝酵素が可逆的に凝集し、相分離様の構造体を形成する現象が報告され、これらは Metabolic Enzymes Transiently Assembling (META) body と呼ばれている（2）。META body は、メタボロン概念を細胞内凝縮体の観点から再解釈する実験的な例と位置づけられる。

さらに、酵素反応の中間体を拡散させることなく次の酵素へ受け渡す基質チャネリングの効率は、酵素間の距離に依存する。理論的な解析および実験系を組み合わせた研究では、酵素間の距離がおよそ 10 nm 以下である場合、中間体が拡散することなく連続的に反応が進められるとされる（3）。このような距離の制約を満たすためには、ペプチドなどによって物理的に結びつける方法だけでなく、分子同士が可逆的に集合できる動的なドロプレットの方が有利である。例えば、酵素を物理的に連結し、活性中心を集める方法では酵素の種類が増えるほど現実的に不可能になるが、ドロプレットであれば動的に酵素が集合しているために、反応中間体が拡散することなく酵素集合物の中にトラップすることができる。すなわち、液-液相分離を利用した酵素のドロプレットは、基質チャネリングを実現するための柔軟な空間制御機構として理解することができる。

参考文献

1. Srere, P. A. (1985). The metabolon. Trends in Biochemical Sciences, 10(3), 109–110.

2. Miura, N. (2022). Condensate formation by metabolic enzymes in Saccharomyces cerevisiae. Microorganisms, 10(2), 232.

3. Castellana, M.; Wilson, M. Z.; Xu, Y.; Joshi, P.; Cristea, I. M.; Rabinowitz, J. D.; Gitai, Z.; Wingreen, N. S. (2014). Enzyme clustering accelerates processing of intermediates through metabolic channeling. Nature biotechnology, 32(10), 1011-1018.

◆代謝酵素の連続反応

酵素の連続反応に伴い、液–液相分離によるドロプレットの形成と消失が試験管内で再現された例が報告されている（1）。この研究では、ATP や NADP といったヌクレオチドをポリリシン（PLL）と混合することでドロプレットを形成させ、その局在場を連続反応の出発点として利用している。

最初の段階では、ヘキソキナーゼ（HK）が ATP を消費して反応を進行させる。ATP が ADP へと変換されるにつれて、ATP/PLL によって形成されていたドロプレットは縮小・消失する。これにより、HK の局在状態も変化し、酵素はドロプレット相から溶液相へ再分配されると考えられる。続いて、HK により生成されたグルコース-6-リン酸は、次段階の酵素であるグルコース-6-リン酸デヒドロゲナーゼ（G6PDH）の基質となる。この反応では NADP⁺ が還元され NADPH が生成する。生成した NADPH は PLL と強く相互作用し、新たなドロプレットの形成を誘導する。

このように、反応の進行に伴って ATP/PLL を足場とするドロプレットが解消し、代わって NADPH を含むドロプレットが形成されるという動的な転換が、連続反応系の中で観察されている。すなわち、補因子の化学状態の変化が、ドロプレットの安定性を制御するスイッチとして機能していることを意味する。このドロプレット介在型の連続反応系では、ドロプレットを形成しない均一系と比較して、最終生成物の生成が促進されることが示されている。すなわち、酵素反応が進むことによって、基質や補酵素、生成物の局在がそれら自身によっても影響を受け、反応効率に影響を与えることを意味する。

細胞内においても、代謝酵素が空間的に集合して反応効率を高めるという概念はメタボロン（metabolon）として古くから提唱されている（2）。ドロプレットによる酵素や基質の局在は、こうした代謝酵素の機能的集合体を実現するための仕組みである可能性がある。補因子や中間体の状態変化と相分離の連動は、代謝反応を単なる化学反応としてではなく、空間的にも制御された実体として理解する上で重要である。

参考文献

1. Ura, T., Tomita, S., & Shiraki, K. (2021). Dynamic behavior of liquid droplets with enzyme compartmentalization triggered by sequential glycolytic enzyme reactions. Chemical Communications, 57(93), 12544-12547.

2. Srere, P. A. (1985). The metabolon. Trends in Biochemical Sciences, 10(3), 109–110.