蛋白質溶液学（CD）

CDスペクトル

円二色性分光装置（CD分光計）は、大学の共通利用施設に必ずといっていいほど備えられているほか、医薬品や食品分野をはじめとする企業研究所にも広く導入されている装置です。微量の試料でタンパク質の二次構造や三次構造を解析できることが最大の特長であり、温度制御や高速混合などの測定オプションを組み合わせることで、構造変化を動的に追跡することも可能です。さらに、熱力学的解析を行うことで、立体構造の安定性を自由エネルギー変化（ΔG）やエンタルピー変化（ΔH）、エントロピー変化（ΔS）として評価できるほか、変性温度の中点温度（Tm）も比較的容易に求めることができます。

CD分光法は、タンパク質溶液を調べる最も有力な測定装置ですが、十分に使いこなされていないと感じる場面も少なくありません。本ページでは、この汎用性の高い分析手法について実例を交えて紹介していきます。まず基本となるスペクトルの読み取り方を整理します。さらに溶液条件を変化させた際の情報の引き出し方や、再現性の高いデータを得るためのサンプル調製のポイントについても整理します。

◆遠紫外CDスペクトル

Far-UV Circular Dichroism（CD）Spectroscopy（遠紫外円二色性分光法）は、右円偏光および左円偏光に対する吸収差を測定することにより、分子がもつ光学活性、特にタンパク質の二次構造に由来する光学的異方性を検出する分光法である。190–250 nm の遠紫外領域では、主としてペプチド結合に由来する n→π* および π→π* 電子遷移が観測され、αヘリックスやβシートといった二次構造の割合を反映した特徴的なスペクトルが得られる。

遠紫外CD測定を、温度変化や尿素・グアニジン塩酸などによる変性実験と組み合わせることで、タンパク質の立体構造安定性を評価することができる。たとえば、熱変性曲線からは変性の中点温度（Tm）を求めることができ、可逆的な二状態転移系であれば、自由エネルギー変化（ΔG）などの熱力学パラメータを推定することも可能である。

CDスペクトルの縦軸には、慣例として楕円率 θ が用いられ、通常は平均残基楕円率として表される。単位は deg·cm²·dmol⁻¹ である。二次構造をほとんど持たないランダムコイル状のタンパク質は、遠紫外領域において 200 nm 付近に大きな負の値を示す一方、220 nm 付近ではほとんど信号を示さない。これに対して、αヘリックス構造をもつタンパク質は 208 nm および 222 nm に負の吸収極大を示し、222 nm における楕円率は αヘリックス含量と近似的に比例関係が成り立つとされている。経験的には、100% の αヘリックス構造をもつ場合、222 nm における楕円率は約 −33,000 deg·cm²·dmol⁻¹ を示す。

βシート構造は 218 nm 付近に負の吸収極大を示し、その強度は −5,000〜−10,000 deg·cm²·dmol⁻¹ 程度とされる。ただし、βシートは並行型・逆並行型などの構造多様性をもち、αヘリックスに比べてスペクトル強度が小さいことから、従来は定量性に限界があった。βシート含量を比較的高精度で評価できるようになったのは、Kardos らが 2015 年に開発した BeStSel 法によるところが大きい（1）。現在では、BeStSel は Web サービスとして利用可能であり、多くのCD解析ソフトウェアにも実装されている。

◆等吸収点

二次構造変化が、天然構造と変性構造の間で二状態転移として進行する場合、遠紫外CDスペクトルには等吸収点（isodichroic point）が観測されることが多い。これは、二つの状態間でのみ構造転移が起こり、中間状態が有意に蓄積しないことを示唆する指標である。

代表例として、ウシ β-ラクトグロブリンは、218 nm に負の吸収極大をもつ βシートに富んだ天然構造特有の遠紫外CDスペクトルを示す（2）。このタンパク質にトリフルオロエタノール（TFE）を添加していくと、約 16% 付近からスペクトルが急激に変化し、208 nm および 222 nm に負の吸収極大をもつ αヘリックスに富んだ構造へと転移する。最終的に 80% TFE を含む条件では、αヘリックス構造が卓越したスペクトルが観測される。この過程では、約 200 nm 付近に楕円率 +5,000 deg·cm²·dmol⁻¹ 程度の等吸収点が現れ、βシート構造から αヘリックス構造への二状態転移が起きていることを強く示唆する。

同様の等吸収点は、ランダム構造から αヘリックス構造への転移においても観測される（2）。たとえば、免疫グロブリン軽鎖由来のペプチドにおいて、ジスルフィド結合を還元することで、ほとんど二次構造を持たないランダム構造の試料を調製できる。このペプチドは、200 nm 付近に大きな負の値を示す典型的なランダムコイル型の遠紫外CDスペクトルを示すが、TFE を添加すると徐々にスペクトルが変化し、80% TFE 中では約 70% 程度の αヘリックス含量を示すスペクトルへと転移する。この過程でも、203 nm 付近に楕円率およそ +13,000 deg·cm²·dmol⁻¹ の等吸収点が観測され、ランダム構造から αヘリックス構造への二状態転移が起きていることが示唆される。

卵白リゾチームの遠紫外CDスペクトルは、208 nm に深い負のバンドを示し、222 nm の極小が相対的に浅いという特徴的な形状を示す（3）。リゾチームはαヘリックスを一定量含むものの、それらは比較的短く分断されており、長く連続した理想的なαヘリックスは多くない。このため、αヘリックスの協同性やヘリックス間相互作用に強く依存する222 nm 付近のシグナルは十分に増強されないと考えられる。一方、βターンやループなどの非ヘリックス構造が多く含まれることにより、200–210 nm 領域に負の寄与が重なり、結果として208 nm の極小が強調されたスペクトル形状となる。このように、遠紫外CDスペクトルの強度は二次構造含量と一定の相関をもつものの、その解釈には構造の連続性や配置といった要素も考慮する必要があり、単純な定量指標として用いるには注意が必要である。さらに、リゾチームを加熱すると約84 ℃まで遠紫外CDスペクトルの強度は徐々に減少するが、それ以上温度を上げても大きな変化は認められない。この熱変性後のスペクトルにおいても強度が半分程度残存していることから、完全にランダムコイル構造へ移行したわけではなく、一定の二次構造が保持されている可能性が示唆される。

◆サンプル調整

遠紫外CD測定では、イオンや緩衝液成分が強い紫外吸収を示す場合があるため、測定条件の選択が重要である。一般に、できるだけ塩濃度を低くし、紫外部の吸収が比較的少ないリン酸緩衝液が用いられることが多い。塩化ナトリウムは高濃度ではノイズの原因となるが、過塩素酸ナトリウムは紫外部の吸収が小さいため、高イオン強度条件で構造を調べたい場合に代替塩として用いられることがある。ただし、過塩素酸塩は取り扱いに注意を要する。

タンパク質溶液は遠紫外CDに感度が高いため、微量のタンパク質でも定量的に構造解析できるのが特徴である。およそ10 μgのタンパク質があれば遠紫外CDスペクトルによる一般的な分析が可能である。測定には、タンパク質濃度 0.1–1 mg/mL 程度、光路長 0.1–1 mm のセルが一般的に用いられる。また、200 nm より短波長では酸素分子による吸収やオゾン生成の影響があるため、測定セル周辺を窒素ガスでパージする必要がある。CD分光計の価格は概ね 1,000 万円程度であり、赤外領域まで測定可能な装置や、ストップトフローなどの高速混合機構を備えた装置では、さらに高額となる。

◆近紫外CDスペクトル

Near-UV Circular Dichroism（CD）Spectroscopy（近紫外円二色性分光法）は、波長領域 250–320 nm を測定することにより、主としてタンパク質の三次構造に由来する芳香族アミノ酸残基の光学活性を検出する分光法である。この波長領域では、トリプトファン、チロシン、フェニルアラニンなどの芳香族側鎖が寄与し、それらが置かれた三次元的環境に強く依存したCDシグナルが観測される。

芳香族アミノ酸側鎖の配向や揺らぎによって近紫外CDスペクトルの形状が変化するため、本手法はタンパク質の高次構造、特に側鎖レベルの微妙な構造変化に対して非常に高い感度を有する。芳香族アミノ酸残基が三次元的に剛直に固定されていれば、260–300 nm 付近に正または負の明瞭なピークを示すスペクトルが得られる。より具体的には、Trp（～290 nm）、Tyr（～275 nm）、Phe（～260 nm） が主要寄与である。原理的には各芳香族残基に固有の寄与が存在するが、実際には残基間相互作用や立体配置の影響によりピークは分離せず、タンパク質全体として特徴的な指紋スペクトルを示すことが多い。

β-ラクトグロブリンは強酸性条件（pH 2）においても疎水性コアが部分的に保持された構造をとることが知られており、この条件下でも近紫外CDスペクトルを比較的明瞭に測定することができる。実際に近紫外CDスペクトルを測定すると、およそ 285 nm および 292 nm 付近に負の楕円率を示すピークが観測される。ここに 40% トリフルオロエタノール（TFE）を添加すると、これらのピークは消失し、265 nm 付近にブロードなピークが現れるようになる。これは、αヘリックス形成は促進されているものの、芳香族側鎖が特定の三次元配置に固定されず、三次構造が崩れたアルコール変性構造へと転移したためであると解釈される。一方、4 M 塩酸グアニジン中で近紫外CDスペクトルを測定すると、これまで観測されていたすべてのピークが消失する。この状態では芳香族側鎖が完全に溶媒中で自由に揺らいでおり、典型的なランダムコイル構造に固有のスペクトルを示していると考えられる。

◆熱変性

遠紫外CDはアミノ酸側鎖や無機イオン、各種添加剤による吸収の影響を受けやすく、高濃度の添加剤を含む溶液ではスペクトルを良好に測定できない場合が多い。一方、近紫外CDでは吸収をもたない低分子添加剤も多く、条件によっては安定したスペクトルが得られる。この性質を利用すると、近紫外CDを用いてタンパク質の熱変性曲線を比較的正確に評価できる場合がある。凝集抑制剤や変性剤を効果が現れる程度の高濃度で添加し、それらがタンパク質の熱安定性に与える影響を調べるような実験では、添加剤の吸収によって遠紫外CD測定が困難となり、近紫外CDが有効な手法となる（3）。

例えば、リボヌクレアーゼに 500 mM のアルギニンまたはアルギニンエチルエステル（凝集抑制剤）、あるいは塩酸グアニジン（変性剤）を添加し、近紫外CDの 280 nm における強度変化から熱変性曲線を測定した報告がある。1 ℃/分で昇温した場合、添加剤を含まない条件では約 60 ℃ 付近から立体構造の崩壊が始まり、70 ℃ 前後で完全に変性する。一方、塩酸グアニジンを添加すると変性開始温度は約 50 ℃ に低下し、60 ℃ 程度で完全に構造が失われる。アルギニンおよびアルギニンエチルエステルを添加した場合の変性曲線はこれらの中間に位置し、これらの添加剤がタンパク質の耐熱性をわずかに低下させることが示されている。

◆溶液状態の変化の判別

タンパク質の溶液状態が、何らかの処理によって変化したか否かを判別したい場面は多い。例えば、冷蔵あるいは冷凍保存後、加熱処理、pH の変化、振盪や撹拌といった物理的ストレスを与えた後など、日常的な実験操作の中でタンパク質に変化が生じたのか調べたいときがある。このような溶液状態の変化を評価する際には、単一の測定手法に依存するのではなく、複数の手法を組み合わせて総合的に判断することが重要である。

超遠心操作によってタンパク質をガラス状に固化し、長期保存した後に再溶解した場合、そのタンパク質が保存前と同一の構造状態を保っているかを検証した例がある（4）。まず、遠紫外CDスペクトルを用いることで、αヘリックスやβシートといった二次構造が保持されているかどうかを評価する。さらに、近紫外CDスペクトルを測定すれば、芳香族アミノ酸残基の環境変化を通じて、タンパク質の三次構造が維持されているかを評価する。これらのCDでは分子としての構造状態を検証できるが、これに加えて、サイズ排除クロマトグラフィを用いて溶液中の分子サイズ分布を比較すると、可溶性凝集体の形成や高次会合の有無を評価できる。特に、CDスペクトルでは大きな変化が見られない場合であっても、分子間相互作用による凝集が進行していることは少なくないからである。

◆サンプル調整

近紫外CDのシグナルは遠紫外CDと比べてかなり弱いため、良好なスペクトルを得るためには比較的多量の試料が必要となる。一般に、タンパク質濃度は 1–10 mg/mL 程度、セルの光路長は 1 cm 程度が用いられ、測定には光吸収の少ない緩衝液が推奨される。また、信号強度が小さいことから、十分な積算回数を確保し、ノイズを低減することが重要である。

遠紫外CDがタンパク質立体構造の骨格を成す二次構造を主に反映するのに対し、近紫外CDは芳香族側鎖の三次元的環境、すなわち三次構造の秩序性を反映する補完的な手法である。両者を併用することで、タンパク質の構造変化を二次構造から三次構造に至る階層的な視点で理解することが可能となる。また、緩衝液成分や低分子添加剤の多くは遠紫外領域に強い吸収をもつため、溶媒環境を大きく変えずに立体構造変化を追跡したい場合には、近紫外CDが有効な選択肢となる。

参考文献

・CDの正確な二次構造分析、とくにβ構造の予測が実現

1. Micsonai, A.; Wien, F.; Kernya, L.; Lee, Y.-H.; Goto, Y.; Réfrégiers, M.; Kardos, J. Accurate Secondary Structure Prediction and Fold Recognition for Circular Dichroism Spectroscopy. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 2015, 112 (24), E3095–E3103.

・CDを活用したタンパク質フォールディング分析例

2. Shiraki, K.; Nishikawa, K.; Goto, Y. Trifluoroethanol-Induced Stabilization of the α-Helical Structure of β-Lactoglobulin: Implication for Non-Hierarchical Protein Folding. J. Mol. Biol. 1995, 245, 180–194.

・CDを活用したタンパク質の熱変性分析例

3. Shiraki, K.; Kudou, M.; Nishikori, S.; Kitagawa, H.; Imanaka, T.; Takagi, M. Arginine Ethylester Prevents Thermal Inactivation and Aggregation of Lysozyme. Eur. J. Biochem. 2004, 271 (15), 3242–3247.

・タンパク質の溶液状態の比較例

4. Nakauchi, Y.; Nishinami, S.; Shiraki, K. Glass-like Protein Condensate for the Long-Term Storage of Proteins. Int. J. Biol. Macromol. 2021, 182, 162–167.