蛋白質溶液学（アミノ酸）

疎水性が高いから溶けない？　なぜこの20種類？

アミノ酸の性質

タンパク質は、アミノ酸がペプチド結合で連なったポリマーです。多くのタンパク質は、結晶化できるほど均一な立体構造をとり、その構造に基づいて機能を発現します。では、タンパク質はいかにして固有の立体構造を獲得するのでしょうか。この問いは、科学における最も古典的かつ中心的な研究課題の一つです。

一般には、親水性側鎖を水と接触する外側に、疎水性側鎖を水と接触しにくい内側に配置するようにフォールディングが進むと説明されます。ただし実際には、構造内部に位置する残基ほど疎水的であるとは限りません。本章では、生命を形づくる基本部品であるアミノ酸を対象として、溶解度、側鎖の疎水性、立体構造形成能といった観点から比較します（1）。アミノ酸の多様なパラメータの一覧表は眺めて飽きることがありません。

◆アミノ酸の構造と性質

アミノ酸は、中心となる炭素原子（α炭素）に、アミノ基（–NH₂）、カルボキシル基（–COOH）、水素原子、および多様な化学的性質をもつ側鎖（R基）が結合した構造を基本単位とする。天然に存在するタンパク質構成アミノ酸はすべてα-アミノ酸であり、立体配置はほぼ例外なくL型である（唯一の例外は光学活性を持たないグリシン）。側鎖の化学的性質は、アミノ酸の物理化学的特性や立体構造における配置、さらにはタンパク質の機能発現において決定的な役割を担う。

生理的pH（約7.4）では、アミノ基がプロトン化され正に帯電（–NH₃⁺）、カルボキシル基が脱プロトン化され負に帯電（–COO⁻）するため、全体として正負両方の電荷をもつ双性イオンとして存在する。この両性電解質的性質は、溶解度や等電点（pI）などの化学的挙動に強く影響する。

タンパク質を構成する天然アミノ酸は20種類であり、それぞれ遺伝暗号表に対応するコドンによって翻訳される。隣接するアミノ酸は、カルボキシル基とアミノ基の間に形成されるペプチド結合によって連結され、直鎖状の一次構造を形成する。この結合は部分的に二重結合性をもち、アミド平面を形成するため回転が制限され、二次構造の形成に寄与する。

なお、タンパク質を構成したアミノ酸は、リン酸化（セリン、スレオニン、チロシン）や、アセチル化（リシン）、メチル化（アルギニン、リシン）など、多様な翻訳後修飾を受けることで、タンパク質の溶解性や相互作用性が変化し、生体内でのタンパク質の機能や局在が制御される。このような溶媒への溶解性や、他のタンパク質や共存する分子との相互作用性の理解は、タンパク質溶液を理解するための基礎となる。

◆側鎖の性質による分類と特徴

(1) 疎水性アミノ酸：アラニン（Ala）、バリン（Val）、ロイシン（Leu）、イソロイシン（Ile）、メチオニン（Met）、フェニルアラニン（Phe）、トリプトファン（Trp）などは側鎖が非極性または芳香族であり、疎水性が高い。水溶液中のタンパク質では疎水効果により、これらの残基は立体構造の内部に集まり、疎水性コアを形成して熱力学的安定化に寄与する。また、膜タンパク質の膜貫通領域や、疎水性リガンドとの相互作用面にも現れるアミノ酸である。

(2) 酸性（負電荷）アミノ酸：アスパラギン酸（Asp）、グルタミン酸（Glu）。側鎖のカルボキシル基がpH 7付近で解離し、負電荷を帯びる。金属イオンとの配位や塩橋形成に関与する。

(3) 塩基性（正電荷）アミノ酸：リシン（Lys）、アルギニン（Arg）、ヒスチジン（His）。リシンは側鎖アミノ基、アルギニンはグアニジニウム基により常に正電荷を帯びやすい。ヒスチジンは側鎖イミダゾール基のpKaが約6.0であり、生理的pH域でプロトン化状態が変化しやすく、酸塩基触媒として酵素活性中心で頻繁に利用される。また、ヒスチジンはpHセンシングや金属イオン結合においても重要な役割を果たす。

(4) 極性だが電荷を持たないアミノ酸：セリン（Ser）、スレオニン（Thr）、アスパラギン（Asn）、グルタミン（Gln）、チロシン（Tyr）は極性基（ヒドロキシル基、アミド基、フェノール基）をもち、水素結合の供与体または受容体として機能する。これらはタンパク質の表面に多く存在し、溶媒や基質との相互作用、リン酸化などの翻訳後修飾の標的となる。

(5) 特殊なアミノ酸：システイン（Cys）：チオール基（–SH）をもち、酸化によりジスルフィド結合（–S–S–）を形成する。この共有結合は、タンパク質の三次構造および四次構造を強固に安定化する。細胞外環境のような酸化的条件下で特に重要であり、抗体や分泌性酵素などに多く見られる。また、チオール基は求核性が高く、補酵素結合や金属イオン配位にも利用される。

(6) 特殊なアミノ酸：プロリン（Pro）：側鎖が主鎖アミノ基と環状結合を形成し、二級アミンとなっている。この構造的制約により、ペプチド鎖の回転自由度が著しく低下し、αヘリックスやβシートの形成を阻害することが多い。一方で、タンパク質構造の折れ曲がりやループ構造形成に不可欠である。

(7) 特殊なアミノ酸：グリシン（Gly）：側鎖が水素原子1個のみであるため、立体障害が最小であり、構造的柔軟性が非常に高い。ループやターンなどの可動性の高い領域、または立体的に制限された部位に好んで存在する。光学活性を持たないため、L型・D型の区別は存在しない。

◆溶ける現象の熱力学的理解

ここで、溶ける現象について整理する。水に物質が溶ける、あるいは溶けないという現象は、固体や液体といった物質単独の性質としてではなく、水と物質を合わせた系全体のギブス自由エネルギーがどの状態で最小となるか、という熱力学的平衡の問題として理解できる。一定温度・圧力下では、混合や溶解が自発的に進むかどうかは、

ΔG=ΔH−TΔS

の符号によって決まる。すなわち、溶解とは、水分子同士および溶質分子同士の相互作用が、水–溶質間の相互作用へと再編成されることによるエンタルピー変化（ΔH）と、混合・分散に伴うエントロピー変化のバランスとして記述できる。水への溶解は、熱力学的な平衡条件の結果である。

ここでは、わかりやすいようにイオン性物質の塩、親水性分子の砂糖、疎水性分子の脂肪について、溶解現象を熱力学的観点から比較してみたい。

塩（NaCl）はイオン結晶であり、固体中では Na⁺ と Cl⁻ が強い静電相互作用によって規則正しく配列した、エンタルピー的に安定でエントロピーの低い状態にある。塩を水に入れると、結晶格子が解離してイオンは水分子に囲まれた水和状態をとる。この過程では格子エネルギーの吸収と水和エネルギーの放出が拮抗するため、溶解エンタルピー変化は比較的小さく、条件によってはわずかに吸熱的となる。一方、イオンが水中に分散することで系のエントロピーは増大する。その結果、ΔGは負となり、溶解が自発的に進行する。

砂糖（スクロース）は親水性で解離基を持たない低分子である。結晶中では多数の −OH 基を介した水素結合によって秩序化している。水中に入れると、結晶内の分子間相互作用は切断されるが、同時にスクロース分子は水と水素結合を形成し、溶媒和によってエンタルピー的な不利は部分的に補償される。溶液中では溶質分子が分散するため溶質側のエントロピーは増大する。一方で、水分子はスクロース周囲である程度配向するものの、その秩序化は限定的であり、系全体としては−TΔS項が有利に働く。その結果、ΔGは負となり、砂糖は水に溶解する。

中性脂肪（トリグリセリド）は炭化水素鎖を主成分とする疎水性分子であり、水と強い相互作用を形成できない。油分子を水中に分散させると、水の水素結合ネットワークが乱されるが、それを補うほどの水分子・脂肪分子の相互作用は乏しい。さらに、疎水分子の周囲では水分子が配向して秩序化するため、水のエントロピーが低下する。油を水に溶かそうとしたときには、このエントロピー損失（いわゆる疎水効果）が支配的となるため、ΔGは正となる。その結果、油と水は均一に混合せず、熱力学的平衡としては相分離した状態になる。

◆アミノ酸の水への溶解度

アミノ酸は、カルボキシル基とアミノ基を併せ持つ双性イオン（zwitterion）として存在するため、水にはよく溶ける一方、炭化水素のような非極性有機溶媒にはほとんど溶けない。また、同程度の分子量をもつ有機化合物と比べて融点や沸点が高いことも特徴である。

表に、20種類のタンパク質構成アミノ酸の25 ℃における水への溶解度（g/100 mL）を示す（2）。最も水溶性が高いアミノ酸はプロリンで、100 mLの水に130 gも溶ける。一方、最も溶けにくいのはチロシンで、わずか0.054 g（54 mg）しか溶けない。コップ一杯の水に、ほんのひとかけらのチロシンも溶けないのである。タンパク質を構成するアミノ酸の水への溶解度には、およそ2,500倍もの差があるのは興味深い事実である。

ここで、個々のアミノ酸を比べながら、溶解度とは何かを考えてみたい。アミノ酸の溶解度と化学構造を見比べると、一見予想に反する例がある。たとえばフェニルアラニンとチロシンはいずれも側鎖にベンゼン環をもつが、フェニルアラニン（疎水性側鎖）は100 mLの水に2.8 g溶けるのに対し、チロシン（ベンゼン環の先に親水性のヒドロキシ基を持つ）は0.054 gしか溶けない。親水性基をもつチロシンの方が、むしろ50分の1しか溶けないのである。

この理由は、単純に「側鎖の親水性が高いと水に溶けやすい」という発想だけでは説明できない。溶解度は、分子の水との親和性だけでなく、固体状態の安定性（結晶格子エネルギー）にも依存する。チロシンは分子間で強い水素結合ネットワークを形成し、結晶構造が非常に安定であるため、固体から水中へ分散するのが難しい。一方、フェニルアラニンは固体状態での相互作用が比較的弱く、結晶格子から水中への移行が起こりやすい。そのため、似た構造をもつ二者であっても、溶解度が大きく異なるのである。

一方、最も水に溶けやすいアミノ酸であるプロリンは、疎水性アミノ酸とは異なる特徴を示す。プロリンは環状の二級アミン構造をもち、分子全体がコンパクトにまとまっているため、疎水性部分が外部に大きく露出せず、双性イオンとしての電荷や極性基が水と強く相互作用できる状態が保たれる。また、固体状態における分子間相互作用が比較的弱く、結晶格子の安定化も小さい。このため、固体から水中へ分散する際のエネルギー障壁が低く、さらに水和による自由エネルギー利得が大きく働く。つまり、結晶状態が不安定であり、同時に水和が有利であることが、プロリンの異常に高い水溶性（130 g/100 mL水）を生む主因である。

この特徴は、フェニルアラニンやチロシンと比べるとよく分かる。フェニルアラニンは側鎖が疎水性のベンゼン環であり、固体状態での分子間相互作用が比較的強く、チロシンはベンゼン環にヒドロキシ基を持つにもかかわらず、固体中で水素結合ネットワークを形成して結晶安定化が強い。このため、両者の水への溶解度はプロリンに比べて低く、フェニルアラニンは2.8 g/100 mL、チロシンはわずか0.054 g/100 mLしか溶けない。プロリンの場合は、結晶安定性の低さと水和の有利さが重なり、構造的に非常に水に溶けやすい例外的なアミノ酸となっている。

塩基性アミノ酸であるリシンやアルギニンは、100 mLの水に数十グラムと非常に高い溶解度を示すのに対し、酸性アミノ酸であるグルタミン酸やアスパラギン酸は、同じ100 mLの水に1 gも溶けない。どちらも側鎖に電荷をもち、直感的には水によく溶けそうに思えるが、実際の溶解度は大きく異なる。この理由もプロリンと同様、固体状態の安定性と水和のバランスで説明できる。酸性アミノ酸は分子間で強い水素結合やイオン性相互作用を形成しやすく、結晶格子の安定化が大きいため、固体から水中へ分散するのに高いエネルギーが必要となる。一方、リシンやアルギニンは側鎖の長いアルキル鎖に末端アミノ基やグアニジニウム基をもつため、固体中での分子間相互作用は相対的に弱く、水和による自由エネルギー利得が非常に大きくなる。その結果、塩基性アミノ酸は酸性アミノ酸に比べて圧倒的に水に溶けやすいのである。

さらに、酸性アミノ酸とそのアミド誘導体を比較すると、固体安定性の影響がより明確になる。例えば、グルタミン酸に比べてグルタミンは約5倍高い水溶性を示し、アスパラギン酸よりアスパラギンの水溶解度も同様に約5倍高い。これは、アミド化によって固体中での水素結合ネットワークが弱まり、水分子との相互作用が有利になるためであり、酸性アミノ酸の水に溶けにくい性質が主に固体構造の安定性に由来することを示している。

◆移相自由エネルギーの算出

今度は、アミノ酸そのものの溶解度ではなく、アミノ酸の側鎖の疎水性について考えてみよう。側鎖の疎水性を定量的に評価するために、古典的に用いられてきた方法のひとつが分配実験である。

具体的には、水と有機溶媒（典型的にはオクタノール）の二相系を準備する。両者は互いに混じらず、上相と下相に分離する。この系にアミノ酸を加えて十分に平衡に達した後、それぞれの相に分配したアミノ酸の濃度を測定する。そのアミノ酸がもし水に溶けやすければ水の中に多く含まれるし、そうでなければ有機溶媒の中に多く含まれることになる。こうして得られる「有機相／水相の濃度比」が分配係数Pであり、その常用対数（log P）を取ることで、分子が水相から有機相に移動する際の自由エネルギー変化ΔGに換算できる。

25 ℃では、ΔGはおよそ logP x (-1.36 kcal/mol) に相当する。すなわち単純な計算では、logPが1増えるごとに約1.36 kcal/mol分だけ有機相が有利になる。ただし、この値にはアミノ酸の主鎖部分（–NH₃⁺ と –COO⁻ をもつ骨格）の寄与が必ず含まれてしまう。そこで、主鎖だけを持つグリシンの移相自由エネルギーを基準値として測定し、各アミノ酸の移相自由エネルギーからグリシンの値を差し引く。この操作により、純粋に側鎖のみが担う疎水性の寄与を抽出することができる。

このようにして得られたアミノ酸側鎖の疎水性の定量値は、NozakiとTanfordによって1971年に初めて体系的に報告された（3）。彼らの報告に基づく値は現在でも疎水性スケールとして広く引用されている。表に示した Hydrophobicity 値は、オクタノールから水への移相自由エネルギーであり、値が正であるほど有機相に分配されやすく、より疎水的であることを意味する。

◆タンパク質表面をつくるアミノ酸残基

タンパク質表面を議論する基礎には、溶媒接触表面積という考え方がある。Chothia は、タンパク質の露出表面と埋没表面を accessible surface area に基づいて解析し、表面と内部を定量的に比較する枠組みを示した（1）。その後、Miller らは単量体タンパク質の内部と表面におけるアミノ酸残基の分布を解析し、疎水性残基は内部に、荷電性・極性残基は表面に偏りやすいことを示した（2）。

タンパク質表面には、正電荷パッチ、負電荷パッチ、疎水性パッチ、芳香族残基の集まり、水素結合性の領域などが不均一に分布している。実際のタンパク質間相互作用では、表面上の限られた領域が界面として選ばれ、そこでは疎水性接触、電荷相補性、水素結合、形状相補性が組み合わさって働き、構造安定性と溶液安定性をつなぐ重要な場を形成する（3）。

荷電残基：荷電残基がタンパク質表面にある場合、pH とイオン強度に応じて表面電位が変化する。タンパク質の正味電荷が大きい条件、すなわちタンパク質の等電点と溶液の pH が離れた条件では、分子間の静電反発が働き、溶解性が高くなりやすい。一方、タンパク質の等電点付近の pH では正味電荷が小さくなり、分子間の接近が起こりやすくなるため、沈殿や凝集が促進されやすい（4）。

タンパク質表面では、正電荷と負電荷が局所的なパッチを形成することがある。抗体溶液では、この電荷パッチの偏りが分子間の異方的な引力を生み、自己会合や粘度上昇につながる。Yadav らは、モノクローナル抗体の表面電荷分布が自己会合と粘度に強く影響することを示し、正味電荷に加えて、電荷の空間分布が重要であることを示した（5）。同じ等電点のタンパク質でも、表面電荷が均一に分散しているものとそうでないものは、分子間相互作用が異なる。電荷が均一に分散した表面では反発的なコロイド安定性が得られやすく、電荷パッチが偏った表面では正負のパッチ間に相補的な引力が働きやすい。

疎水性残基：疎水性残基が表面に露出している領域は、表面疎水性パッチを形成する。表面疎水性パッチは、水との接触によるエントロピーの減少により自由エネルギー的に不利であるため、他のタンパク質表面や容器表面、気液界面などと相互作用しやすい。

表面疎水性パッチは、タンパク質凝集の重要な起点になる。Chennamsetty らは、抗体表面における空間的に隣接した疎水性残基の露出をもとに、spatial aggregation propensity（SAP）という指標を用いて凝集しやすい領域を評価した。そして、表面疎水性ホットスポットを低減する変異設計によってタンパク質の安定性を高められることを示している（6）。一方、表面疎水性パッチは、機能にも関与する。酵素の基質結合部位、抗体の抗原結合部位、タンパク質間相互作用界面には、機能に必要な疎水性領域が存在する（3）。

芳香族残基：トリプトファンやチロシンなどの芳香族アミノ酸の側鎖は疎水性だが、π–π相互作用やカチオン–π相互作用、蛍光特性などの性質を持つ特殊な表面を作る。芳香族残基は、タンパク質間相互作用のホットスポットや、液–液相分離におけるステッカー残基として働く。

タンパク質表面に芳香族残基が局所的に集まると、疎水性相互作用やπ–π相互作用を介して、凝集しやすい表面やタンパク質間相互作用の会合面を形成しやすくなる（6）。また、天然変性領域や低複雑性配列では、芳香族残基とアルギニンまたはリシンの側鎖とのカチオン–π相互作用が、液–液相分離を駆動する重要な分子間相互作用として働く（7）。

極性残基：極性残基は、水素結合を介してタンパク質表面の水和層を形成する。これらの残基は、表面に水を保持し、タンパク質の溶解性と構造安定性を支える。アスパラギンやグルタミンのアミド基、セリンやスレオニンのヒドロキシ基は、水分子との相互作用に加えて、分子内や分子間の水素結合にも関与する。液–液相分離しやすい配列にはグルタミンが多いことが知られている（8）。

極性残基は、配列文脈によって異なる役割を示す。表面に分散して存在する場合には水和と溶解性を高める。一方、極性残基が低複雑性配列や天然変性領域に多く含まれる場合には、水素結合ネットワークや多価相互作用を介して会合や相分離に関与する。したがって、極性残基は水和を高める安定化要素であり、同時に配列配置によって相互作用性を生む要素でもある。

高濃度タンパク質溶液では、タンパク質分子間の平均距離が短くなるため、表面残基の影響が顕著になる。希薄溶液では小さく見える弱い相互作用も、高濃度では多数の分子が近接するため、粘度上昇、可逆的自己会合、液–液相分離、凝集の原因となる。特に抗体製剤では、CDR 周辺の疎水性パッチ、電荷パッチ、芳香族残基の露出が、自己会合や粘度に影響する（5,9）。

Therapeutic Antibody Profiler は、抗体の developability リスクを、CDR 長、CDR 周辺の表面疎水性パッチ、正電荷パッチ、負電荷パッチなどから評価する枠組みである。CDR は抗原結合を担う機能的な相互作用面であるため、疎水性残基や荷電性残基が局所的に集まりやすい。一方で、このような表面パッチは、抗原以外のタンパク質分子との非特異的な接触、自己会合、凝集、高濃度溶液での粘度上昇にもつながる可能性がある。したがって、抗体の表面残基配置は、抗原結合能だけでなく、製剤化しやすさや溶液安定性を左右する重要な要素として評価される（9）。

参考文献

1. Chothia, C. The Nature of the Accessible and Buried Surfaces in Proteins. J. Mol. Biol. 1976, 105 (1), 1–12.

2, Miller, S.; Janin, J.; Lesk, A. M.; Chothia, C. Interior and Surface of Monomeric Proteins. J. Mol. Biol. 1987, 196 (3), 641–656.

3. Jones, S.; Thornton, J. M. Principles of Protein–Protein Interactions. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 1996, 93 (1), 13–20.

4. Zhou, H.-X.; Pang, X. Electrostatic Interactions in Protein Structure, Folding, Binding, and Condensation. Chem. Rev. 2018, 118 (4), 1691–1741.

5. Yadav, S.; Laue, T. M.; Kalonia, D. S.; Singh, S. N.; Shire, S. J. The Influence of Charge Distribution on Self-Association and Viscosity Behavior of Monoclonal Antibody Solutions. Mol. Pharmaceutics 2012, 9 (4), 791–802.

6. Chennamsetty, N.; Voynov, V.; Kayser, V.; Helk, B.; Trout, B. L. Design of Therapeutic Proteins with Enhanced Stability. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 2009, 106 (29), 11937–11942.

7. Wang, J.; Choi, J.-M.; Holehouse, A. S.; Lee, H. O.; Zhang, X.; Jahnel, M.; Maharana, S.; Lemaitre, R.; Pozniakovsky, A.; Drechsel, D.; Poser, I.; Pappu, R. V.; Alberti, S.; Hyman, A. A. A Molecular Grammar Governing the Driving Forces for Phase Separation of Prion-like RNA Binding Proteins. Cell 2018, 174 (3), 688–699.e16.

8. Martin, E. W.; Mittag, T. Relationship of Sequence and Phase Separation in Protein Low-Complexity Regions. Biochemistry 2018, 57 (17), 2478–2487.

9. Raybould, M. I. J.; Marks, C.; Krawczyk, K.; Taddese, B.; Nowak, J.; Lewis, A. P.; Bujotzek, A.; Shi, J.; Deane, C. M. Five Computational Developability Guidelines for Therapeutic Antibody Profiling. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 2019, 116 (10), 4025–4030.

◆遊離アミノ酸とアミノ酸残基

アミノ酸の性質を考えるときには、遊離アミノ酸として存在する場合と、タンパク質を構成するアミノ酸残基として存在する場合を区別する必要がある。両者は同じアミノ酸名で呼ばれるが、分子としての状態は異なる。

遊離アミノ酸は、アミノ基、カルボキシ基、側鎖をもつ小分子である。水溶液中では多くの場合、アミノ基は正電荷をもつ –NH₃⁺、カルボキシ基は負電荷をもつ –COO⁻ となり、双性イオンとして存在する。このため、遊離アミノ酸の水への溶けやすさは、側鎖の性質だけでなく、主鎖部分の強い水和や、結晶中での分子間相互作用にも大きく左右される。たとえば、グリシンやアラニンのような単純なアミノ酸であっても、遊離状態ではアミノ基とカルボキシ基が水と強く相互作用するため、単純な疎水性分子としては扱えない。

一方、タンパク質中のアミノ酸は、ペプチド結合によって連結された「残基」として存在する。ペプチド結合が形成されると、遊離アミノ酸のアミノ基とカルボキシ基は脱水縮合によって主鎖に組み込まれる。そのため、タンパク質中のアミノ酸残基では、遊離アミノ酸がもっていた –NH₃⁺ と –COO⁻ の性質はそのまま残るわけではない。もちろん、N末端やC末端には遊離のアミノ基やカルボキシ基が残るが、内部の残基では主鎖はペプチド結合として存在し、側鎖の性質が重要になる。

たとえば、遊離アミノ酸としてのチロシンやトリプトファンは水に溶けにくい。しかし、タンパク質中のチロシン残基やトリプトファン残基は、単に「水に溶けにくいアミノ酸」ではなく、芳香環による疎水性相互作用、π–π相互作用、カチオン–π相互作用、水素結合、紫外吸収や蛍光など、さまざまな性質をもつ構造要素として働く。このため、アミノ酸の性質を議論するときには、「遊離アミノ酸の物性」を見ているのか、「タンパク質中の残基の性質」を見ているのかを区別することが大切である。この視点は、タンパク質溶液を理解していくために重要である。

この区別を意識すると、アミノ酸の性質をより階層的に理解できる。遊離アミノ酸は、タンパク質を構成する部品であると同時に、溶液中では小分子添加剤としてもふるまう。一方、タンパク質中のアミノ酸残基は、立体構造の形成、分子表面の性質、タンパク質間相互作用、凝集、相分離などを決める要素となる。したがって、アミノ酸を理解するには、単独分子としての物性と、タンパク質構造中での役割の両方を見る必要がある。

◆アミノ酸側鎖の疎水性

このようにして求めたアミノ酸の側鎖の疎水性に関する一覧表を見てみたい。この表はFauchereらの数値による（4）。一覧を見てみると、数値は我々の直感によく一致しているように見える。

最も大きな疎水性を示すのはトリプトファンであり（ΔG ≈ +2.25 kcal/mol）、次いでフェニルアラニンやロイシン、イソロイシンといった、メチル基やベンゼン環など大きな疎水性基を側鎖にもつアミノ酸が続く。側鎖がもう少し小さいバリンや、芳香環にヒドロキシ基を導入したチロシンは、それらより疎水性が低くなる。一方、セリン（ΔG ≈ –0.04 kcal/mol）やスレオニンのように小さな水酸基を持つアミノ酸や、アスパラギンやグルタミンのようにアミド基を持つアミノ酸は、負電荷こそ持たないが親水性の性質である。

側鎖に解離基を持つリシン（ΔG ≈ –0.99 kcal/mol）やアルギニン、グルタミン酸やアスパラギン酸などは、さらに親水的であり、移相自由エネルギーは大きく負の値をとる。これらは水和がきわめて有利であり、有機溶媒相に分配されにくいことを意味する。

なお、チロシンは上述のとおり水にほとんど溶けないが、有機溶媒にも同様に溶けにくい。そのために水とオクタノール間の溶解度比をとると、フェニルアラニンより疎水性が低く、バリンよりは疎水性が高いという、妥当な値を示していることがわかる。

◆タンパク質の構造の内部と外部

タンパク質が立体構造を形成するとき、各アミノ酸残基がタンパク質の内部に配置されやすいのか、それとも外部に露出しやすいのかを統計的に解析したChothiaらの研究がある（5）。彼らは結晶構造が明らかになっていたタンパク質を解析し、アミノ酸ごとの平均的な溶媒露出度を定量化した。その結果を、溶媒中での移相自由エネルギーと同様の形式に換算することで、アミノ酸ごとに「内部から表面へ移動させたときのエネルギー変化（kcal/mol）」が推定された。表1の In–Out の欄には、その値がまとめられている。

脂肪族アミノ酸（アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシンなど）は、疎水性が高いためタンパク質の内部に配置されることが有利であり、正の大きな値を示す。一方、アルギニンやリシンのような塩基性アミノ酸は正電荷をもつため水和が極めて有利であり、負の大きな値を示してタンパク質表面に位置する傾向が強い。酸性アミノ酸（アスパラギン酸、グルタミン酸）も同様に負の値をとり、外部に局在することが多い。

興味深いのは芳香族アミノ酸である。トリプトファンは側鎖が大きく疎水性指標（移相自由エネルギー）も高いにもかかわらず、In–Out の値はそれほど大きくない。つまり、必ずしもタンパク質内部に深く埋もれるわけではなく、部分的に表面に露出する傾向をもつ。その結果、トリプトファンの位置づけはアラニンやバリンと同程度の中間的な値となっている。これは、トリプトファンの大きな芳香環が内部に完全に収まりにくく、立体障害が制約要因となっているためと考えられる。

特に、システイン・メチオニン・トリプトファンの3種類は疎水性の大きさが互いに異なるにもかかわらず、埋もれやすさはほぼ同程度を示す点が興味深い。これは、単純な疎水性指標だけでは説明できない、立体構造上の制約や特殊な化学的性質（システインのジスルフィド結合、メチオニンの柔軟な硫黄原子、トリプトファンの大環芳香環）などが影響していると考えられる。

アミノ酸の疎水性を横軸に取り、タンパク質の立体構造を形成したときの内外への位置を縦軸にグラフにしてみると傾向がわかる。疎水性がある程度の値までは疎水性が高いほどタンパク質の内部に位置しやすいが、一定以上の疎水性の高さになると頭打ちになる。側鎖が大きくなりすぎると、内部でパッキングするときに困難になるために、単に疎水性が高いというだけでは内部に位置しにくいのである。

このような研究の流れで、Chothiaは後年、タンパク質の立体構造は限られた数のフォールドに分類できるという重要な指摘をしている（6）。アミノ酸配列の類似性が乏しいタンパク質同士であっても、立体構造を比較すると同じ基本的な折り畳み様式をとることが少なくない。Chothia は既知の構造データを系統的に解析し、自然界のタンパク質がとりうる立体構造の種類はおおよそ数千程度に収まると見積もった。これは「タンパク質構造空間の有限性」という概念として広く受け入れられ、その後の構造分類体系の基盤となり、構造ゲノミクスやホモロジーモデリングの発展を大きく促した。

◆アミノ酸のハイドロパシー

ハイドロパシー（hydropathy）スケールは、Kyte と Doolittle が1982年に提案したタンパク質の疎水性に関する重要な指数である（7）。このスケールは、単にアミノ酸側鎖の水・有機溶媒間の移相自由エネルギーだけでなく、タンパク質立体構造を形成したときに埋もれやすいかどうかも含めて算出されたものである。すなわち、アミノ酸がタンパク質を形成した場合の「実質的な疎水性」を反映した値となっている。

側鎖の疎水性に対してハイドロパシーをプロットすると、一定の相関は見られるものの、個々の残基によってかなりばらつきがあることがわかる。例えば、アラニンは側鎖の疎水性自体は小さいにもかかわらず、タンパク質内部に埋もれやすいため、ハイドロパシーは比較的大きな値を示す。それとは対照的に、芳香族残基のトリプトファンやチロシンは、疎水性が大きいにもかかわらず側鎖のサイズも大きいため内部に完全に埋まることが難しく、表面に部分的に露出しやすい。その結果、これらのアミノ酸はハイドロパシーが低くなっている。

このように、Kyte–Doolittle のハイドロパシースケールは、アミノ酸の側鎖疎水性だけでなく、立体構造における空間的制約やパッキング効果も考慮した「実質的な疎水性」の指標として広く受け入れられている。実際、この論文は現在までに約22,000回引用されている。1億本あるとされる学術論文の中でも引用数から考えてトップ100に入る影響力を持つことからも、その重要性がうかがえる（8）。

◆アミノ酸の二次構造の取りやすさ

アミノ酸には、固有の二次構造形成傾向という値も存在する。代表的な二次構造であるα-ヘリックスは、ペプチド主鎖のアミノ基とカルボキシ基間で水素結合を形成し、全体としてらせん構造をとる。側鎖はらせんの外側に向き、3.6残基で1回転する。一方、β-ストランドも主鎖間の水素結合により伸びた構造をとり、側鎖は交互に上下方向に向く。Chou と Fasman は1974年に、15種類の既知タンパク質構造を解析し、各アミノ酸がα-ヘリックスやβ-ストランドに含まれる頻度を算出することで、アミノ酸固有の二次構造形成傾向を定量化した（9）。

表のαおよびβの値は、それぞれのアミノ酸がα-ヘリックスやβ-ストランドに存在する割合を示す。アミノ酸によって明確な傾向があり、側鎖の性質によって形成能が異なることがわかる。例えば、グルタミン酸はα-ヘリックスを好む一方でβ-ストランド形成はほとんどせず、アスパラギン酸はどちらもわずかに好まない。グリシンは主鎖の二面角自由度が高くα-ヘリックスを形成しにくいが、側鎖にメチル基を持つアラニンになると自由度が制限され、α-ヘリックスを形成しやすくなる。分岐型脂肪族アミノ酸であるイソロイシンやバリンはβ-ストランドを好み、疎水性コアの形成に寄与する。逆にプロリンは環状構造により取りうる二面角が限られるため、α-ヘリックスもβ-ストランドも形成しにくい。

ちなみに、アミノ酸の側鎖の疎水性と二次構造形成傾向はほとんど相関がない。このことは、タンパク質立体構造が主鎖の二次構造だけでなく、側鎖パッキングを含む三次構造によって制御されることを示している。1970年代から90年代には、経験的な二次構造指標を組み合わせて立体構造予測を試みる研究が盛んだったが、完全な予測は困難であった。21世紀に入ると、計算能力の向上により全原子間相互作用を第一原理から計算する手法が台頭し（10）、さらにAIを用いた設計により、天然には存在しない多くのタンパク質が創出されるようになっている。

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◆アミノ酸どうしの相互作用

アミノ酸は、タンパク質を構成する部品であるだけでなく、水溶液中で互いに相互作用する小分子でもある。タンパク質の溶解性、凝集、液–液相分離（LLPS）を考えるには、各アミノ酸が水となじむかだけでなく、アミノ酸どうしがどのように引き合うかを考える必要がある。特に、タンパク質表面や天然変性領域では、多数の側鎖が弱く、多価的に相互作用するため、アミノ酸どうしの相互作用は液滴や凝集体の形成を理解する手がかりになる。

この相互作用を調べる方法として、芳香族アミノ酸であるチロシン、トリプトファン、フェニルアラニンの溶解度を、20種類のアミノ酸を含む溶液中で調べた報告がある（1）。あるアミノ酸溶液中で芳香族アミノ酸の溶解度が増えれば「可溶化に働く相互作用」、逆に溶解度が下がれば「不溶化に働く相互作用」と考える。この溶解度変化を指標化したものが PSAS（parameter of solubility of amino acids in amino acid solvents）であり、水を含む溶液中でのアミノ酸どうしの相互作用を表す実験的な指標である（1）。

PSAS の解析では、アルギニン、プロリン、芳香族アミノ酸は、芳香族アミノ酸を可溶化する傾向を示した。これは、カチオン–π相互作用や、π–π相互作用、芳香環と特定の側鎖との親和性が、水溶液中で芳香族アミノ酸を安定化することを示している。一方、グルタミン酸、アスパラギン酸、グルタミン、アスパラギン、一部の疎水性アミノ酸は不溶化側に働いた。したがって、アミノ酸どうしの相互作用は、単純な疎水性／親水性だけでは説明できないことを意味する。

さらに、芳香族側鎖の移相自由エネルギー（ΔGSC）から、側鎖どうしの親和性をより直接的に評価した報告がある（2）。ΔGSC が負であれば、その芳香族側鎖はアミノ酸溶液中で安定化され、正であれば不安定化される。アルギニン、リシン、プロリン溶液では芳香族側鎖の ΔGSC が大きく負になり、これらのアミノ酸が芳香族側鎖と強く相互作用することが示された。一方、グリシンの移相自由エネルギーは多くのアミノ酸溶液中でほぼゼロに近く、主鎖よりも側鎖の違いがアミノ酸間相互作用を大きく左右することがわかる（2）。

この視点は、タンパク質の相分離や凝集の理解にもつながる。芳香族側鎖は分子間相互作用の「ステッカー」として働き、液滴や凝集体の形成を促す。一方、グリシンのように側鎖相互作用が弱い残基は「スペーサー」として働き、相互作用部位の間隔や液滴の流動性を調整する。つまり、タンパク質の凝集や相分離は、疎水性残基の量だけでなく、どのアミノ酸がどのアミノ酸と相互作用し、それらが配列中でどのように配置されているかによって決まる（2）。

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◆アミノ酸とタンパク質の相互作用

遊離アミノ酸は、タンパク質を構成する材料であるだけでなく、タンパク質溶液の性質を調整する添加剤としても働く。アミノ酸は低分子で水に溶けやすく、電荷、極性、疎水性、芳香環や硫黄原子などの側鎖構造をもつため、タンパク質表面、水、塩、緩衝液成分との相互作用を通じて、溶解性、凝集性、粘度、酸化安定性を変化させる。医薬品タンパク質製剤では、ヒスチジン、アルギニン、グリシン、メチオニンなどがよく用いられている（1）。

アミノ酸はきわめて有能な添加剤であるという視点は、本書を通じて取り上げていくことになる。例えば、アルギニンは、タンパク質の巻き戻し、可溶化、凝集抑制、タンパク質間相互作用の低減、高濃度タンパク質溶液の粘度低下に有効な添加剤として広く使われている。その作用は単純な安定化ではなく、グアニジノ基を介した弱い相互作用、芳香族残基や荷電性残基との相互作用、水和状態の変化などが組み合わさったものと考えられる。

ヒスチジンは、側鎖の pKa が約6であるため、pH 5.5–6.5 付近の緩衝剤として使いやすく、抗体などのタンパク質製剤で重要である（2）。メチオニンは酸化されやすい硫黄原子をもち、タンパク質中のメチオニンやトリプトファンなどの酸化を抑える犠牲的酸化防止剤として働くことがある。グリシンやプロリンは、凍結乾燥、浸透圧調整、構造安定化などに関与する。したがって、アミノ酸添加剤の効果は、単なる「安定化剤」としてではなく、pH、電荷、側鎖相互作用、水和、酸化還元、濃度依存性を含む溶液設計の要素として考える必要がある。

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◆アミノ酸残基とタンパク質凝集

タンパク質凝集は、部分変性や構造揺らぎによって、分子内部に埋もれていた疎水性残基や芳香族残基が表面に露出し、分子間相互作用の起点となることで進行する。凝集しやすい領域には、ロイシン、イソロイシン、バリン、フェニルアラニン、トリプトファンなどの疎水性・芳香族残基が多く含まれる。これらの残基は水との接触を避けるように他のタンパク質分子と会合し、疎水性相互作用、π–π相互作用、分子間β構造の形成を通じて凝集核をつくりやすい。DuBay らは、アミロイド形成性ペプチドの凝集速度をアミノ酸配列から予測するモデルを構築し、疎水性が高く、β構造を形成しやすく、正味電荷が小さい配列ほど凝集しやすいことを示した（1）。したがって、凝集性はただ疎水性残基が多いというだけでなく、分子間β構造をつくる主鎖の性質と、静電反発の強さを決める荷電残基の数によっても左右される。

一方、凝集しやすい配列の周辺にアスパラギン酸、グルタミン酸、リシン、アルギニンなどの荷電性残基が配置されると、水和と静電反発によって分子間接近が抑えられる。また、プロリンは主鎖構造を折り曲げやすく、βシートの連続形成を妨げるため、凝集性配列の中断因子として働く。このような凝集性の高い領域の凝集をを抑える残基を gatekeeper residue と名付けられている（2）。抗体などの高濃度タンパク質溶液では、表面に露出した疎水性残基や芳香族残基の空間的な集まりが、自己会合や凝集の原因となる。Chennamsetty らは、抗体表面に露出した疎水性残基の集まりを spatial aggregation propensity（SAP）として評価し、凝集しやすい表面領域を同定できることを示した（3）。

タンパク質凝集をアミノ酸から理解するには、凝集しやすい疎水性残基や芳香族残基が表面に露出しているかというだけでなく、それらがβ構造を形成しやすいか、さらに周辺に荷電性残基やプロリンのような凝集抑制的な働きを持つ残基が配置されているかを見ることも重要である。

参考文献

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◆有用なアミノ酸添加剤

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◆タンパク質の構造階層

◆一次構造

タンパク質の一次構造とは、ポリペプチド鎖を構成するアミノ酸残基の種類と配列順序を指す。各アミノ酸はペプチド結合によって直鎖状につながれており、その配列は N 末端から C 末端へ向かって表記される。一次構造は原則として遺伝子の塩基配列により規定されるが、広義には、翻訳後修飾やジスルフィド結合を含む共有結合上の化学構造全体として捉えられることもある。インスリンの全アミノ酸配列が決定されたことにより、タンパク質が明確な化学構造をもつ分子であることが示され、一次構造という概念はタンパク質科学の基礎となった（1）。

高次構造は基本的にアミノ酸配列に強く依存して形成される。この考え方は、Anfinsen によるリボヌクレアーゼの再生実験に基づく熱力学的な見方として広く知られている（2）。ただし厳密には、天然構造は配列だけでなく、適切な環境条件の下で最も安定な状態として実現されると理解すべきである。この原理を背景として、近年ではアミノ酸配列情報から三次構造を予測する手法が大きく進歩し、AlphaFold は多くのタンパク質で実験構造に匹敵する高精度の予測を実現した（3）。ただし、天然変性領域、多状態性を示す系、複合体依存的な構造変化などについては、なお慎重な解釈が必要である。

◆二次構造

タンパク質の二次構造とは、ポリペプチド主鎖が局所的にとる規則的な立体配置を指す。代表的なものとして、αヘリックス、βシート、ターンがあり、これらは主として主鎖のカルボニル基とアミド基の間に形成される規則的な水素結合によって安定化される。したがって二次構造は、主鎖そのものがもつ立体化学的制約と、水素結合形成の規則性に基づいて生じる構造単位である。αヘリックスとβ構造の概念は、Pauling らの古典的研究によって明確化され、その後の構造生物学の基本概念として定着した（3, 4）。

αヘリックスは、ポリペプチド鎖が右巻きらせんを形成する構造であり、主鎖の n 番目のカルボニル酸素と n+4 番目のアミド水素との間の水素結合によって安定化される。側鎖はらせんの外側に突き出して配置されるため、片側に疎水性残基、反対側に親水性残基が偏る両親媒性ヘリックスも形成されうる。βシートは伸びたポリペプチド鎖同士が並んで水素結合を形成する構造であり、平行型と逆平行型がある。βシートでは側鎖がシート面の上下に交互に突き出すため、分子内相互作用だけでなく、分子間会合やアミロイド様凝集体の構造にも現れやすい。ターンは主鎖の進行方向を反転させたり、二次構造要素どうしを連結したりする部分である。これに対し、ランダムコイルという語は、αヘリックスやβシートのような規則構造をとらない領域を指し、その多くは三次構造中で柔軟性や分子認識に関与する。

◆三次構造

タンパク質の三次構造とは、一本のポリペプチド鎖全体が折りたたまれて形成する三次元的な立体配置を指す。二次構造が主鎖によって作られる局所構造であったのに対し、三次構造は分子全体としての立体構造である。多くの球状タンパク質では、疎水性残基が内部に埋もれ、親水性残基や荷電残基が外部の水相に面するように配置される。この配置は、水中で安定な構造を形成するうえで基本的な原理となる（6）。三次構造は、アミノ酸側鎖間の相互作用に加え、溶媒との相互作用を含む多様な相互作用の総和として形成される。

多くのタンパク質では、三次構造の中にドメインと呼ばれる比較的独立した構造単位が認められる。ドメインは独自の折りたたみと機能をもつことが多く、その相対配置や柔軟性の変化は、酵素活性の制御、分子認識、アロステリック制御などに深く関わる。ドメインの大きさには幅があるため、一定の残基数で厳密に区切るよりも、比較的独立に折りたたみうる構造・機能単位として理解する方が適切である。三次構造は、配列情報が分子全体の立体構造へ変換された段階であり、多くのタンパク質機能はこの階層ではじめて具体化される。

◆四次構造

タンパク質の四次構造とは、複数のポリペプチド鎖が会合して形成する高次の立体構造を指す。ここで各ポリペプチド鎖はサブユニットと呼ばれ、それぞれが独立した三次構造をもちながら複合体を形成する。四次構造を安定化する力は、基本的には三次構造を支えるものと同様であり、疎水性相互作用、水素結合、静電相互作用、ファンデルワールス相互作用などの非共有結合が中心となる。場合によっては、サブユニット間のジスルフィド結合が安定化に寄与することもある。

四次構造は、単に分子が集まっているだけではなく、反応効率や制御性に関与することが多い。ヘモグロビンにおける酸素結合の協同性はその代表例であり、一つのサブユニットでの状態変化が他のサブユニットへ伝播することで、全体の機能応答が増幅される（7）。四次構造は、特定のタンパク質どうしが特異的に会合して形成される秩序ある複合体であり、この点で、非特異的な凝集体や液滴状集合体として現れる五次構造とは区別される。

◆五次構造

タンパク質の一次構造から四次構造までの用語法は、Linderstrøm-Lang にさかのぼる概念整理を背景として成立し、少なくとも 1961 年には Wettlaufer により primary、secondary、tertiary などの用語として明示的に紹介されている（8）。一方、五次構造（quinary structure）という語は McConkey に由来し（9）、近年の回顧的総説でもそのように位置づけられている（10）。当初この語は、細胞内の高分子混雑環境における弱く一過的な分子間相互作用の総体を指していた（11）。しかし五次構造の用語は、一次構造から四次構造ほどには標準化されておらず、現在でも、異なるプロトマー配置をもつ会合体平衡を重視する Jaffe らの morpheein モデルのような用法から（12）、細胞の中にみられるメタボロンやドロプレットなどを指す用法まで、幅をもって用いられている。

五次構造は、確立した単一定義をもつ用語というより、四次構造を超えた動的な集合状態を捉えるための拡張概念として理解するのが適切である。あらためて定義すると、五次構造は、細胞内での液-液相分離によるドロプレットや、試験管内で形成されるアモルファス凝集体、食品タンパク質の加熱ゲル、高濃度抗体溶液にみられる自己会合状態、さらには結晶やアミロイドのような比較的規則的な集合体まで、蛋白質溶液系にみられる蛋白質集合状態ということができる。

蛋白質溶液学の立場から考えると、五次構造の階層を明示的に導入する意義は大きい。実際のタンパク質は、細胞内であれ試験管内であれ、希薄な単分子状態で存在することの方がむしろ例外的であり、多くの場合、溶液中で他分子と接触しながら集合状態をとっており、それが機能構造の本質であったり避けるべき副反応として制御が期待されたりしているからである。

また、五次構造を特徴づける重要な点は、時間依存性である。四次構造までの記述が比較的静的な構造概念であるのに対し、五次構造では形成過程そのものが本質となる。たとえば、液液相分離した液滴が時間とともに成熟してより固い集合体へ移行したり、可溶性オリゴマーがゆっくり不溶性粒子へ成長したりする現象では、状態そのものよりも状態間の遷移を理解することが重要である。したがって五次構造を理解するには、平衡論だけでなく、核形成、成長、老化、再編成、不可逆化といった速度論的視点が不可欠となる。タンパク質の一次構造が分子生物学の主題であり、三次構造が構造生物学の主題であるなら、五次構造は蛋白質溶液学の中核概念の一つとして位置づけることができる。

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7. Perutz, M. F.; Rossmann, M. G.; Cullis, A. F.; et al. Structure of Haemoglobin: A Three-Dimensional Fourier Synthesis at 5.5-Å Resolution, Obtained by X-Ray Analysis. Nature 1960, 185, 416–422.

8. Wettlaufer, D. B. Terminology of Protein Structure. Nature 1961, 190, 1113.

9. McConkey, E. H. Molecular Evolution, Intracellular Organization, and the Quinary Structure of Proteins. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 1982, 79, 3236–3240.

10. Cohen, R. D.; Pielak, G. J. A Cell Is More than the Sum of Its (Dilute) Parts: A Brief History of Quinary Structure. Protein Sci. 2017, 26 (3), 403–413.

11. Guin, D.; Gruebele, M. Weak Chemical Interactions That Drive Protein Evolution: Crowding, Sticking, and Quinary Structure in Folding and Function. Chem. Rev. 2019, 119 (18), 10691–10717.

12. Jaffe, E. K. Wrangling Shape-Shifting Morpheeins to Tackle Disease and Approach Drug Discovery. Front. Mol. Biosci. 2020, 7, 582966.

◆20種類のアミノ酸が選ばれた理由

生物を構成するアミノ酸は20種類である。では、なぜこの20種類のアミノ酸セットが選ばれ、現在まで変わることがなかったのだろうか。さまざまな理由が議論されてきたが、ここではタンパク質フォールディングの観点から、この標準アミノ酸の性質を考えてみたい。

◆タンパク質を構成するアミノ酸

生物の遺伝子にコードされるアミノ酸は基本的に20種類である。例外的に、システインの側鎖がセレンに置き換わったセレノシステイン（1）や、リシン側鎖にピロリン環が結合したピロリシン（2）を持つ生物も存在するが、全体としてはほぼ全ての生物が同じアミノ酸セットを利用している。この20種類のアミノ酸の表を眺めると、いくつかの疑問が自然に湧いてくる。

一部の疑問は、従来の生化学や高分子科学の知識で説明できる。α-アミノ酸はβ-アミノ酸やγ-アミノ酸に比べて、非生物的条件下でも合成されやすいことが知られており、ミラーの放電実験や隕石中のアミノ酸分析でも確認されている（3）。しかし、それだけでは説明が不十分である。例えば、ペプチド結合はエステル結合やチオエステル結合よりも加水分解に強く、ヒドロキシ酸やチオ酸よりも安定であることが、選択の一因であった可能性がある（4）。さらに、ポリエステルやポリチオアミドでは、タンパク質の二次構造を安定化する主鎖間の水素結合を形成できないため、現存するタンパク質に類似した立体構造は作れない。主鎖に炭素が一つ多いβ-ペプチドも立体構造を形成できるが、フォールディング可能な空間を考慮すると、α-ペプチドの方が有利であると考えられる（5）。

では、α-アミノ酸の中で、なぜこの20種類が標準として選ばれたのだろうか。20種類のアミノ酸の大きさはさまざまで、炭素数で見るとグリシンはわずか2個だが、最も大きなトリプトファンは11個のである。炭素数が増えるほど異性体の数も急増する。例えば、炭素数6個のアミノ酸には理論上654種類もの異性体が存在するが、標準アミノ酸セットに含まれるのはロイシンやイソロイシンなどわずか5種類しかない（3）。このように、α-アミノ酸には多くの候補があるにもかかわらず、なぜ一部のみが選ばれたのだろうか。それは次に述べるように、ペプチドになったときの溶解性やフォールディングのしやすさが、この選択に大きく関わった可能性が高いと考えられている。

◆初期アミノ酸セットの特徴

生物の標準アミノ酸20種類を分類すると、無生物的に合成されやすい初期アミノ酸として、疎水性や酸性のアミノ酸など約10種類が含まれることがわかる（6）。これらは、ミラーの放電実験や熱水噴出孔での合成、隕石の分析などからも示唆され、初期アミノ酸の組み合わせによりタンパク質様のペプチドが形成されていた可能性がある。その後、塩基性アミノ酸や芳香族アミノ酸、チオール基を持つアミノ酸が生化学的に合成可能となり、後期アミノ酸として標準セットに組み込まれたと考えられている（7）。初期には酸性アミノ酸は存在していたが、塩基性アミノ酸はまだ存在しなかったとされる（8）。

一方、前生物的世界に豊富であったとされるノルバリンやノルロイシンのような直鎖側鎖アミノ酸、小型の2-アミノブチル酸は標準アミノ酸には選ばれなかった。この代わりに、同程度の大きさの分岐アミノ酸（バリン、ロイシン、イソロイシン）が標準アミノ酸として採用された。系統学的分析によると、トリプトファンは20種類の中で最後に追加されたアミノ酸とされる（10）。すなわち、普遍的共通祖先が登場した時点で遺伝暗号表は完成しておらず、後にバージョンアップされることで現在の20種類のアミノ酸セットが形成され、地球上の生物多様性を支えてきたと考えられる（11）。

◆フォールダビリティとアミノ酸

20種類のアミノ酸セットを、ペプチドのフォールディングの観点から評価した研究がある（12）。ここでは、想定される初期アミノ酸から25残基のペプチドを合成し、その物理化学的性質を調べたものである。

初期アミノ酸セットには、小型アミノ酸（グリシン、アラニン、プロリン）、ヒドロキシ基を持つアミノ酸（セリン、スレオニン）、酸性アミノ酸（アスパラギン酸、グルタミン酸）、分岐アミノ酸（バリン、ロイシン、イソロイシン）が含まれ、進化上後期に追加された塩基性や芳香族アミノ酸は含まれていない。これらをランダムにペプチド結合して作った25残基のペプチドを「初期アミノ酸ペプチド」と名付けた。同様に、分岐アミノ酸を直鎖状アミノ酸に置き換えたペプチドを「アンブランチペプチド」、初期アミノ酸にアルギニンを加えたペプチドを「アルギニンペプチド」、チロシンを加えたペプチドを「チロシンペプチド」、直鎖状のジアミノブチル酸を加えたペプチドを「ジアミノペプチド」と呼んだ。

ここで、合成ペプチドの溶解度を比較すると、アンブランチペプチドは溶解性が高く、さらにジアミノペプチドは溶解性がより高かった。これは、前生物時代に豊富だったアミノ酸を単純にペプチド化すると溶解性が高すぎるため、溶けやすいアミノ酸が排除される方向で初期アミノ酸セットが形成されたことを示唆する。

さらに、システインを除く標準アミノ酸19種類からなるペプチドでは、酸性から中性pHで広い範囲にわたり溶解性が低いことが確認され、初期アミノ酸よりも溶解性が抑えられることがわかった（13）。また、初期アミノ酸ペプチドやアンブランチペプチド、ジアミノペプチドは二次構造を形成しにくいが、チロシンの追加で二次構造形成能が向上することも確認された。標準アミノ酸として最後にトリプトファンが加わったことも、この溶解性とフォールディングの関係と関連していると考えられる。すなわち、初期アミノ酸から現在の標準アミノ酸セットが形成される過程には、溶解性の適正化と二次構造形成能の向上が重要な要因として関与していたと理解できる。

◆アミノ酸から見たタンパク質

生物を構成するアミノ酸は、単に無生物的に合成されやすいという理由だけで選ばれたわけではない。ペプチドが立体構造を形成しやすいようなバイアスがかかっていたのである。正電荷を持つアミノ酸は水に溶けやすいため、初期のアミノ酸セットには含まれなかったと考えられる。しかし、ペプチドがある程度フォールディングできるようになると、側鎖の負電荷は正電荷とのイオン対形成によって構造を安定化できるようになり、存在に有利である。こうして後に、塩基性アミノ酸は標準アミノ酸に組み込まれていったと考えられる。また、芳香族アミノ酸は、短いペプチドに組み込まれると二次構造を安定化しやすいため、現存する3種類にまでバリエーションが増えたのかもしれない。

この過程を液–液相分離（LLPS）の観点から見ると、初期アミノ酸セットは「溶解性が高すぎず、局所的凝集や相分離が過剰にならない」バランスを持っていたことがわかる。後期アミノ酸の追加により、疎水性、電荷、芳香族残基による相互作用が増え、ペプチドやタンパク質は局所的な濃縮や機能的ドメイン形成を行いつつ、安定した二次・三次構造も維持できるようになった。つまり、標準アミノ酸セットの選択は、フォールディング可能性と液–液相分離の両方を制御するという、シンプルで強力な物理化学的制約に基づいていたと考えられる。

共通性と多様性を兼ね備えた20種類のアミノ酸セットは、地球上の生物が何十億年もかけて多様なタンパク質を生み出し、さまざまな環境に適応して進化する基盤となったのである。タンパク質のフォールディングと相分離という単純な制約が、生命の普遍性と多様性の両方を支えていたのは、非常に示唆に富む事実である。

参考文献

1. Johansson L, Gafvelin G, Arnér ES. Selenocysteine in proteins-properties and biotechnological use. Biochim Biophys Acta. 2005 Oct 30;1726(1):1-13.

2. Krzycki JA. The direct genetic encoding of pyrrolysine. Curr Opin Microbiol. 2005 Dec;8(6):706-12.

3. Cronin JR. Origin of organic compounds in carbonaceous chondrites. Adv Space Res. 1989;9(2):59-64.

4 .Cleaves HJ 2nd. The origin of the biologically coded amino acids. J Theor Biol. 2010 Apr 21;263(4):490-8.

5. Cheng RP, Gellman SH, DeGrado WF. beta-Peptides: from structure to function. Chem Rev. 2001 Oct;101(10):3219-32.

6. Cleaves HJ 2nd. The origin of the biologically coded amino acids. J Theor Biol. 2010 Apr 21;263(4):490-8.

7. Higgs PG, Pudritz RE. A thermodynamic basis for prebiotic amino acid synthesis and the nature of the first genetic code. Astrobiology. 2009 Jun;9(5):483-90.

8. Meierhenrich UJ, Muñoz Caro GM, Bredehöft JH, Jessberger EK, Thiemann WH. Identification of diamino acids in the Murchison meteorite. Proc Natl Acad Sci U S A. 2004 Jun 22;101(25):9182-6.

9. Zaia DA, Zaia CT, De Santana H. Which amino acids should be used in prebiotic chemistry studies? Orig Life Evol Biosph. 2008 Dec;38(6):469-88.

10. Fournier GP, Alm EJ. Ancestral Reconstruction of a Pre-LUCA Aminoacyl-tRNA Synthetase Ancestor Supports the Late Addition of Trp to the Genetic Code. J Mol Evol. 2015 Apr;80(3-4):171-85.

11. Freeland S. Undefining life's biochemistry: implications for abiogenesis. J R Soc Interface. 2022 Feb;19(187):20210814.

12. Makarov M, Sanchez Rocha AC, Krystufek R, Cherepashuk I, Dzmitruk V, Charnavets T, Faustino AM, Lebl M, Fujishima K, Fried SD, Hlouchova K. Early Selection of the Amino Acid Alphabet Was Adaptively Shaped by Biophysical Constraints of Foldability. J Am Chem Soc. 2023 Mar 8;145(9):5320-5329.

13. Tretyachenko V, Vymětal J, Neuwirthová T, Vondrášek J, Fujishima K, Hlouchová K. Modern and prebiotic amino acids support distinct structural profiles in proteins. Open Biol. 2022 Jun;12(6):220040.

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