Esporos

A extração de esporos de FMAs é uma das atividades rotineiras na CICG. O método utilizado para extrair os esporos de culturas puras, culturas armadilhas ou de amostras de solo do campo é o de peneiragem úmida (Gerdemann & Nicolson, 1968) seguido por centrifugação em gradiente de sacarose (20% e 60%).

A amostra de solo será diferente de acordo com sua origem: a) uma pequena parte (ca. 30 ml) do substrato é retirada de um dos lados do tubetes  com o auxilio de uma tesoura para analisar culturas puras, b) um ou dois cilindros metálicos (ca. 50 ml) retirados de potes para analisar culturas armadilhas, e c) aliquota de solo (50 ou 100 ml) de amostras provenientes do campo ou acessos que são enviados para serem depositados na CICG. É importante em todos os casos que as amostras incluam raízes visto que algumas espécies de FMAs produzem esporos intraradiculares.

A amostra é colocada em um becker de metal e suspendida com água de torneira (ca. 1,7 L). Um bastão de vidro é usado para colocar os esporos em suspensão.  Após, a suspensão é passada através de duas peneiras sobrepostas, tomando-se o cuidado para que a maioria das partículas de solo fique retida no becker.

A peneira de baixo possui abertura de 45 µm (ou de 25 µm) onde a maioria dos esporos ficará retido. Outras peneiras com aberturas de 53 µm e 38 µm também podem ser utilizadas. 

A peneira de cima possui abertura de 710 µm. Nesta peneira ficará retido as raízes de maior calibre, detritos orgânicos e partículas maiores do solo (areia) e esporos grandes e esporocarpos. 

O material retido na peneira de 710 µm é transferido para uma placa de Petri grande e inspecionada na lupa para observação e coletada de esporos grandes e esporocarpos. O material retido na peneira de 45 µm é inicialmente coletado em becker com ajuda de um “rubber policeman” preso a um bastão de vidro e então transferido para tubos Falcon de 50 ml contendo o gradiente de 20% e 60% de sacarose (15 ml de cada uma das soluções). Os tubos são então centrifugados por 1 minuto a 2000 rpm (centrifuga marca CELM - modelo LS-3plus). Neste processo, o solo e outras partículas sedimentam e os esporos e partículas orgânicas finas ficam suspensos na sacarose.

O supernatante de cada tubo é então rapidamente decantado em uma peneira de 45 µm feita de inox. Esta peneira tem a mesma abertura que a peneira utilizada na peneiragem úmida, porém tem um tamanho menor. O material coletado nesta peneira é lavada por 1 minuto com água de torneira para remover o excesso de sacarose e transferido para placas de Petri. Os esporos são observados na lupa e coletados manualmente com uma pipeta de Pasteur com a ponta afinada no fogo. As placas e esporos coletados são armazenados em geladeira (4º C) e processados de acordo com a finalidade no prazo de uma semana.

Para adiantar o trabalho na coleta dos esporos, inicialmente se faz uma aferição na lupa do tamanho dos esporos dos vários morfotipos (em caso de esporos provenientes de culturas armadilhas ou do campo). Após, o material coletado na peneira de 45 µm (maior que 45 µm e menor que 710 µm) pode ser passado através de várias peneiras com diferentes aberturas (300, 250, 180, 125 e 90 µm). Este processo facilita a coleta dos esporos, pois há separação de morfotipos de tamanhos diferentes e também separa detritos de diferentes tamanho.

O passo final e mais trabalhoso é separar os esporos de cada morfotipo (exceção se for culturas puras) para serem utilizados para varias finalidades (montar esporos em lâminas, inocular plantas para experimento ou para culturas puras, extrair DNA, experimentos de germinação, etc). Para separar esporos em morfotipos, conhecimento e habilidade em taxonomia é necessário, mas se os esporos estão em boas condições, qualquer pessoa que seja boa observadora pode separar os esporos em morfotipos.

Os esporos de FMAs provenientes de culturas puras, culturas armadilhas ou de solo do campo são montados em lâminas permanentes. O meio de montagem utilizado é o Polivinil-Ácido Lático-Glicerol (PVLG) e PVLG misturado ao reagente de Melzer.

Numa lâmina, coloque gentilmente uma gota de PVLG e outra gota de PVLG+Melzer. Após coloque os esporos usando uma pipeta de Pasteur com a ponta afinada, tomando o cuidado para não dispensar muita água junto com os esporos. Com uma agulha, misture bem os esporos junto ao meio de montagem deixando-os no centro da gota. Após, deixe a lâmina descansar por cerca de 5 minutos para deixar a superfície da gota secar um pouco (isto ajudará a não ter bolhas quando colocar a lamínula)

Coloque uma lamínula gentilmente sobre a gota com o PVLG e pressione suavemente. Coloque outra lamínula sobre a gota com PVLG+Melzer e pressione suavemente. 

Na lupa quebre os esporos individualmente usando uma agulha ou a ponta de um lápis, pressionando diretamente sobre a lamínula. Com este procedimento, cada esporo pode ser quebrado para ficar no formato de um C (ou como o “pac man”), expondo assim as paredes germinativas. Se for necessário, acrescente mais um pouco do meio de montagem pelos lados das lamínulas. Deixe a lâmina secar em temperatura ambiente por 5 dias e após coloque em estufa a 35-40º C por 3 dias para o meio de montagem endurecer. Não há necessidade de selar a lamínula pois com o meio de montagem endurecido, as lâminas tornam-se permanentes.

Uma etiqueta deve sempre acompanhar cada lâmina de deve conter as seguintes informações: a) nome do gênero e epíteto específico se conhecido, b) data, c) código da cultura (ou da amostra). 

As lâminas são estocadas em bandejas de alumínio em caixas de carvalho e organizada por gêneros e espécies.

Receitas para PVLG, Melzer e Azida Sódica