Culturas Puras

O estabelecimento de culturas puras de FMAs é uma tarefa que exige paciência e atenção em todos os passos durante o processo. O método utilizado na CICG para estabelecer culturas puras é através da inoculação de esporos em plântulas pré-germinadas de braquiaria (Brachiaria brizantha). Desta forma, a origem dos esporos (do campo ou de culturas armadilhas) é de extrema importância para o sucesso das culturas puras. Em alguns casos, os esporos podem ser provenientes diretamente do solo do campo, embora a porcentagem de sucesso neste caso possa ser baixa ou então nula. Exceção ocorre quando o solo possui baixa quantidade de matéria orgânica (e.g., solos de dunas) ou os esporos estão excepcionalmente com boa qualidade (sem indícios de parasitismo, conteúdo do esporo límpido e claro). Quando os esporos utilizados para o estabelecimento de culturas puras forem provenientes de culturas armadilhas, a porcentagem de sucesso é alta. Isto porque os esporos obtidos de culturas armadilhas foram produzidos nos últimos 3-4 meses e desta forma estão saudáveis e todos com a mesma idade. Além disto, eles apresentam todas as características importantes para a identificação acurada das espécies.

Os esporos inicialmente são extraídos via peneiragem úmida e gradiente de sacarose (20%-60%) do campo ou das culturas armadilhas apenas 2-3 dias antes da inoculação. Após, os esporos são separados por morfotipos, retirando-os da placa de Petri com o uso de uma pipeta de Pasteur, e colocados em um vidro relógio. Até o momento da inoculação eles são mantidos limpos neste vidro relógio, o qual é acondicionado em uma placa de Petri e guardados na geladeira. Este tempo na geladeira é importante para reduzir a infectividade de algum pedaço de hifa que pode eventualmente estar presente junto aos esporos. Os esporos são examinados diariamente e esporos que apresentem alguma alteração na morfologia ou tiverem evidências de parasitismo são retirados.

Antes da inoculação, um pouco de água é adicionado ao vidro relógio e os esporos remexidos com o uso de uma agulha, e qualquer partícula estranha, pedaços de hifas ou esporos velhos são removidos.

IMPORTANTE: o vidro relógio deve ser atentamente averiguado para eliminar qualquer pedaço de hifa que possa estar presente junto aos esporos ou flutuando na água. Isto porque, as hifas de algumas espécies são altamente infectivas e, se inoculadas junto com os esporos, pode ser uma das fontes de contaminação, a qual é detectada muitas vezes apenas após vários ciclos de cultivo.

As culturas puras são estabelecidas em cones plásticos pretos com três ranhuras e capacidade de 270 ml de substrato, no qual são transplantadas 3 plantulas da espécie hospedeira (ver abaixo). Estes cones são primeiramente esterilizados mantendo os mesmos em água sanitária 10% por 3 dias, lavados em água corrente e estocados em sacos plásticos limpos. Os cones são preenchidos com o substrato padrão utilizado na CICG: uma mistura (1:1) de solo e areia quartzosa (tamanho de partícula = 0,9 mm) esterilizada. Os cones são então etiquetados com o nome da espécie, o código do isolado e a data. Um buraco é feito no centro de cada cone usando um bastão de vidro previamente esterilizado com álcool 70% e passado na chama de uma lamparina.

Toda semana, um pote (500 ml) contendo o substrato padrão é preparado semeando-se 30-40 sementes de braquiaria. Esta quantidade é suficiente para iniciar 10-13 culturas puras por semana. Nossa planta hospedeira é a braquiaria, pois ela resiste ao transplante, se desenvolve bem nas condições de nossa casa-de-vegetação e não é atacada por formigas. Pode-se usar outras plantas hospedeiras também como o sorgo, milheto, ou mesmo uma leguminosa; o importante é a planta ter um sistema radicular bem desenvolvido e crescer bem nas condições de casa-de-vegetação.

O conteúdo deste pote é gentilmente disposto numa bandeja ou num recipiente limpo com água aproximadamente uma hora antes de estabelecer as culturas puras. Após, grupos de 3 plântulas são separadas, as quais serão inoculadas com os esporos de FMAs limpos e que estão no vidro relógio.

As três plântulas são colocadas juntas e as raízes passadas sob água de torneira para ficarem todas juntas. Após, os esporos são coletados com o uso de uma Pipeta de Pasteur (uma pipeta limpa para cada isolado fúngico) e pipetados ao longo do sistema radicular das três plântulas. Os esporos ficam aderidos as raízes e o excesso de água escorre pela extremidade das raízes.

O número de esporos a ser pipetado em cada conjunto de três plântulas depende do gênero de FMA. Para esporos gigasporóides (e.g. Gigaspora, Scutellospora, Racocetra ) e glomóides ( e.g., Paraglomus, Glomus, Septoglomus, Funneliformis) que germinam rapidamente, cerca de 50-70 esporos são inoculados, enquanto que para Acaulospora e Entrophospora utilizamos no mínimo 100 esporos. Para outros gêneros não há esta informação porque alguns não tem sido estabelecidos em cultura pura.

Claro que a quantidade de esporos vai depender também da quantidade de esporos que conseguimos extrair de uma cultura armadilha. Algumas espécies esporulam em baixa quantidade em culturas armadilhas e assim, se há interesse em obter isolados destas espécies, um número menor do que o mencionado acima é utilizado..

As plântulas são então imediatamente transplantadas para o centro do cone e o bastão de vidro utilizado para acomodar as plântulas no buraco e compactar o substrato ao redor das raízes para que as plântulas fiquem de pé.

Após, um pouco do substrato padrão esterilizado é colocado na parte de cima do cone e gentilmente ao redor das plântulas, deixando um espaço para a rega. Todos os cones são regados e transportados para a casa-de-vegetação que contém apenas culturas puras. Apesar do substrato padrão ser muito pobre em nutrientes, a fertilização não ocorre nos primeiros 30 dias para estimular a germinação dos esporos e a colonização micorrízica. Geralmente apenas após 45 dias é adicionado 50 ml por cone da solução nutritiva de Long-Ashton com 10% de P apenas.

Adicionar o substrato padrão na parte de cima do cone é uma maneira eficiente de evitar contaminação cruzada e permite que varias culturas puras sejam cultivadas ao mesmo tempo na casa-de-vegetação, com o cuidado mínimo na hora da rega.