O método utilizado para a descoloração de raízes na CICG é o proposto por Koske & Gemma (1989). De acordo com os autores, este método tem sido extensivamente utilizado com sucesso em 150 espécies de plantas de 65 famílias botânicas de Angiospermas, samambaias, licopódios, psilotófitas e briófitas.
Independente da origem das amostras de raízes (do campo ou plantas em casa de vegetação), é importante selecionar raízes mais finas para detectar a colonização micorrízica. Raízes mais velhas e grossas podem até conter colonização micorrízica, geralmente na forma de hifas visíveis na parte externa da mesma. Raízes pigmentadas, como aquelas de algumas pteridófitas (samambaias) ou mesmo de espécies arbóreas, podem requerer um passo adicional de imersão em H2O2 Alcalina.
É importante lavar bem as raízes para remover detritos orgânicos ou particulas de solo junto as mesmas que possam atrapalhar o processo de visualização da colonização. Assim, antes de iniciar o processo de descoloração, as raízes devem ser lavadas e após, colocadas em beckers ou dentro de cassetes plásticos. Na CICG utilizamos os cassetes retangulares com poros de 0,9 mm. Cassetes com tamanho de poros maiores pode levar a perda de raiz durante o processo de descoloração. As raízes devem ser acomodadas dentro dos cassetes (0,1 a 0,2 g no máximo) de forma a permitir a máxima infiltração das soluções durante o clareamento. Cassetes contendo muitas raízes podem levar a uma descoloração não uniforme.
As raízes são clareadas por imersão em uma solução de KOH 10% (hidróxido de potássio) e levadas ao banho-maria (90o C) por 60 minutos. O protocolo original de Koske & Gemma (1989) recomenda usar uma solução de KOH 2,5% apenas. Este passo é importante para remover o conteúdo citoplasmático das células e ao final do mesmo, a solução está com uma coloração marrom. Em casos que a raiz seja muito pigmentada pode-se deixar as mesmas imersas em KOH 10% a frio por uma noite e depois colocar no banho-maria. Em casos mais extremos, deve-se trocar pelo menos uma vez a solução de KOH 10%.
Despeje o KOH em um recipiente apropriado para seu tratamento (evite despejar na pia) e lave as raízes com água corrente para remover o excesso de KOH. Caso as raízes estejam ainda escuras, coloque as mesmas numa solução de H2O2 alcalina (30 ml de uma solução H2O2 e 3 ml de uma solução de NH4OH ) e deixe por 10 minutos (depende do quão escura a raiz está após o KOH). IMPORTANTE: A solução de H2O2 alcalina deve ser preparada minutos antes de ser utilizada. Após, lave novamente em água corrente.
Após, cubra as raízes com uma solução de HCl 1% (ácido clorídrico) por 5-10 minutos. É importante que as raízes estejam bem acidificadas para uma coloração apropriada visto que os corantes utilizados são básicos. Assim, se usar o passo acima com H2O2 alcalina, pode-se deixar alguns minutos a mais na solução de HCl. Raízes provenientes de solos com alto pH (solos básicos), o tempo de imersão no HCl pode ser maior.
Remova o HCl apropriadamente e NÃO lave as raízes. Coloque as mesmas numa solução de glicerol acidificado (500 ml Glicerina, 450 ml água destilada, 50 ml HCL 1%) contendo 0.05% de azul de tripan (0,5 g em 1 L de solução). As raízes são deixadas em banho-maria (90o C) por 50-60 minutos. Após, a solução corante é colocada em frascos ambar e pode ser utilizado por mais uma ou duas vezes (importante filtrar o mesmo através de um pedaço de gaze para remover eventual pedaços de raízes), ou então pode ser descartada apropriadamente. As raízes coradas podem ser mantidas em geladeira a 4o C cobertas com água destilada (para evitar posterior crescimento de fungos saprófitas). Um maior contraste das estruturas fungicas contra as células vegetais é obtido após as amostras terem sido estocadas por uma semana, visto que o excesso de corante é removido das raízes.
Para estocar as raízes por um tempo maior, elas podem ser colocadas em tubos de vidro com tampa rosqueavel contend uma mistura de água:glicerina (2:1, vol/vol) com 1-2 gotas de 0.05% de ázida sódica. O corante é retido nos tecidos fúngicos por mais de um ano. Este procedimento é adotado na CICG para observar o padrão de colonização dos isolados fúngicos.
Procedimento metodológico de coloração das raízes:
1) Dispor as amostras de raízes em beckers ou em cassetes
2) Identificar apropriadamente as amostras
3) Cobrir as amostras com KOH 10% de forma que nenhuma parte das raízes fiquem descobertas
4) Levar as amostras ao banho-maria previamente aquecido a temperature de 90o C por 50-60 minutos
5) Lavar as raízes em água corrente (2-3 vezes) para remover excesso de KOH
6) Casos seja necessário, clarear as raízes em H2O2 alcalina (3 ml solução NH4OH 20% e 30 ml solução H2O2 3%) por 5 minutos e após lavar rem água corrente.
Este passo é opcional e depende da pigmentação da raiz.
7) Cobrir as amostras com HCL 1% por 10 minutos
8) Descartar o HCL 1%
NÃO LAVAR AS RAÍZES APÓS ESTA ETAPA
9) Cobrir as amostras com solução de glicerol acidificado (500 ml Glicerina, 450 ml água destilada, 50 ml HCL 1%) contendo 0.05% de azul de tripan (0,5 g em 1 L de solução de glicerol acidificado) e levar ao banho-maria (90o C) por 50-60 minutos.
10) Descartar apropriadamente a solução corante e lavar em água corrente para remover o excesso de corante.
11) Armazenar as raízes em água destilada em geladeira 4o C por pelo menos uma semana antes de analisar.
Koske RE & Gemma JN (1989) A modified procedure for staining roots to detect VA mycorrhizas. Mycological Research 92(4):486-505.
PORCENTAGEM DE COLONIZAÇÃO RADICULAR
A mensuração da colonização micorrízica é um das avaliações comumente feita em raízes coletadas de plantas a campo ou de plantas provenientes de experimentos (em casa-de-vegetação ou a campo). A colonização micorrízica estima o crescimento de um isolado fúngico ou de uma comunidade de FMAs dentro do córtex radicular.
O método mais utilizado para mensurar a colonização micorrízica é o da intersecção das linhas cruzadas (grid line method) proposto por Giovannetti & Mosse (1980).
Para este método é necessário uma placa de Petri com uma grade quadriculada de 1,1 x 1,1 cm na base. Utilizando este tamanho de grade, pode se obter tanto a porcentagem de colonização micorrízica como o comprimento de raiz colonizada.
Inicialmente, as raízes devem ser coloridas de acordo com os diferentes métodos propostos na literatura ou em solução de glicerol acidificado com 0.05% de azul de tripan (Koske & Gemma 1989).
Procedimento
1) Espalhe as raízes coradas homogeneamente na placa de Petri
2) Na lupa, observe as linhas horizontais e verticais da grade e registre:
a) o número total de intersecções entre as linhas da grade e raízes (R1)
b) o número de intersecções com raízes micorrizadas (R2)
3) A porcentagem de colonização micorrízica (% CM) é obtida pela fórmula:
%CM = (R2/R1) * 100
Exemplo:
Após espalhar homogeneamente as raízes sobre a placa de Petri quadriculada de 1,1 x 1,1 cm, o número de intersecções entre um pedaço de raiz e as linhas verticais e horizontais são as seguintes:
- 25 intersecções (linhas horizontais)
- 18 intersecções (linhas verticais)
- 12 intersecções apresentando colonização micorrízica
Assim:
a) Comprimento Total de Raíz = 43 cm (25 + 18)
b) Comprimento de Raiz Colonizada = 12 cm
c) Porcentagem de Colonização Micorrízica = (12/43) * 100 = 27,9%
Como pode ser percebido, o número total de intersecções entre raízes e linhas representa o comprimento total de raízes, caso todo o sistema radicular de uma planta estiver espalhado na placa de Petri. Também é possível calcular o comprimento total de raiz se apenas um amostra de raízes for obtida do sistema radicular (em casos da planta produzir muita raiz que dificulte a avaliação de todo o sistema radicular. Para maiores detalhes de como proceder neste caso veja explicação no site do INVAM: http://invam.caf.wvu.edu/methods/mycorrhizae/rootlengths.htm
Giovannetti M & Mosse B (1980) An evaluation of techniques for measuring vesicular-arbuscular mycorrhizal infection in roots. New Phytologist 84:489-500.