RNA extraction Tryzol

Cellule pellettate:

aggiungere un millilitro di Tryzol fino a 500 milioni di cellule., pipettando piu’ volte per rendere omogeneo il pellet.

- incubare 5’ a t.ambiente (15-30 °C)

- aggiungere 0.2 ml di cloroformio per ml di Tryzol

- chiudere il campione

- agitare manualmente i tubi per 15 sec e incubare a t.a per 2 –3 min.

- cfg 120000 rpm per 15’ a 2-8 °C

- In seguito alla centrifugazione la miscela si separa in una fase bassa rossa di fenolo cloroformio,un’ interfase ed una fase acquosa incolore.

- L’RNA rimane nella fase acquosa.

- Il volume della fase acquosa è circa il 60% del volume di tryzol utilizzato.

PRECIPITAZIONE DELL’RNA

Trasferire la fase acquosa in un nuovo tubo e tenere la fase organica se si desirerano estrarre DNA o Proteine.

Precipitare la fase acquosa mescolando con isopropilalcool.

Utilizzare 0.5 ml di isopropilalcool per 1 ml di Tryzol iniziale.

Incubare i campioni a t.a per 10 minuti e centrifugare a 12000 rpm per 10min. a 2-8 °C

L’RNA spesso precipita tipo gel sul fondo e sulla parete della eppendorf.

LAVAGGIO DELL’ RNA

Rimuovere il surnatante.

Lavare il pellet con etanolo 75% , utilizzando 1 ml per campione.

Mischiare il campione vortexando e cfg a non piu di 7500 rpm. Per 5’ a 2-8 °C.

Asciugare il campione all’aria e scioglierlo in acqua Rnase free ; incubare a 55- 60 °C per 10 min .

Mettere in ghiaccio e quantificare.