黴漿菌之污染測試--PCR法

原理：

利用具特殊專一性之primers，經由PCR反應來複製mycoplasma DNA。所用之primers來自mycoplasma之conserved 16S-23S rRNA序列，由於此段spacer之序列依mycoplsma種類不同而不同，因此可依所複製之DNA大小及其restriction fragment大小差異來作偵測與鑑定。

1.1 特點：

1.1.1 靈敏(e.g. 0.1~1.6 CFU / 5 ul sample) 與快速(一天)。

1.1.2 可偵測不易培養之mycoplasma (e.g. M. hyorhinis)。

1.1.3 不需培養mycoplasma作為正反應對照組，避免可能之污染。

1.2 缺點︰

1.2.1 PCR反應很靈敏，易有偽陽性結果。

1.2.2 此方法尚在評估中，故結果僅作為參考和內部品管之一部份。

材料與設備：

2.1 ATCC mycoplasma detection kit:

2.1.1 可作50～100 reactions.

2.1.2 提供1st stage primer mixture與2nd stage primer mixture

2.1.3 positive control DNA (A. laidlawii ; M. pirum)

2.2 PCR reagents :

2.2.1 Taq polymerase ( 5 U / ul )

2.2.2 dNTP( dGTP, dCTP, dTTP, dATP, 1.25 mM each )

2.2.3 10x PCR buffer (with 1.5mM MgCl2)

2.2.4 25mM MgCl2

2.2.5 sterile ddH2O

2.3 Machine / Equipment :

2.3.1 PCR thermal cycler

2.3.2 agarose電泳設備

2.3.3 DNA電泳膠體觀察設備

2.3.4 手套

2.3.5 無菌PCR反應管

2.3.6 無菌1.5 ml微量離心管

2.3.7 無菌2ul, 20ul, 200ul, 1000ul Tips/ Pipetmans

方法：

此PCR反應是一種nested PCR，包括2階段PCR反應，1 st stage PCR結束後，取其反應物作2nd stage PCR，然後取2 nd PCR產物作agarose gel electrophoresis，依DNA band之有無及片段大小來分析結果。

3.1 1st stage PCR reaction（total volume 25 ul）：

3.1.1 測試樣品 ( 2 ul / each )

3.1.1.1 直接取樣測試細胞之培養液。

3.1.1.2 Positive control : mycoplasma DNA ( A. laidlawii ; M. pirum )

3.1.1.3 Negative control : ddH2O

3.1.2 Reaction mixture ( 23 ul / each )

3.1.2.1 10x PCR buffer (含1.5 mM MgCl2 ) 2.5 ul

3.1.2.2 1st stage primer mixture 0.5 ul

3.1.2.3 dNTP ( 1.25 mM each ) 1.0 l

3.1.2.4 MgCl2 ( 25 mM ) 0.5 ul

3.1.2.5 Taq DNA polymerase ( 5 U/ul ) 0.1 ul

3.1.2.6 ddH2O 18.4 ul

3.1.3 PCR program ( 1st PCR與2 nd PCR相同)：使用PCR thermal cycler

3.1.3.1 step 1 : denaturation: 94 ℃ 30 sec

3.1.3.2 step 2 : denaturation: 94 ℃ 30 sec

3.1.3.3 step 3 : annealing: 55 ℃ 2 min

3.1.3.4 step 4 : extension: 72 ℃ 2 min

3.1.3.5 重複3.1.3.2至3.1.3.4步驟30 cycles

3.1.3.6 step 5 : final extension 72 ℃ 5 min

3.2 2 nd stage PCR reaction（total volume 25 ul）

3.2.1 測試樣品：1st stage PCR product（1 ul / each）。

3.2.2 Reaction mixture ( 24 ul / each )

3.3.2.1 10x PCR buffer (含1.5 mM MgCl2 ) 2.5 ul

3.3.2.2 2 nd stage primer mixture 0.5 ul

3.3.2.3 dNTP ( 1.25 mM each ) 1.0 ul

3.3.2.4 MgCl2 ( 25 mM ) 0.5 ul

3.3.2.5 Taq DNA polymerase ( 5U/ul ) 0.1 ul

3.3.2.6 ddH2O 19.4 ul

3.2.3 PCR program同3.1.3；使用PCR thermal cycler

膠片電泳分析

4.1 膠片 (2.0%) 置備: 將2 g agarose溶於100 ml ( 1x ) TAE buffer。

4.2 電泳液：(1x) TAE buffer（Tris-acetate/EDTA electropheresis buffer）

4.3 選擇100~500 bp DNA size Marker：取100 bp ladder Marker 5 ul ( 25 ng/ul )

4.4 取10 ul 2 nd stage PCR產物分析，各加入2 ul ( 6x ) loading dye。

4.5 進行電泳分離100V, 25 min。

4.6 膠片染色：ethidium bromide染色10 min，H2O退染10mim。（EtBr為致癌物質，請戴手套並小心操作）

4.7 結果：使用UV light觀察，並照相記錄。

Figure 1 : Agarose gel electrophoresis of the 2nd -stage PCR Products from eight commonly encountered Mycoplasma and A. laidlawii Species. ( from ATCC mycoplasma detection kit)

Table 1 : Variations of restriction fragment lengths of the 16S-23S rRNA intergenic spacer regions of commonly encountered species of mycoplasma. (from ATCC mycoplasma detection kit)

* No restriction site

** When a polyacrylamide gel is used for the resolution of amplified DNA products, a double-band product with one bp difference may be observed for M. hominis. This feature can serve as a good indicator for differentiated M. hominis from M. arginini, which only produces a single-band DNA product.