黴漿菌之污染測試--DNA螢光染色法

利用螢光染劑（bisbenzimide, Hoechst 33258）偵測黴漿菌污染。此染劑會結合到 DNA 之 Adenosine-Thymidine (A-T) rich 區域，因為黴漿菌之 DNA 中 A-T 含量佔多數（55～80%），所以可將其染色而偵測。被黴漿菌污染之細胞經染色後，在細胞核外與細胞周圍可看到許多大小均一之螢光小點。

測試步驟用間接步驟，將待測細胞懸浮液或細胞培養液接種於指示細胞培養液中（indicator cell，例如 Vero cell or 3T6 cell），培養指示細胞後再作螢光染色。正負反應對照組亦可以接種於 indicator cell 內作為對照。

待測細胞亦可培養後直接作螢光染色，但需為吸附型細胞。若有些細胞易有螢光背景，而干擾結果判讀，則建議使用1.2之步驟。

樣品種類包括冷凍細胞、培養中之細胞、測試血清、培養基或其他細胞樣品等。 若為培養中之細胞，須至少三天以上未更換培養基。若為懸浮型細胞，可直接取樣細胞懸浮液。若為吸附型細胞，取樣前先吸除大部分培養基， 並刮下少許吸附之細胞與剩餘之 3~5 ml 培養基混合後，才進行取樣。

測試樣品應不含抗生素以避免影響測試結果。若測試樣品含有抗生素〈例如冷凍細胞或培養細胞〉，則將收集之細胞懸浮液以離心處理或再用不含抗生素之培養基洗滌 3 次， 以移除任何殘留之抗生素。

陽性反應：

除了細胞核會呈現藍色螢光外，在與細胞表面與細胞核外會出現藍色螢光小點或是絲狀點，其螢光點很小且形狀一致，與細胞核殘片染成之不規則之較大點狀物不同，且其螢光維持較久，可維持數星期。若仍無法判讀，可在 1000 倍顯微鏡下觀察以區分之。

陰性反應：

只出現細胞核之藍色螢光點，在細胞核外與細胞表面沒有藍色螢光小點或絲狀點

測試樣品之細胞懸浮液在接種至 Vero 細胞後，可能會發生凋亡〈apoptosis〉現象，而產生許多細胞核碎片干擾結果判讀。 若發生此狀況，必須有經驗之人員判讀。

若細胞固定步驟或染色後之洗滌步驟處理不好，則可能出現螢光背景，細胞質亦被

染色，而干擾結果判讀，可用無菌水洗滌數次，或靜置數日待螢光背景減弱後，再

觀察之。