Một dấu hiệu phân loại là bất kỳ đặc tính nào mà qua đó thành viên của một taxon này phân biệt hoặc có thế phân biệt với thành viên của một taxon khác 

Trong định nghĩa này có vài điều cần chú ý:

- Không phải bất kỳ đặc điểm nào của mỗi taxon cũng là dấu hiệu phân loại mà phải là đặc điểm có thể dùng để phân biệt với taxon khác, hoặc đế gộp chủng vào taxon có bậc cao hơn mới là dấu hiệu phân loại. Để phân biệt nhặng xanh (Chrysomya megacephala) với ruồi nhà (Musca domestica), nếu căn cứ vào đặc điểm của cánh (có 2 cánh do đôi cánh sau tiêu giảm thành nhú giữ thăng bằng) hoặc kiểu cấu tạo của phần phụ miệng (phần phụ miệng kiểu liếm) thì không phân biệt được 2 loài này, chúng không phải là dấu hiệu phân loại bậc loài. Nhưng nếu căn cứ vào màu sắc, chỉ nhặng xanh mới có màu xanh ánh kim mà ruồi nhà không có, hoặc căn cứ vào cấu trúc của cơ quan giao phối của ruồi nhà và của nhặng xanh khác nhau rõ rệt thì đó mới là các dấu hiệu phân loại để phân biệt 2 loài này. Tuy nhiên, ruồi nhà và nhặng xanh đều có 2 cánh nên chúng đều là thành viên của bộ côn trùng Hai cánh (Diptera). Hai cánh là dấu hiệu phân loại của taxon bậc bộ, nhờ dấu hiệu này mà chúng phân biệt với các bộ côn trùng khác có 4 cánh (2 đôi cánh).

- Đế sử dụng máy tính, trong phân loại số học, nhiều khi phải chuyển dấu hiệu phân loại thành các con số để so sánh. Do đó để nhất quán cần phân biệt dấu hiệu phân loại với cấu trúc mang dấu hiệu phân loại (signifier). Trong ví dụ trên, màu xanh ánh kim và không có màu xanh ánh kim, hai cánh và phần phụ miệng kiểu liếm là dấu hiệu phân loại chứ không phải màu sắc, cánh, phần phụ miệng, chúng là các thể mang dấu hiệu phân loại.

Có thể phân biệt các kiểu dấu hiệu phân loại sau (Mayr và Ashlock, 1991):

1.   Các dấu hiệu hình thái: a. Hình thái chung bên ngoài; b. Các cấu trúc riêng biệt đặc trưng cho từng nhóm động vật; c. Hình thái giải phẫu; d. Các giai đoạn phát triển của phôi; e. Nhân tế bào và các sai khác về tế bào học.

2.    Các dâu hiệu sinh lý: a. Các đặc điểm trao đổi chất; b. Các chất tiết của cơ thể; c. Các yếu tố di truyền bất thụ.

3.    Các dấu hiệu phân tử: a. Cách biệt miễn dịch; b. Sai khác điện di; c. Chuỗi axit amin và protein; d. Lai ADN; e. Chuỗi ADN và ARN; g. Phân tích enzym giới hạn trong nhân; h. Các sai khác phân tử khác.

4.    Các dấu hiệu tập tính: a. Ve vãn và các cơ chế tính tình cách ly khác; b. Các kiểu tập tính khác.

5.    Các dấu hiệu sinh thái: a. Chỗ ở và vật chù; b. Thức ăn; c. Biến dị theo mùa; d. Trùng ký sinh; e. Phản ứng của vật chủ.

6.    Các dấu hiệu địa lý: a. Các dấu hiệu địa lý sinh vật chung; b. Các quan hệ qua lại đồng hương và không đồng hương của các quần thể.

Ia. Dấu hiệu hình thái chung bên ngoài. 

Đây là loại dấu hiệu có ưu việt riêng nên thường được dùng đầu tiên. Đó là các dấu hiệu dễ xác định bằng mắt và các phương tiện kỹ thuật thông thường (lúp cầm tay, lúp hai mắt soi nổi, kính hiển vi), có thể tiến hành trên một số lượng lớn các cá thể, có thể so sánh trực tiếp dựa trên phân tích di vật mẫu lưu trữ trong sưu tập của bảo tàng. Với các mẫu hóa thạch, hình thái là dấu hiệu phân loại duy nhất có thể khai thác. Ví dụ, từ các phân tích về hình thái và kích thước của xương chân và của răng của các hóa thạch, đã có thể xây dựng được cây phát sinh của loài ngựa hiện đại cùng chiều hướng tiến hóa về hình thái và sinh học kể từ dạng tổ tiên bé nhỏ và gặm lá cây đầu tiên Hyracotherium (= Eohippus) sống cách nay hơn 55 triệu năm, hoặc từ phân tích bộ xương và dấu vết lông của hóa thạch chim cổ Archaeopteryx và các hóa thạch trung gian khác đã có thể thiết lập được nguồn gốc bò sát và các chiều hướng tiến hóa để có chim hiện đại.

Ib. Các cấu trúc riêng biệt. 

Trong từng nhóm động vật có thể có các cấu trúc riêng biệt có giá trị phân loại học cao để phân biệt các loài. Ví dụ, cơ quan giao phối của côn trùng, bầu nhận tinh của nhện đực ở đỉnh của chân xúc giác, lưỡi radula của ốc. 

Ic. Hình thái giải phẫu. 

Thường dùng để phân biệt các taxon bậc cao. Ví dụ, dùng 4 kiểu ống dẫn nước ascon, sycon, leucon và ragon để phân biệt các bộ thân lỗ (Spongia); dùng số lượng vách vị để phân biệt các phân lóp San hô tám ngăn (Octocorallia) và San hô sáu ngăn (Hexacorallia); dùng mức độ phát triển của ruột (không ruột, ruột thẳng, ruột nhiều nhánh, ruột ba nhánh) để phân biệt các bộ của lớp Sán lông với các tên gọi tuông ứng (Acoela, Rhabdocoela, Polyclada, Triclada) (Hình 2.3611); dùng vị trí tương đối của khoang áo (và cơ quan áo) với vị trí của khối nội quan để sắp xếp các bộ trong lóp thân mềm Chân bụng (Gastropoda) (Hình 2.36III); dùng cấu trúc các phần của hệ sinh dục để phân biệt 2 chi ốc cạn Helix và Achatina trong 2 họ tương ứng Helicidae và Achatinidae. 

Id. Các giai đoạn phát triển của phôi và hậu phôi. 

Có nhiều đặc điểm phát triển kể cả ờ giai đoạn phôi và hậu phôi đặc trưng cho các taxon động vật bậc cao. Ví dụ, Động vật nguyên khẩu (Protostomia) và Động vật hậu khẩu (Deuterostomia) khác nhau về đặc điểm phân cắt trứng, về cách hình thành thể xoang và về nơi hình thành lỗ miệng của con trưởng thành.

Nhiều nhóm động vật phát triển qua dạng ấu trùng đặc trưng của mình như ấu trùng amphiblastula của Thân lỗ đá vôi (Calcarea), ấu trùng Müller của sán lông Ruột nhiều nhánh (Polyclada) ở biển; ấu trùng trochophora của Giun nhiều tơ (Polychaeta) và ấu trùng nauplius của Giáp xác (Crustacea); các dạng ấu trùng khác nhau để phân biệt biến thái không hoàn toàn và biến thái hoàn toàn của các bộ Côn trùng (Insecta).

Ie. Nhân tế bào. 

Nhân tế bào của Nhân chuẩn chứa yếu tố di truyền đặc trưng cho từng loài sinh vật. Bình thường yếu tố di truyền tồn tại dưới dạng sợi kép rất mảnh nên không nhìn thấy được dưới kính hiển vi quang học, chỉ trước khi tế bào phân chia nguyên nhiễm sợi này mới co lại rất ngắn, dễ bắt màu với thuốc nhuộm, gọi là nhiễm sắc thể, bám vào các sợi vô nhiễm ở mặt phẳng xích đạo của tế bào trước khi tách đôi đế di chuyển về 2 cực của tế bào để hình thành nhân mới của tế bào con. Chỉ lúc bấy giờ ta mới thấy được nhiễm sắc thể dưới kính hiển vi quang học. số lượng và hình thái của nhiễm sắc thể đặc trưng cho từng loài sinh vật. Ví dụ tế bào của người (Homo sapiens) có 46 nhiễm sắc thể). 

Tuổi thọ, phổ thức ăn, phạm vi chịu đựng đổi thay của môi trường về nhiệt độ, độ ẩm, độ chiếu sáng và các yếu tố môi trường khác cũng đặc trưng cho từng loài sinh vật nhưng chi có thể đạt được chúng bằng đo đạc trên mẫu sống bằng các dụng cụ chuyên biệt, nên các nhà phân loại học thường chỉ dùng loại dẫn liệu này để có thêm cơ sờ lý giải một nghi vấn nào đó về phân loại học. Ví dụ các loài muỗi đồng hình trong tổ họp loài Anopheles macuỉipennỉs ở châu Âu tuy khó phân biệt về hình thái của muỗi trưởng thành nhưng khác nhau về môi trường sống của ấu trùng (nước đứng hay nước chảy, nước lạnh hay nước ấm, nước ngọt hay nước lợ) và về tập tính của trưởng thành (có ngủ đông hoặc không). 

 Các dấu hiệu phân tử là các dấu hiệu hóa sinh so sánh các phân tử lớn như protein, ADN, ARN thể hiện đặc điểm di truyền đặc trưng của mỗi loài. Các dẫn liệu phân tử không chỉ chuẩn xác hóa vị trí phân loại được xác định dựa trên các dấu hiệu khác mà còn giúp xác định quan hệ phát sinh của các loài và các nhóm loài, kể cả các nhóm loài đã phân ly hàng triệu năm trước. Ví dụ nhóm loài cây kiếm bạc (Dubautia sp. group) phân bố trên các đảo của quần đảo Hawai, có hình thái rất khác nhau, một số là cây cao có nhiều cành, số khác là cây bụi mọc sát mặt đất, tuy có vốn di truyền gần nhau biến đổi do lan tỏa thích ứng từ một loài đầu tiên bắt nguồn từ Bắc Mỹ (Cariquistia muirii). Chúng đều có tuổi không quá 5 triệu năm tương ứng với tuổi của các hòn đảo có nguồn gốc núi lửa. 

Trong các dẫn liệu phân tử được dùng rộng rãi hiện nay, phân tích và so sánh trình tự của ADN và ARN đã lý giải nhiều vấn đề phân loại học vi mô và vĩ mô. Các gen đã tiến hóa với tốc độ khác nhau ngay cả trong cùng một nhánh tiến hóa. ADN mã hóa cho rARN thay đổi tương đối chậm và do đó so sánh các trình tự ADN trong các gen này cho phép xác định các mối quan hệ giữa các taxon đã phân ly hàng trăm ưiệu năm trước. Chính trong các năm 1970 và năm 1990, nhờ so sánh trình tự của các gen rARN của nhiều tiền nhân, Carl Woese và cs. đã phát hiện có nhiều vi khuẩn có quan hệ họ hàng gần với Nhân chuẩn hơn là với các nhóm vi khuẩn anh em của mình và từ đó đề xuất bổ sung bậc siêu giới (với 3 taxon cổ khuẩn, Archaea; Vi khuẩn, Bacteria và Nhân chuẩn, Eukarya. Nghiên cứu về trình tự rARN cũng đã cho thấy Nấm có quan hệ với Động vật gần hơn với Thực vật.

Ngược lại ADN ty thể (mADN) tiến hóa tương đối nhanh nên có thể dùng để lý giải các hiện tượng tiến hóa gần đây. Ví dụ so sánh trình tự mADN của các nhóm thổ dân châu Mỹ chứng tỏ rằng người Pinna ở Arizona, người Maya ờ Mexico và người Yanomami ở Venezuela có họ hàng gần gũi, có lẽ là hậu duệ của những người đầu tiên trong số 3 làn sóng di cư qua cầu nối Behring từ châu Âu tới châu Mỹ khoảng 13.000 năm trước.

Ở một số nhóm động vật tập tính có đặc trưng loài rõ nét như hoạt động khoe mẽ của chim trống để hấp dẫn chim mái, cách xây tố của chim trước mùa ghép đôi, kiểu chăng lưới bắt mồi của nhện, chọn nguyên liệu xây tổ của ấu trùng bướm lông (Trichoptera) hay cấu trúc tổ sâu kèn của bướm ngài họ Psychidae,... Nhiều khi chỉ cần nghe tiếng chim hót, nghe tiếng vượn hú hoặc chỉ cần theo dõi nhịp phát sáng của đom đóm, hình ảnh âm đồ ếch nhái hoặc quan sát cấu trúc của tổ, ta đã có thể nhận biết chính xác chủ nhân của chúng hơn là quan sát chi tiết tùng đặc điểm hình thái của con trưởng thành. Tập tính thường thuộc nhóm dấu hiệu đầu tiên cách ly giữa các loài gần nhau nên là dấu hiệu quan trọng trong phân biệt các loài. Có ít tập tính đặc trưng cho các taxon bậc cao. Thuộc vào nhóm này có thể kể hoạt động “làm dáng” (rỉa lông, duỗi cánh, tắm rửa,...) ở chim, hoạt động chải lông (grooming movements) ở côn trùng. 

Trong tự nhiên, mỗi loài sinh vật đều có ổ sinh thái riêng và nhờ thế hạn chế sự cạnh tranh giữa các loài gần nhau. Ờ đồng bằng nước ta, giun quắn (Metaphire posthuma) và giun dài (Polypheretima elongata) là 2 loài gặp phổ biến nhưng chúng sống không cùng nơi, loài thứ nhất sống trong đất cát pha còn loài thứ hai sống trong đất thịt. Trong vùng biển của quần đảo Hawai sống cùng nhau 2 loài ốc Conus: c. ebraeus và c. chaldaeus. Chúng đều ăn giun nhiều tơ Nereis nhưng là 2 loài giun khác nhau. Hai loài ruồi quả Drosophila, D. mulleri và D. aldrichi cùng sống trong quả cây xương rồng Opuntia ỉindheimera đang phân hủy nhưng ưa thích các loài nấm men và vi khuẩn khác nhau. Trùng ký sinh cũng thường chuyên hóa theo vật chủ. Trong nhóm khỉ hình người, Pan và Gorilla (khỉ hình người châu Phi) có nhiều loài nội và ngoại ký sinh chung hơn với loài người {Homo) so với giữa chúng với đười ươi (Pongo), phù hợp với quan hệ thân thuộc đã được chứng minh bằng các dẫn liệu khác.

Các dấu hiệu sinh thái không chỉ giúp xét quan hệ thần thuộc bậc loài mà cả cho các taxon bậc cao. Các họ côn trùng thường có ổ sinh thái đặc trung chung cho nhiều vùng trên Trái Đất. Trong động vật có xương sống, dơi (bộ Chiroptera) và cá voi (bộ Cetacea) có vùng thích nghi riêng biệt trong lóp Thú.

Các miền địa lý sinh vật (Hình 2.49) có thể là vùng phân bố gốc thể hiện yếu tố phân bố của các taxon bậc cao. Các yếu tố này cần được hiểu trong lịch sử phát triển của các lục địa và đại dương trong lịch sử của Trái Đất với hội tụ và tách vỡ của các mảng lục địa kéo theo phân bố của vốn sinh vật trên đó. Ví dụ, giun đất sống gắn với nền đất nên hạn chế trong khả năng phát tán chủ động. Các họ giun đất có vùng phân bố gốc khóp với các miền địa lý sinh vật, ví dụ Lumbricidae có vùng phân bố gốc là Toàn Bắc, đại diện cho yếu tố Toàn Bắc của giun đất; Megascolecidae có vùng phân bố gốc là Đông Phương trong khi vùng phân bố gốc của Glossoscolecidae lại là Tân nhiệt đới. Khi phân tích tính chất của khu hệ giun đất của một vùng lãnh thổ nào đó, tên taxon bậc họ chứa đựng yếu tố địa lý mà nó đại diện giúp lý giải con đường xâm nhập của các loài trong họ đó. Đe giải quyết vấn đề này cần có các hiểu biết sơ đẳng về sự dịch chuyển của các mảng lục địa trong lịch sử của Trái Đất (Hình 2.50). Ví dụ, để hiểu về khu hệ giun đất của vùng Đông Phương không thể bỏ qua hiện tượng mảng Ấn Độ vốn là một mảnh của đại lục Gondwana tách khỏi châu Phi và trôi về phía bắc trước khi nhập với mảng Âu-Á như hiện nay (Hình 2.50C-D). Chính từ lịch sừ này mà Michaelsen (1922) đã sớm nhận xét về khu hệ giun đất Ấn Độ là có quan hệ gần với khu hệ giun đất của Châu Phi và Nam Mỹ hơn với giun đất của phần còn lại của châu Á.

Các dấu hiệu địa lý còn quan trọng trong cân nhắc vị trí của các taxon bậc thấp. Loài tồn tại dưới dạng quần thể. Nếu các quần thể của một loài có các sai khác về phân loại học do có vùng phân bố riêng trong vùng phân bố rộng hơn cùa loài sẽ được xếp thành các phân loài của một loài đa mẫu. Ngược lại, nếu là sai khác giữa các quần thể trong cùng một vùng phân bố thì có nhiều khả năng là các quần thể của hai loài khác nhau. Dấu hiệu địa lý do đó cũng rất quan trọng đối với phân loại các taxon bậc thấp.

Các dấu hiệu phân loại có trọng lượng khác nhau trong thực hành phân loại. Không ít trường hợp phân loại cho kết quả khác nhau dựa trên dấu hiệu phân loại được lựa chọn. Vậy dùng dấu hiệu nào thì cho kết quả phân loại chính xác? Thực ra câu trả lời chỉ có riêng cho từng nhóm sinh vật sau khi chuyên viên đã trải qua thực tiễn phân loại nhóm đó, tức là câu trả lời hậu suy. Tuy nhiên cũng có thể nêu một vài lưu ý chung.

Với taxon bậc loài, các dấu hiệu có giá trị phân loại cao là các dấu hiệu giúp cách ly hoặc loại trừ cạnh tranh với các loài gần gũi, ví như cấu trúc của cơ quan giao phối ở chân khớp; tiếng hót của chim, tiếng kêu của ve sầu, của dế; nhịp phát sáng của đom đóm; các điệu múa ve vãn tiền giao phối của chim, của cá, của côn trùng; các chất tiết có mùi đặc trưng loài của thú. Với các phân loài là vùng phân bố của các quần thể.

Với các bậc trên loài, là các dấu hiệu của cùng một tổ họp gen thể hiện bằng các đặc điểm chẩn loại của từng taxon. Ví dụ với ngành Động vật có dây sống là có dây sống, có thần kinh dạng ống phía lưng, có các đôi khe mang trên thành hầu, có rãnh nội tiêm hoặc tuyến giáp và có phần đuôi sau hậu môn; với lóp Côn trùng là cơ thể phân đốt mà các đốt tập trung thành 3 phần đầu, ngực và bụng, với phần ngực gồm 3 đốt và mối đốt mang một đôi chân; phát triển qua lột xác.

Thường thì các dấu hiệu có giá trị phân loại cao là các dấu hiệu hiện hữu kiên định ở một nhóm và thiếu vắng kiên định ở các nhóm gần gũi. Trong thực hành phần loại, các cân nhắc dựa trên càng nhiều loại dấu hiệu khác nhau càng có cơ may cho các kết quả gần với tự nhiên. Tuy nhiên thường thì các dấu hiệu hình thái được dùng đầu tiên do các ưu việt riêng của nó như đã nêu ở trên. Các dấu hiệu khác được dùng chọn lọc để kiểm tra các nghi vấn hoặc để bổ sung, do phải tiến hành trên mẫu sống hoặc phải có thêm các thực nghiệm.