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Llevaba el nombre de su abuela materna, Isabel I de Castilla, y su tía Isabel, princesa de Asturias, que había sido la primera esposa de su padre. En la línea genealógica de su padre, era nieta del infante Fernando, duque de Viseu (segundo hijo del rey Eduardo de Portugal y hermano del rey Alfonso V de Portugal), y de la infanta Beatriz, hija de Juan de Portugal (hermano del rey Eduardo). A través de su madre, era nieta de los Reyes católicos.

Forma parte de la cultura popular el deseo inquebrantable de Isabel de Portugal de casarse con su primo, el rey de Castilla y Aragón. Para Manuel I de Portugal, que se había casado con tres infantas españolas (las hijas de los Reyes Católicos y la hermana de Carlos V, Leonor) la alianza entre Portugal y España era imprescindible para poder continuar la exploración de los océanos sin incurrir en enfrentamientos con Castilla. Sin embargo, eran los castellanos, representados en las levantiscas Cortes que hicieron frente a Carlos y sus consejeros flamencos, los principales partidarios de que el rey se casase con su prima portuguesa. Es evidente que Castilla necesitaba más a Portugal que al revés: en el devenir constante de Europa, ahora que Carlos era soberano de tantos reinos, Castilla necesitaba aliados. Era menester que Portugal quedase bajo la órbita de Castilla y no de la Francia (como sucedió en la guerra civil castellana de 1474 a 1479). Que Portugal fuera aliado de Castilla implicaba tener las espaldas cubiertas en la Península y en ultramar. Portugal era la única potencia naval que podría cuestionar la supremacía de Castilla en el Atlántico. Era, además, el reino más rico de la Cristiandad. El consentimiento portugués había permitido que Castilla cimentase su posición en las Canarias y sobre territorios del Reino de Fez (Melilla y Cazaza) y su apoyo era necesario para combatir a los infieles en Berbería. En conclusión, la alianza con Portugal era garantía de paz y estabilidad.

Sin embargo, los consejeros flamencos de Carlos, en especial el señor de Chièvres, le convencieron de relegar la alianza portuguesa a un segundo plano y sustituirla por una alianza con Inglaterra. Los motivos por los que Leonor casó con el rey Manuel y Catalina (la hija póstuma de Felipe el Hermoso y hermana menor de Carlos V) con Juan III, hermano de Isabel, estuvieron ligados al compromiso de Carlos con su otra prima, María Tudor, hija de Enrique VIII de Inglaterra y Catalina de Aragón. El compromiso entre Carlos y María buscaba deshacer una alianza entre Inglaterra y Francia, articulada por el ambicioso cardenal Thomas Wolsey y basada en el matrimonio entre María Tudor y el Delfín. El bien del Sacro Imperio Romano Germánico, del que Carlos consiguió ser elegido emperador en 1520, primaba por encima del bien de España. En Portugal muchos entendieron el rechazo de Isabel y su sustitución por Leonor y Catalina como una ofensa. Fue sin duda una maniobra poco inteligente la de Chièvres. Casar a Carlos con la hija mayor del soberano más rico de Europa tenía muchas más ventajas que casarlo con la princesa María que era muy pequeña. Enrique VIII se encontraba alejado de la política europea; la influencia del poderoso Wolsey, que era poderoso en Inglaterra, mermaba y sus relaciones con Francisco I de Francia habían enturbiado su nombre. Por el contrario, la dote que aportaría Isabel solucionaría muchos de los problemas económicos de Carlos.

El matrimonio con la inglesa era inconcebible: la diferencia de edad dejaría las relaciones entre Inglaterra, España y el Imperio pendientes de un hilo y el heredero que necesitaba Carlos para consolidar su poder tardaría en demasía.

Matrimonio

En 1521 murió Manuel I y le sucedió su hijo Juan III el Piadoso. Las negociaciones entre los dos reinos de la Península Ibérica dieron como resultado una doble unión hispano-lusa. En 1522 se acordó el matrimonio entre Juan III y Catalina de Austria, hermana menor de Carlos I. Tres años después, en 1525, es su hermana Isabel la que se uniría a Carlos I, el 11 de marzo de 1526,​ teniendo ella 22 años y él 26. La boda se celebró en los Reales Alcázares de Sevilla, en el actual Salón de Embajadores.

Este acuerdo fue importante desde el punto de vista económico para la monarquía hispánica, ya que Isabel aportó una cuantiosa dote, 900.000 doblas de oro, mientras que Carlos otorgaba a su futura esposa todas las rentas del señorío de la ciudad de Alcaraz de La Mancha y la cercana villa de Albacete, así como en calidad de arras 300.000 doblas, para lo cual hubo de hipotecar las villas jienenses de Úbeda, Baeza y Andújar. A pesar de que el matrimonio se realizó por motivos políticos, se dice que fue una pareja feliz; el rey le fue fiel y estaba enamorado y la Reina le quería mucho (Carlos tuvo otros hijos, pero en su soltería y viudez)²​ y tras la muerte de Isabel, Carlos I no volvió a contraer matrimonio y estaba con frecuencia melancólico. Isabel era considerada una de las mujeres más bellas de su época,​ y como tal fue retratada por artistas como Tiziano o Leone Leoni.

El matrimonio tuvo cinco hijos, siendo el mayor, el futuro Felipe II de España, el único varón en sobrevivir a la niñez. Isabel de Portugal también sufrió dos abortos y no sobrevivió al segundo, ya que murió dando a luz un prematuro séptimo hijo en uno de los aposentos del toledano palacio de Fuensalida, lugar que hoy alberga la Presidencia del Gobierno de Castilla-La Mancha.

Otros títulos

• Felipe IV de Borgoña

• (como rey consorte de Castilla)

• Germana de Foix

• (como reina consorte de Aragón, Valencia, Mallorca, Navarra y condesa consorte de Barcelona)