http://www.dissland.com/catalog/292975.html
Автор: Шамина, Наталия Владимировна
Заглавие: Цикл реорганизации цитоскелета в делении растительной клетки
Справка об оригинале: Шамина, Наталия Владимировна. Цикл реорганизации цитоскелета в делении растительной клетки : диссертация ... доктора биологических наук : 03.00.25 Новосибирск, 2005 361 c. : 71 06-3/52
Физическое описание: 361 стр.
Выходные данные: Новосибирск, 2005
Содержание, Введение:
ОГЛАВЛЕНИЕ
Введение 8
Глава 1. Цитоскелет в делении растительной клетки. Обзор литературы 15
1.1. Микротрубочки и ассоциированные с ними белки 15
1.2. Цикл микротрубочкового цитоскелета в делении растительной клетки 21
1.2.1. Интерфазные кортикальные спирали 22
1.2.2. Препрофазный пучок микротрубочек 23
1.2.3. Перинуклеарная система микротрубочек. Профазное веретено. 25
1.2.4. Веретено деления. 26
1.2.5. Система фибрилл фрагмопласта 29
1.3. Актиновый цитоскелет растительной клетки 32
1.4. Центры организации микротрубочек (ЦОМТ) и регуляция
перестроек цитоскелета в ходе деления растительной клетки 34
1.5. Цитоскелет и пространственная организация клетки 38
1.6. Цикл цитоскелета в мейотическом делении у высших растений 39
1.7. Мутации, затрагивающие цитоскелетный цикл у высших растений 41
1.7.1. Мутации, нарушающие структуру интерфазного цитоскелета 42
1.7.2. Мутации, нарушающие формирование препрофазного пучка 43
1.7.3. Мутации, нарушающие формирование веретена деления 43
1.7.4. Мутации, нарушающие цитоскелетные структуры цитокинеза 45
1.8. Аномалии цитоскелета в мейозе у отдаленных гибридов 46
1.9. Аномалии цитоскелета, вызываемые специфическими ингибиторами 48
1.10. Регуляция цикла деления у высших растений 50
1.11. Механизмы мейотической реституции 53
1.11.1. Мейотическая реституция у видов однодольных растений 53
1.11.2. Мейотическая реституция у видов двудольных растений 55
Глава 2. Материал и методы 57
2.1. Использованный материал 57
2.1.1. Виды однодольных растений 59
2.1.2. Виды двудольных растений 59
2.2. Методы исследования 63
2.2.1. Иммуноокрашивание микротрубочкового цитоскелета
и визуализация хромосом 66
2.2.2. Метод электронной микроскопии 66
2.2.3. Визуализация МТ цитоскелета классическими методами 67
3
Глава 3. Динамика цитоскелета в мейотической профазе 68
3.1. Динамика цитоскелета на стадии профазы в норме 68
3.1.1. Деполимеризация цитоскелета в профазе 68
3.1.2. Консервация цитоскелета в профазе. 69
3.1.3. Деполимеризация цитоскелета с последующим
формированием перинуклеарного кольца 75
3.1.4. Смешанные фенотипы, промежуточные между вышеописанными 75
3.1.5. Динамика цитоскелета в профазе II у видов двудольных растений 78 3.2.Аномалии построения перинуклеарного кольца МТ 81
3.2.1. Блок перестройки радиального цитоскелета в перинуклеарное кольцо МТ 81
3.2.2. Автономное кольцо МТ при ацентрическом положении ядра 85
3.2.3. Прямой пучок МТ вместо перинуклеарного кольца в профазе 85
3.2.4. Общее цитоскелетное кольцо в многоядерных МКП у видов однодольных 86
3.2.5. Слияние перинуклеарных колец 87
3.2.6. Формирование перинуклеарной системы цитоскелета в профазе
в отсутствие ядерной оболочки 90
3.3. Цитоскелет в мейотической профазе. Обсуждение. 90
3.4. Заключение к главе 3 99 Глава 4. Динамика цитоскелета в прометафазе. Построение
анастрального веретена деления 100
4.1. Ранняя прометафаза 100
4.1.1 .Динамика цитоскелета в норме 100
4.1.2. Аномалии ранней прометафазы 105
4.1.2.1. Нарушение разборки перинуклеарного кольца МТ 105
4.1.2.2. Нарушение перемещения МТ кольца в зону бывшего ядра 105
4.1.2.3. Кольцевые и спиральные веретена 108 4Л.2.4. С-образные веретена 108
4.1.2.5. S-образные веретена 113
4.1.2.6. Комбинированные веретена 114
4.1.3. Процессы ранней прометафазы. Обсуждение 116 4.2.Средняя прометафаза (стадия хаотичных пучков) 120 4.2.1.Динамика цитоскелета в норме 123 4.2.2. Аномалии средней прометафазы 123 4.2.2.1. Нарушение формирования кинетохорных фибрилл веретена 123
4
4.2.2.2. Нарушение формирования центральных фибрилл веретена 125
4.2.2.3. Одновременное нарушение формирования кинетохорных и центральных фибрилл веретена 128
4.2.3. Процессы средней прометафазы. Обсуждение 129
4.2.3.1. Значение хаотической стадии 129
4.2.3.2. Феномен монополярного веретена у высших растений 130
4.2.3.3. Хаотическая стадия прометафазы и теория
«гибкой центросомы» Д. Мэзия 134
4.3. Поздняя прометафаза. Формирование биполярного веретена 136
4.3.1. Динамика цитоскелета в норме 136
4.3.2. Аномалии поздней прометафазы 138
4.3.2.1. Нарушение биполярной ориентации фибрилл веретена 138
4.3.2.2. Нарушение коориентации фибрилл веретена 142
4.3.2.3. Нарушение консолидации веретена деления 148
4.3.2.4. Нарушение конвергенции фибрилл на полюсах веретена 152
4.3.3. Формирование метафазной пластинки 153
4.3.4.. Процессы поздней прометафазы. Обсуждение 154
4.3.4.1. Биполярная ориентация биполярных фибрилл. 154
4.3.4.2. Коориентация фибрилл веретена 1,58
4.3.4.3. Консолидация фибрилл веретена в единую структуру цитоскелета 159
4.3.4.4. Конвергенция микротрубочковых пучков на полюсах веретена 161
4.4. Формирование анастрального мейотического веретена
у высших растений. Заключение 162
4.4.1. Ранняя прометафаза. Завершение реориентации микротрубочек 163
4.4.2. Средняя прометафаза . Формирование биполярных фибрилл веретена 164
4.4.3. Поздняя прометафаза. Формирование биполярного веретена 165 Глава 5. Динамика цитоскелета в телофазе. Формирование
фрагмопласта и цитокинез 167 5.1. Микротрубочковый цитоскелет в телофазе I мейоза у двудольных видов 167
5.1.1. Нормальный процесс перестроек цитоскелета в телофазе I 167
5.1.2. Аномалии формирования системы интерзональных фибрилл
в телофазе I в МКП у видов двудольных растений 170
5.1.2.1.Нарушение соединения (+)-концов МТ пучков 170
5.1.2.2. Недоформирование интерзональной системы МТ 170
5
5.1.2.3. Преждевременный цитокинез в мейозе у видов двудольных 172
5.2. Динамика цитоскелета в ТИ в одновременном цитокинезе 175
5.2.1. Цитоскелет в телофазе II мейоза дикого типа 175
5.2.2. Аномалии цитоскелета в ТИ в одновременном цитокинезе 176 w 5.2.2.1. Нарушения пространственной организации одновременного
цитокинеза при дезинтеграции веретен во втором мейотическом делении 176
5.2.2.2. Дезориентация веретен во втором делении мейоза 178
5.3. Цитоскелет в мейотической телофазе у двудольных видов.
Механизмы одновременного (симультанного) цитокинеза.
Обсуждение 178
5.4. Динамика цитоскелета в ходе телофазы I мейоза у видов
однодольных растений 181
5.4.1. Ход нормальной телофазы в МКП у видов однодольных растений 181
5.4.2. Аномалии телофазы I и цитокинеза в мейозе у видов
ф однодольных растений 185
5.4.2.1. Динамика фрагмопласта в отсутствие клеточной пластинки 185 5.4.2.2.«Чрезмерный» цитокинез при блоке формирования
дочерних клеточных мембран 188
5.4.2.3. S-образный фрагмопласт 190
5.4.2.4. Фрагмопласт в фенотипе «комета» 193 5.4.2.5.Нарушение центробежного движения фрагмопласта 194 5.4.2.6.«Рваные» диады: блок отключения синтеза пластосом 196 5.4.2.7.Неполный цитокинез 197 5.4.2.8.«Туннельный» цитокинез 200 5.4.2.Э.Цитокинез в отсутствие фрагмопласта 201 5.4.2.10.Добавочный (или преждевременный) цитокинез 203 5.4.2.11.Разомкнутый фрагмопласт 204 5.4.3.Цитоскелет в телофазе мейоза у видов однодольных растений.
Обсуждение 204 5.5.Морфологические механизмы последовательного
цитокинеза. Модель центробежного движения фрагмопласта 205
б.б.Симультанный и консеквентный цитокинез в сравнении 207 щ
5.7.Временная регуляция процессов цитокинеза в мейозе высших растений 209
5.8. Заключение к главе 5 215
6
Глава 6. Переход от фрагмопласта к интерфазному радиальному
цитоскелету 217
6.1.Динамика цитоскелета по окончании телофазы в мейозе
у видов однодольных растений 217 6.2.Переход к интерфазному цитоскелету в мейозе
у видов двудольных растений 219
б.З.Аномалии перехода к интерфазному цитоскелету 220
6.3.1.Консервация фрагмопласта 220
6.3.2.Нарушение разделения фрагмопласта 222 б.З.З.Нарушение формирования цитоскелетной системы в интеркинезе
мейоза у видов двудольных растений 223
б.ЗАПереход к интерфазному цитоскелету в отсутствие фрагмопласта 223 6.4. Переход от фрагмопласта к радиальному
интерфазному цитоскелету. Обсуждение 224
•# 6.5. Заключение 226
Глава 7. Цитоскелет и мейотическая реституция 227 7.1.Аномалии цитоскелета, приводящие к реституции ядер в мейозе
у видов однодольных растений 227 7.1.1.Множественные нарушения клеточного деления, вызывающие
формирование реституционных ядер в одном фенотипе 227 7.1.2.Аномалии прометафазы I, ведущие к формированию
реституционых ядер 233 ^ 7.2.Аномалии цитоскелета, приводящие к реституции ядер
в мейозе у видов двудольных растений 236 7.2.1.Нарушение формирования интерзональной системы микротрубочек
в мейозе у мутанта ps сахарной свеклы 236
7.2.2. Аномалии цитоскелета, приводящие к реституционному процессу
в мейозе у гаплоидов Brassica juncea 238
7.2.3. Формирование слившихся веретен (fused spindles) в мейозе
у картофеля (S. tuberosum) и томата (L. esculentum) 239
7.2.3.1. Сближение дочерних ядер в профазе II 239
7.2.3.2. Слияние перинуклеарных колец в профазе II 240
7.2.3.3. Сближение хаотичных фигур цитоскелета в прометафазе II 241 7.3. Механизмы реституции, общие для видов однодольных и двудольных 241
7
7.4. Цитоскелетные механизмы реституции ядер. Обсуждение 242
7.4.1. Механизмы мейотической реституции, общие для видов
однодольных и двудольных растений 243
7.4.2. Механизмы мейотической реституции, характерные исключительно для видов однодольных растений с последовательным цитокинезом 244
7.4.3. Механизмы мейотической реституции, характерные исключительно для видов двудольных растений с одновременным цитокинезом 244
7.4.4. Сводный обзор цитоскелетных механизмов мейотической
реституции, описанных в настоящей работе 246
Глава 8. Динамика МТ цитоскелета в ходе деления растительной клетки на
примере мейоза. Заключение и перспективы 249
8.1.Сводная схема динамики микротрубочкового цитоскелета в мейозе у высших
растений 249
8.2. Основные процессы цитоскелетного цикла в ходе мейотического деления у
ВВЕДЕНИЕ
Цитоскелет - внутриклеточная филаментная цитоплазматическая структура, гораздо более подвижная и динамичная, чем можно заключить из ее названия. Среди функций цитоскелета - определение формы клетки и расположения в ней ядра и органелл, внутриклеточный транспорт, сегрегация хромосом (кариокинез), разделение цитоплазмы с автономизацией дочерних геномов (цитокинез), обеспечение дифференцировки клеток и тканей, формирование клеточной стенки у растений, удлинение растительной клетки. Все многообразие этих функций осуществляется цитоскелетными системами, весьма различными по морфологии и внутриклеточной локализации. Цитоскелет растительной клетки представлен, в основном, двумя составляющими: тубулиновыми микротрубочками (МТ) и актиновыми микрофиламентами (МФ).
Фундаментальным биологическим процессом, осуществляемым цитоскелетом, является деление клетки. Для его выполнения цитоскелет проходит собственный цикл, принимая различные конфигурации соответственно различным своим функциям на каждой стадии деления. Эти конфигурации называются системными структурами цитоскелета. Растительная клетка отличается от животной особенным многообразием цитоскелетных структур, сменяющих друг друга в ходе клеточного деления. Это кортикальные спирали, радиальные пучки, препрофазное кольцо, веретено деления и фрагмопласт (Goddard et al., 1994). В делении растительной, да и любой эукариотной, клетки основная роль принадлежит микротрубочковому цитоскелету (Baluska et al., 2004). Актиновые микрофиламенты колокализуются с микротрубочковыми пучками в составе основных цитоскелетных структур, но их функция в них не ясна, поскольку ингибиторы актина не нарушают деления растительной клетки (Staiger, Schliwa, 1987).
В клетках животных и низших эукариот выделяется специальная морфологическая структура, регулирующая процессы динамики цитоскелета в митозе и называемая центросомой, клеточным центром, полюсным организатором веретена. Концепция центросомы как ключевого фактора в регуляции основных морфологических процессов клеточного деления была предложена еще Бовери (Boveri, 1901) и активно поддержана Мэзия (Mazia, 1984). Мэзия предложил для эукариотной клетки теорию «гибкой центросомы» как совокупности мелких микрорубочко-организующих частиц, соединенных между собой линейно
9
гипотетической лентообразной структурой. Изменение конформации этой структуры и определяет, по мнению Мэзия, переход от одной цитоскелетной структуры к другой. Мэзия полагал также, что обнаружение такой центросомы в растительной клетке - дело будущего и целиком зависит от развития цитологических методов ^ анализа (Mazia, 1987).
Существует противоположная точка зрения на морфологическую регуляцию цикла цитоскелета в делении растительной клетки: самосборка стабильных микротрубочковых пучков в различные конфигурации посредством активности белков, ассоциированных с микротрубочками (Smirnova, Bajer, 1998). Центросома как компонента растительной клетки этой моделью не рассматривается.
Согласно современным представлениям, для регуляции динамики цитоскелета необходимы специальные морфологические структуры: центры организации микротрубочек (ЦОМТ), - служащие в качестве «затравки» для
Ф полимеризации микротрубочек. В животных клетках и клетках низших эукариот ЦОМТ входят в состав центросомы, которая и регулирует динамику цитоскелета. В клетках высших растений ЦОМТ сгруппированы на поверхности ядерной оболочки (Lambert, 1995). Совершенно не ясно, как регулируется динамика цитоскелета на тех стадиях деления растительной клетки, где ядерная оболочка отсутствует, а также в зонах цитоплазмы, удаленных от ядра. Механизмы, регулирующие перестройки цитоскелета в делении растительной клетки, представляют собой важнейшую нерешенную проблему клеточной биологии (Mazia, 1987; Marc, 1997; Baluska et al.,
^ 1998).
Поскольку современные методы цитологического анализа не позволяют визуализировать центросомные структуры в растительной клетке и сделать выбор между гипотезой гибкой центросомы и гипотезой самосборки, актуальной является вполне выполнимая задача: детально изучить процесс динамики цитоскелета в ходе клеточного деления как таковой и представить его в качестве непрерывного и полного процесса перехода из одной конфигурации в другую. Для решения этой задачи мы разработали эффективный подход, заключающийся в изучении возможно большего количества аномалий цитоскелетного цикла в делении растительной клетки.
™ Морфологический анализ аномальных клеточных процессов - весьма
информативный подход к решению разнообразных задач клеточной биологии. К
10
сожалению, до сих пор использование морфологических аномалий в цитологическом анализе ограничивалось лишь несколькими аспектами. Первый из них - анализ фенотипа различных мутаций с целью установить первичный морфологический эффект соответствующего гена и произвести генетическую диссекцию изучаемого процесса (см. обзоры Staiger, Cande 1993; Hoyt, Geiser, 1996). Второй аспект -изучение тех клеточных аномалий, которые приводят к биологически значимым последствиям, например, к формированию нередуцированных гамет в мейозе или к апомиксису (в числе прочих см. Werner, Peloquin, 1991; Qu, Vorsa, 1999). Третий аспект применения клеточных аномалий для решения цитологических задач -анализ последствий воздействия на клетку специфических ингибиторов изучаемого процесса или структуры с целью определения роли или функции последних ,-предмет экспериментальной клеточной биологии (McCurdy et al., 1991; Karyophyllis et al., 1997; Binarova et al., 1998a;).
Однако мы убедились, что анализ аномалий самих по себе, безотносительно их генетической подоплеки, биологической или физиологической значимости является также весьма информативным подходом к изучению процессов внутриклеточных преобразований на уровне морфологических структур. Особенно эффективен этот подход для изучения клеточного деления и дифференцировки. Блокируя, замедляя или искажая ход клеточного процесса, аномалии обнаруживают его детали, скрытые в норме. Полностью нарушая или искажая взаимодействие клеточных структур, аномалии обнаруживают их роль в этом взаимодействии и в изучаемом процессе. Такой подход будет тем более успешным, чем большее количество аномалии используется в анализе. Заранее предсказать, какую именно новую информацию удастся получить в результате такого анализа, невозможно. Может быть, поэтому этот подход до сих пор не используется в изучении структурного аспекта внутриклеточных процессов. Тем не менее, он имеет ряд существенных достоинств, главные из которых - высокая эффективность, методическая простота, а также возможность получить информацию, недоступную для других цитологических методов исследования. Мы назвали этот подход морфологической диссекцией.
Прекрасной моделью для изучения деталей и промежуточных этапов динамики микротрубочкового цитоскелета посредством морфологической диссекции является мейотическое деление в материнских клетках пыльцы (МКП). Мейоциты крупны (десятки микрон в диаметре), многочисленны, синхронизованы по стадиям
11
деления, лишены клеточной стенки. А главное, разнообразные аномалии мужского мейоза у растений легко доступны, то есть могут быть получены в достаточно большом количестве. Нарушениями мейотического деления характеризуются отдаленные гибриды, аллоплазматические линии, гаплоиды, полиплоиды, анеуплоиды и, конечно же, обширная коллекция мейотических мутантов, известная у высших растений (Kaul, 1988).
Правомерен ли выбор мейотического деления, которое является специализированным, в качестве модели для изучения деления растительной клетки вообще, и перенос полученных результатов на митотическое деление? Механизм динамики цитоскелета в отсутствие морфологически идентифицируемых центросомальных структур является важнейшей нерешенной проблемой клеточной биологии. Результаты такого исследования, полученные на любом виде делящихся бесцентриолярных клеток, вскрывают прежде всего общие принципы «цикла цитоскелета без центросом» и имеют соответствующее теоретическое значение. Поэтому выбор модели в данном случае диктуется прежде всего ее информативностью. Кроме того, цикл цитоскелета в ходе мейотического деления в МКП практически не отличается от такового в митотическом делении бесстеночных клеток, например, эндосперма - классической модели для изучения цикла цитоскелета в делении растительной клетки (Smirnova, Bajer, 1998). Морфологическими элементами цитоскелета, организующимися в цитоскелетные структуры и выявляемыми на световом уровне классическими методами визуализации цитоскелета, являются пучки МТ в комплексе с МФ или без них.
Многие промежуточные стадии цитоскелетного цикла для растительной клетки до сих пор не описаны. Анализ характера этих переходов сделает возможным выявить их закономерности и способ регуляции на морфологическом уровне. Полученная информация такого рода представляет собой важный материал для проверки и дальнейшей разработки теории центросомы и клеточного центра эукариотной клетки.
Цель и задачи исследования. Целью настоящей работы было поставлено выяснение морфологических механизмов регуляции цикла морфологических структур цитоскелета в делящейся растительной клетке в отсутствие идентифицируемой центросомы. Конечной целью было построение модели
12
регуляции динамики микротрубочкового цитоскелета в растительной клетке на морфологическом уровне на основании полученных данных.
Для выполнения этой цели были поставлены конкретные задачи:
1. Представить цикл динамики цитоскелета в делящейся растительной клетке в виде непрерывного процесса морфологических преобразований со всеми переходными стадиями.
2. Создать модель для изучения мофологических процессов динамики микротрубочкового цитоскелета в ходе деления растительной клетки.
3. Создать обширную коллекцию аномалий различной этиологии по мобильным стадиям мейотического деления у различных видов однодольных и двудольных растений.
4. Разработать варианты методов визуализации микротрубочкового цитоскелета -как классических так и иммуноокрашивания,- оптимальных для работы с материнскими клетками пыльцы и адекватных поставленным задачам.
'ф 5. Провести детальный цитологический анализ динамики цитоскелета в мейозе у всех аномальных форм для выявления составляющих событий и характеристик этого процесса.
6. Сравнить цикл цитоскелета в мейозе у видов с последовательным и одновременным цитокинезом.
7. Провести анализ цикла цитоскелета в мейозе фертильных отдаленных гибридов первого поколения и прочих форм - продуцентов нередуцированных гамет - для выяснения цитоскелетных механизмов мейотической реституции.
8. Составить каталог аномалии веретена деления растительной клетки. 9.Составить аналог аномалий цитокинеза растительной клетки.
10. Составить каталог механизмов мейотической реституции.
11. Составить диагностикум аномалий растительного мейоза по его продуктам
Научная новизна и практическая ценность работы. В результате проведенных в настоящей работе исследований внесен существенный вклад в решение важной проблемы клеточной биологии: морфологической регуляции перестроек цитоскелета в ходе деления бесцентриолярной клетки. Представленные к защите результаты и выводы оригинальны и получены впервые.
Разработан и успешно применен новый подход к цитологическому изучению процессов внутриклеточных морфологических преобразований: морфологическая
13
диссекция, представляющий собой сравнительный анализ возможно большего числа аномалий изучаемого процесса с целью выявления его неизвестных переходных стадий и характеристик. Цитоскелетный цикл в делящейся растительной клетке впервые представлен в виде полного, непрерывного и замкнутого процесса внутриклеточных морфологических преобразований. В том числе впервые описан ход перестроек цитоскелета в профазе и формирование перинуклеарного цитоскелетного кольца. Впервые описана стадия ранней прометафазы как вход цитоскелета в зону бывшего ядра. Впервые выявлены главные морфологические процессы средней прометафазы: формирование биполярных фибрилл веретена.выявлены новые механизмы реорганизации цитоскелета, участвующие в формировании биполярного веретена в поздней прометафазе. Впервые описан механизм формирования подвижного фрагмопласта в мейозе у однодольных видов и предложена модель его центробежного движения. Предложена модель временной регуляции цитокинеза. Впервые проведено сравнение циклов цитоскелета в мейозе '• с последовательным и одновременным цитокинезом и показано отсутствие принципиальных различий между ними. Выявлены новые механизмы цитоскелетного цикла: перемещение стабильных элементов цитоскелета, изменение их профиля и консолидация в единую структуру. Внесен существенный вклад в понимание морфологических механизмов регуляции цикла цитоскелета в делении растительной клетки в пользу гипотезы самосборки.
Практическая ценность настоящей работы заключается в том, что полученное цельное представление о морфологических механизмах мобильных стадий мейотического деления позволит приблизиться к решению таких проблем селекции, как естественная полиплоидизация, преодоление стерильности отдаленных гибридов первого поколения и апомиксис. Описаны 26 новых аномалий анастрального веретена в дополнение к 4, известным ранее в литературе, а также 23 аномалии цитокинеза. Впервые описаны 18 цитоскелетных механизма мейотической реституции у однодольных и двудольных видов. Разработан диагностикум аномалий растительного мейоза по его продуктам. Составленные каталоги представляют ценность при анализе морфологического фенотипа мейотических мутаций, особенно у таких сложных для цитологического анализа объектов, как арабидопсис. Полученные знания о цитоскелетном цикле в делении растительной клетки могут быть использованы при чтении университетского курса
14
лекций по цитологии и клеточной биологии. Результаты настоящей работы используются для чтения лекций по курсу цитогенетики в Санкт-Петербургском и Новосибирском Государственных университетах и в Университете Джапура (Индия).'
Апробация работы. Материалы диссертации были представлены на III Всесоюзной конференции «Генетика и цитология мейоза» (Новосибирск, 1990), на международном совещании «Fidelity of chromosome transmission and mitosis" (Ленинград, 1990), на 5-м Международном Когрессе по клеточной биологии (1992, Мадрид), на Съездах ВОГИС 1992 и 1994 гг, на 4-м Европейском Конгрессе по клеточной биологии (1994, Прага), на Гордоновской конференции «Meiosis» (1996, США), на международном симпозиуме "Plant Cytoskeleton: A Key for Biotechnology" (Ялта, 1998), на открытом семинаре Вагенингенского университета (Нидерланды, май 2001), на Московском Межинститутском семинаре по клеточной биологии (2 апреля 2003 г.), на Международном Сипмозиуме по проблемам мейоза (Санкт-Петербург, октябрь 2003), на I Съезде клеточных биологов (Санкт-Петербург, октябрь 2003), а также на отчетных сессиях Института цитологии и генетики СО РАН. Публикации по теме работы. По теме работы опубликовано 36 статей в рецензируемых отечественных и зарубежных журналах.
Структура и объем работы. Диссертация включает введение, обзор литературы, 7 глав результатов исследований и их обсуждения, заключение и перспективы, выводы, список цитируемой литературы и приложение, состоящее, в свою очередь, из 4 глав. Работа изложена на 360 страницах машинописного текста, включая 45 схем, 10 таблиц и 36 сводных рисунков, содержащих 453 микрофотографии.
Автор выражает глубокую искреннюю благодарность коллегам-растениеводам - создателям коллекций интереснейшего материала, послужившего источником нового знания о механизмах деления растительной клетки: A.M. Орловой, Г.М. Серюкову, Е.Г. Серюковой, А.И. Щаповой, Н.П. Гончарову, Н.М. Ковалевой, A.C. Машненкову, И.Н. Голубовской, СП. Соснихиной, А.Н. Жаркову, С.Ф. Ковалю, А.А.Козловой, Э.Р. Забировой, O.A. Шацкой, СИ. Малецкому, С.Г. Вепреву, Е.В. Дейнеко, P.O. Давояну, И.М. Бебякиной, СВ. Зеленцову, Я. Кестерсу, М. Раманне, К. Хейтинг, X. де Йонгу, X. ван Экку, Д. Хайхену, Р. Хеттену, К. Бутелье, К. Коничелле,
П. де Мело.
15 Глава 1. Цитоскелет в делении растительной клетки. Обзор литературы
Цитоскелет растительной клетки играет ключевую роль в таких фундаментальных биологических процессах, как клеточное деление, клеточный рост, а также морфогенез, органогенез и развитие растения (см. обзор: Васильев, 1996а). Поскольку растительная клетка лишена возможности изменять свою форму и расположение в ходе развития организма из-за наличия жесткой клеточной стенки, основным механизмом растительного органо- и морфогенеза оказывается пространственная ориентация клеточных делений, определяемая цитоскелетом. Необычайно важным этот процесс является для развития растительного эмбриона, поскольку начальное направление клеточных делений определяет поляризацию эмбриона и тип ткани, развивающейся из каждой дочерней клетки.
Кардинальная роль цитоскелета буквально во всех аспектах жизнедеятельности растительной клетки и растения в целом объясняет повышенный интерес к этой структуре, особенно усилившийся в последние годы.
1.1. Микротрубочки и ассоциированные с ними белки (MAP)
Цитоскелет растительной клетки представляет собой совокупность микротрубочек и актиновых микрофиламентов. Микротрубочки (МТ) были открыты методом электронной микроскопии (Ledbetter, Porter, 1963), и последовавшие затем интенсивные исследования показали, что они являются обязательным компонентом любой эукариотной клетки. Для выполнения внутриклеточных функций микротрубочки объединяются в пучки, взаимодействуя латерально. Эти пучки организуются в различные цитоскелетные структуры, причем толщина МТ пучков (количество микротрубочек в каждом из них) является характеристикой каждой структуры и зависит от ее функции. Так, сегрегация хромосом осуществляется МТ пучками веретена деления, которые содержат гораздо больше микротрубочек каждый, чем, например, МТ пучки интерфазного цитоскелета. Фиксация альдегидами (формалин, глутаральдегид), сохраняющая микротрубочки, позволяет наблюдать наиболее толстые пучки МТ в световой микроскоп при классических цитологических методах окрашивания. Такие пучки были описаны еще в конце 19 века как «ахроматиновый аппарат веретена» и «фибриллы фрагмопласта» (Wilson, 1928). Тонкие пучки интерфазного
16
цитоскелета также визуализируются на световом уровне при альдегидной фиксации, но уже иммуноокрашиванием с применением флуоресцеинов (см. обзор Lloyd, 1987).
Микротрубочки (МТ) представляют собой полый цилиндр 250А в диаметре, состоящий из гетеродимеров белков а- и ?— тубулина, организованных в 13 протофиламентов, которые соединяются латерально и составляют стенки цилиндра (см. обзор Avila, 1990). Микротрубочки являются весьма динамичными органеллами со временем полужизни (в растительных клетках) порядка одной минуты (Hush et al., 1994). Микротрубочки удлиняются за счет присоединения гетеродимеров тубулина на концах цилиндра, причем скорость присоединения на одном из концов («+»-конец) в несколько раз выше, чем на другом («-« конец) (Mitchison, 1992). МТ могут также спонтанно деполимеризоваться, теряя димеры тубулина с (+)- или (-)-конца. Совокупность этих явлений называется динамической нестабильностью (Cassimeris, 1993; Desai, Mitchison, 1997). Это свойство позволяет микротрубочкам после выполнения необходимых функций быстро деполимеризоваться и затем быстро восстанавливаться в новой локализации для выполнения иных функций.
МТ являются поляризованными структурами, что имеет огромное значение для широкого спектра выполняемых ими задач. Эта полярность обеспечивается асимметричным строением гетеродимеров а- и ?-тубулина и их соединением по типу «голова к хвосту» в процессе полимеризации протофиламентов, из которых состоят микротрубочки (Derksen et al., 1990). Поляризованность МТ обеспечивает такую их важнейшую функцию, как направленный внутриклеточный транспорт (например, транспорт везикул при экзоцитозе или хромосом к полюсам веретена). Поляризованность микротрубочек играет также важнейшую роль в процессах их взаимных перемещений при перестройках цитоскелета из одной пространственной конфигурации в другую.
Для того, чтобы микротрубочки могли выполнять все разнообразие своих функций, они должны взаимодействовать с другими компонентами клетки. Это могут быть другие микротрубочки, микрофиламенты (актиновые фибриллы), клеточные органеллы, плазматическая мембрана, а также, возможно, какие-то другие макромолекулы и макромолекулярные структуры. Эти взаимодействия осуществляются посредством различных микротрубочкоассоциированных
17
белков (microtubule associated proteins - MAPs) (см. обзор Mandelkow, Mandelkow, 1995).Среди различных классов MAP особенно хорошо изучены фибриллярные и моторные.
К первому классу относятся белки tau и МАР2, которые обеспечивают стабильность микротрубочек и латеральные связи между ними и другими органеллами. Электронные микрофотографии цитоплазмы растительных клеток показывают наличие на микротрубочках структур, которые связывают в виде латеральных сшивок, или мостиков, соседние микротрубочки, а также соединяют микротрубочки с мембранами и мембранными пузырьками (Jiang, Sonobe, 1993; Yasuhara et al., 1993).
Белок МАР65, первоначально выделенный из фрагмопластов табака, усиливает полимеризацию тубулина in vitro и способствует организации микротрубочек в пучки (Smertenko et al., 2000; Lloyd, Hussey, 2001). Этот белок ассоциирован с интерфазными микротрубочками, с препрофазным пучком, а также аккумулируется в зоне перекрывания микротрубочек фрагмопласта. Показано, что МАР65, изолированный из интерфазных клеток моркови, формирует in vitro мостики между микротрубочками размером 25-30 нм (Chan et al., 1999).
Ко второму классу относятся белки динеин и кинезин (а также кинезин-подобные белки), осуществляющие транспорт вдоль микротрубочек к их (-)- или (+)-концу посредством гидролиза АТФ (Hoyt, Geiser,1996). Эти белки важны как для перемещения органелл, так и для построении различных микротрубочковых систем, обеспечивая взаимное скольжение МТ друг относительно друга. Кинезинподобные белки - наиболее хорошо изученные моторные белки у высших растений. Они располагаются в веретене деления и во фрагмопласте. Один из таких белков - кинезинподобный кальмодулинсвязывающий белок КСВР - обладает (-)-направленной транспортной активностью и способностью связывать микротрубочки в пучки (Song et al., 1997; Као et al., 2000). Конститутивная активация КСВР антителами к кальмодулину вызывает преждевременное формирование веретена деления в клетках тычиночных волосков традесканции, что указывает на роль КСВР в построении веретена. Он концентрируется также в полюсных районах растительного веретена, что указывает на его роль в их формировании (Vos et al., 2000).
http://www.bankrabot.com/work/work_69234.html?similar=1
ОГЛАВЛЕНИЕ
Введение 8
Глава 1. Цитоскелет в делении растительной клетки. Обзор литературы 15
1.1. Микротрубочки и ассоциированные с ними белки 15
1.2. Цикл микротрубочкового цитоскелета в делении растительной клетки 21
1.2.1. Интерфазные кортикальные спирали 22
1.2.2. Препрофазный пучок микротрубочек 23
1.2.3. Перинуклеарная система микротрубочек. Профазное веретено. 25
1.2.4. Веретено деления. 26
1.2.5. Система фибрилл фрагмопласта 29
1.3. Актиновый цитоскелет растительной клетки 32
1.4. Центры организации микротрубочек (ЦОМТ) и регуляция
перестроек цитоскелета в ходе деления растительной клетки 34
1.5. Цитоскелет и пространственная организация клетки 38
1.6. Цикл цитоскелета в мейотическом делении у высших растений 39
1.7. Мутации, затрагивающие цитоскелетный цикл у высших растений 41
1.7.1. Мутации, нарушающие структуру интерфазного цитоскелета 42
1.7.2. Мутации, нарушающие формирование препрофазного пучка 43
1.7.3. Мутации, нарушающие формирование веретена деления 43
1.7.4. Мутации, нарушающие цитоскелетные структуры цитокинеза 45
1.8. Аномалии цитоскелета в мейозе у отдаленных гибридов 46
1.9. Аномалии цитоскелета, вызываемые специфическими ингибиторами 48
1.10. Регуляция цикла деления у высших растений 50
1.11. Механизмы мейотической реституции 53
1.11.1. Мейотическая реституция у видов однодольных растений 53
1.11.2. Мейотическая реституция у видов двудольных растений 55
Глава 2. Материал и методы 57
2.1. Использованный материал 57
2.1.1. Виды однодольных растений 59
2.1.2. Виды двудольных растений 59
2.2. Методы исследования 63
2.2.1. Иммуноокрашивание микротрубочкового цитоскелета
и визуализация хромосом 66
2.2.2. Метод электронной микроскопии 66
2.2.3. Визуализация МТ цитоскелета классическими методами 67
3
Глава 3. Динамика цитоскелета в мейотической профазе 68
3.1. Динамика цитоскелета на стадии профазы в норме 68
3.1.1. Деполимеризация цитоскелета в профазе 68
3.1.2. Консервация цитоскелета в профазе. 69
3.1.3. Деполимеризация цитоскелета с последующим
формированием перинуклеарного кольца 75
3.1.4. Смешанные фенотипы, промежуточные между вышеописанными 75
3.1.5. Динамика цитоскелета в профазе II у видов двудольных растений 78 3.2.Аномалии построения перинуклеарного кольца МТ 81
3.2.1. Блок перестройки радиального цитоскелета в перинуклеарное кольцо МТ 81
3.2.2. Автономное кольцо МТ при ацентрическом положении ядра 85
3.2.3. Прямой пучок МТ вместо перинуклеарного кольца в профазе 85
3.2.4. Общее цитоскелетное кольцо в многоядерных МКП у видов однодольных 86
3.2.5. Слияние перинуклеарных колец 87
3.2.6. Формирование перинуклеарной системы цитоскелета в профазе
в отсутствие ядерной оболочки 90
3.3. Цитоскелет в мейотической профазе. Обсуждение. 90
3.4. Заключение к главе 3 99 Глава 4. Динамика цитоскелета в прометафазе. Построение
анастрального веретена деления 100
4.1. Ранняя прометафаза 100
4.1.1 .Динамика цитоскелета в норме 100
4.1.2. Аномалии ранней прометафазы 105
4.1.2.1. Нарушение разборки перинуклеарного кольца МТ 105
4.1.2.2. Нарушение перемещения МТ кольца в зону бывшего ядра 105
4.1.2.3. Кольцевые и спиральные веретена 108 4Л.2.4. С-образные веретена 108
4.1.2.5. S-образные веретена 113
4.1.2.6. Комбинированные веретена 114
4.1.3. Процессы ранней прометафазы. Обсуждение 116 4.2.Средняя прометафаза (стадия хаотичных пучков) 120 4.2.1.Динамика цитоскелета в норме 123 4.2.2. Аномалии средней прометафазы 123 4.2.2.1. Нарушение формирования кинетохорных фибрилл веретена 123
4
4.2.2.2. Нарушение формирования центральных фибрилл веретена 125
4.2.2.3. Одновременное нарушение формирования кинетохорных и центральных фибрилл веретена 128
4.2.3. Процессы средней прометафазы. Обсуждение 129
4.2.3.1. Значение хаотической стадии 129
4.2.3.2. Феномен монополярного веретена у высших растений 130
4.2.3.3. Хаотическая стадия прометафазы и теория
«гибкой центросомы» Д. Мэзия 134
4.3. Поздняя прометафаза. Формирование биполярного веретена 136
4.3.1. Динамика цитоскелета в норме 136
4.3.2. Аномалии поздней прометафазы 138
4.3.2.1. Нарушение биполярной ориентации фибрилл веретена 138
4.3.2.2. Нарушение коориентации фибрилл веретена 142
4.3.2.3. Нарушение консолидации веретена деления 148
4.3.2.4. Нарушение конвергенции фибрилл на полюсах веретена 152
4.3.3. Формирование метафазной пластинки 153
4.3.4.. Процессы поздней прометафазы. Обсуждение 154
4.3.4.1. Биполярная ориентация биполярных фибрилл. 154
4.3.4.2. Коориентация фибрилл веретена 1,58
4.3.4.3. Консолидация фибрилл веретена в единую структуру цитоскелета 159
4.3.4.4. Конвергенция микротрубочковых пучков на полюсах веретена 161
4.4. Формирование анастрального мейотического веретена
у высших растений. Заключение 162
4.4.1. Ранняя прометафаза. Завершение реориентации микротрубочек 163
4.4.2. Средняя прометафаза . Формирование биполярных фибрилл веретена 164
4.4.3. Поздняя прометафаза. Формирование биполярного веретена 165 Глава 5. Динамика цитоскелета в телофазе. Формирование
фрагмопласта и цитокинез 167 5.1. Микротрубочковый цитоскелет в телофазе I мейоза у двудольных видов 167
5.1.1. Нормальный процесс перестроек цитоскелета в телофазе I 167
5.1.2. Аномалии формирования системы интерзональных фибрилл
в телофазе I в МКП у видов двудольных растений 170
5.1.2.1.Нарушение соединения (+)-концов МТ пучков 170
5.1.2.2. Недоформирование интерзональной системы МТ 170
5
5.1.2.3. Преждевременный цитокинез в мейозе у видов двудольных 172
5.2. Динамика цитоскелета в ТИ в одновременном цитокинезе 175
5.2.1. Цитоскелет в телофазе II мейоза дикого типа 175
5.2.2. Аномалии цитоскелета в ТИ в одновременном цитокинезе 176 w 5.2.2.1. Нарушения пространственной организации одновременного
цитокинеза при дезинтеграции веретен во втором мейотическом делении 176
5.2.2.2. Дезориентация веретен во втором делении мейоза 178
5.3. Цитоскелет в мейотической телофазе у двудольных видов.
Механизмы одновременного (симультанного) цитокинеза.
Обсуждение 178
5.4. Динамика цитоскелета в ходе телофазы I мейоза у видов
однодольных растений 181
5.4.1. Ход нормальной телофазы в МКП у видов однодольных растений 181
5.4.2. Аномалии телофазы I и цитокинеза в мейозе у видов
ф однодольных растений 185
5.4.2.1. Динамика фрагмопласта в отсутствие клеточной пластинки 185 5.4.2.2.«Чрезмерный» цитокинез при блоке формирования
дочерних клеточных мембран 188
5.4.2.3. S-образный фрагмопласт 190
5.4.2.4. Фрагмопласт в фенотипе «комета» 193 5.4.2.5.Нарушение центробежного движения фрагмопласта 194 5.4.2.6.«Рваные» диады: блок отключения синтеза пластосом 196 5.4.2.7.Неполный цитокинез 197 5.4.2.8.«Туннельный» цитокинез 200 5.4.2.Э.Цитокинез в отсутствие фрагмопласта 201 5.4.2.10.Добавочный (или преждевременный) цитокинез 203 5.4.2.11.Разомкнутый фрагмопласт 204 5.4.3.Цитоскелет в телофазе мейоза у видов однодольных растений.
Обсуждение 204 5.5.Морфологические механизмы последовательного
цитокинеза. Модель центробежного движения фрагмопласта 205
б.б.Симультанный и консеквентный цитокинез в сравнении 207 щ
5.7.Временная регуляция процессов цитокинеза в мейозе высших растений 209
5.8. Заключение к главе 5 215
6
Глава 6. Переход от фрагмопласта к интерфазному радиальному
цитоскелету 217
6.1.Динамика цитоскелета по окончании телофазы в мейозе
у видов однодольных растений 217 6.2.Переход к интерфазному цитоскелету в мейозе
у видов двудольных растений 219
б.З.Аномалии перехода к интерфазному цитоскелету 220
6.3.1.Консервация фрагмопласта 220
6.3.2.Нарушение разделения фрагмопласта 222 б.З.З.Нарушение формирования цитоскелетной системы в интеркинезе
мейоза у видов двудольных растений 223
б.ЗАПереход к интерфазному цитоскелету в отсутствие фрагмопласта 223 6.4. Переход от фрагмопласта к радиальному
интерфазному цитоскелету. Обсуждение 224
•# 6.5. Заключение 226
Глава 7. Цитоскелет и мейотическая реституция 227 7.1.Аномалии цитоскелета, приводящие к реституции ядер в мейозе
у видов однодольных растений 227 7.1.1.Множественные нарушения клеточного деления, вызывающие
формирование реституционных ядер в одном фенотипе 227 7.1.2.Аномалии прометафазы I, ведущие к формированию
реституционых ядер 233 ^ 7.2.Аномалии цитоскелета, приводящие к реституции ядер
в мейозе у видов двудольных растений 236 7.2.1.Нарушение формирования интерзональной системы микротрубочек
в мейозе у мутанта ps сахарной свеклы 236
7.2.2. Аномалии цитоскелета, приводящие к реституционному процессу
в мейозе у гаплоидов Brassica juncea 238
7.2.3. Формирование слившихся веретен (fused spindles) в мейозе
у картофеля (S. tuberosum) и томата (L. esculentum) 239
7.2.3.1. Сближение дочерних ядер в профазе II 239
7.2.3.2. Слияние перинуклеарных колец в профазе II 240
7.2.3.3. Сближение хаотичных фигур цитоскелета в прометафазе II 241 7.3. Механизмы реституции, общие для видов однодольных и двудольных 241
7
7.4. Цитоскелетные механизмы реституции ядер. Обсуждение 242
7.4.1. Механизмы мейотической реституции, общие для видов
однодольных и двудольных растений 243
7.4.2. Механизмы мейотической реституции, характерные исключительно для видов однодольных растений с последовательным цитокинезом 244
7.4.3. Механизмы мейотической реституции, характерные исключительно для видов двудольных растений с одновременным цитокинезом 244
7.4.4. Сводный обзор цитоскелетных механизмов мейотической
реституции, описанных в настоящей работе 246
Глава 8. Динамика МТ цитоскелета в ходе деления растительной клетки на
примере мейоза. Заключение и перспективы 249
8.1.Сводная схема динамики микротрубочкового цитоскелета в мейозе у высших
растений 249
8.2. Основные процессы цитоскелетного цикла в ходе мейотического деления у
<ф высших растений 252
8.2.1.Перемещение стабильных пучков МТ в цитоплазме 253
8.2.2.Полимеризация/деполимеризация микротрубочек 255 8.2.3.Совокупное действие основных процессов цитоскелетного цикла
в мейозе 256
8.3.Второстепенные процессы цитоскелетного цикла 258 8.4.Динамика микротрубочек в точках конвергенции (-)-концов (центры конвергенции
МТ: ЦКМТ) в мейозе. 260
8.5. Динамика цитоскелета и проблема центросомы растительной клетки 261
8.6. Перспективы. 265 Основные выводы 266 Список публикаций по теме работы 268 Список цитируемой литературы 273 Приложение 301 Каталог аномалий веретена деления у высших растений 301 Каталог аномалий цитокинеза растительной клетки 315 Каталог механизмов мейотической реституции 331 Диагностикум аномалий растительного мейоза по его продуктам 347
ВВЕДЕНИЕ
Цитоскелет - внутриклеточная филаментная цитоплазматическая структура, гораздо более подвижная и динамичная, чем можно заключить из ее названия. Среди функций цитоскелета - определение формы клетки и расположения в ней ядра и органелл, внутриклеточный транспорт, сегрегация хромосом (кариокинез), разделение цитоплазмы с автономизацией дочерних геномов (цитокинез), обеспечение дифференцировки клеток и тканей, формирование клеточной стенки у растений, удлинение растительной клетки. Все многообразие этих функций осуществляется цитоскелетными системами, весьма различными по морфологии и внутриклеточной локализации. Цитоскелет растительной клетки представлен, в основном, двумя составляющими: тубулиновыми микротрубочками (МТ) и актиновыми микрофиламентами (МФ).
Фундаментальным биологическим процессом, осуществляемым цитоскелетом, является деление клетки. Для его выполнения цитоскелет проходит собственный цикл, принимая различные конфигурации соответственно различным своим функциям на каждой стадии деления. Эти конфигурации называются системными структурами цитоскелета. Растительная клетка отличается от животной особенным многообразием цитоскелетных структур, сменяющих друг друга в ходе клеточного деления. Это кортикальные спирали, радиальные пучки, препрофазное кольцо, веретено деления и фрагмопласт (Goddard et al., 1994). В делении растительной, да и любой эукариотной, клетки основная роль принадлежит микротрубочковому цитоскелету (Baluska et al., 2004). Актиновые микрофиламенты колокализуются с микротрубочковыми пучками в составе основных цитоскелетных структур, но их функция в них не ясна, поскольку ингибиторы актина не нарушают деления растительной клетки (Staiger, Schliwa, 1987).
В клетках животных и низших эукариот выделяется специальная морфологическая структура, регулирующая процессы динамики цитоскелета в митозе и называемая центросомой, клеточным центром, полюсным организатором веретена. Концепция центросомы как ключевого фактора в регуляции основных морфологических процессов клеточного деления была предложена еще Бовери (Boveri, 1901) и активно поддержана Мэзия (Mazia, 1984). Мэзия предложил для эукариотной клетки теорию «гибкой центросомы» как совокупности мелких микрорубочко-организующих частиц, соединенных между собой линейно
9
гипотетической лентообразной структурой. Изменение конформации этой структуры и определяет, по мнению Мэзия, переход от одной цитоскелетной структуры к другой. Мэзия полагал также, что обнаружение такой центросомы в растительной клетке - дело будущего и целиком зависит от развития цитологических методов ^ анализа (Mazia, 1987).
Существует противоположная точка зрения на морфологическую регуляцию цикла цитоскелета в делении растительной клетки: самосборка стабильных микротрубочковых пучков в различные конфигурации посредством активности белков, ассоциированных с микротрубочками (Smirnova, Bajer, 1998). Центросома как компонента растительной клетки этой моделью не рассматривается.
Согласно современным представлениям, для регуляции динамики цитоскелета необходимы специальные морфологические структуры: центры организации микротрубочек (ЦОМТ), - служащие в качестве «затравки» для
Ф полимеризации микротрубочек. В животных клетках и клетках низших эукариот ЦОМТ входят в состав центросомы, которая и регулирует динамику цитоскелета. В клетках высших растений ЦОМТ сгруппированы на поверхности ядерной оболочки (Lambert, 1995). Совершенно не ясно, как регулируется динамика цитоскелета на тех стадиях деления растительной клетки, где ядерная оболочка отсутствует, а также в зонах цитоплазмы, удаленных от ядра. Механизмы, регулирующие перестройки цитоскелета в делении растительной клетки, представляют собой важнейшую нерешенную проблему клеточной биологии (Mazia, 1987; Marc, 1997; Baluska et al.,
^ 1998).
Поскольку современные методы цитологического анализа не позволяют визуализировать центросомные структуры в растительной клетке и сделать выбор между гипотезой гибкой центросомы и гипотезой самосборки, актуальной является вполне выполнимая задача: детально изучить процесс динамики цитоскелета в ходе клеточного деления как таковой и представить его в качестве непрерывного и полного процесса перехода из одной конфигурации в другую. Для решения этой задачи мы разработали эффективный подход, заключающийся в изучении возможно большего количества аномалий цитоскелетного цикла в делении растительной клетки.
™ Морфологический анализ аномальных клеточных процессов - весьма
информативный подход к решению разнообразных задач клеточной биологии. К
10
сожалению, до сих пор использование морфологических аномалий в цитологическом анализе ограничивалось лишь несколькими аспектами. Первый из них - анализ фенотипа различных мутаций с целью установить первичный морфологический эффект соответствующего гена и произвести генетическую диссекцию изучаемого процесса (см. обзоры Staiger, Cande 1993; Hoyt, Geiser, 1996). Второй аспект -изучение тех клеточных аномалий, которые приводят к биологически значимым последствиям, например, к формированию нередуцированных гамет в мейозе или к апомиксису (в числе прочих см. Werner, Peloquin, 1991; Qu, Vorsa, 1999). Третий аспект применения клеточных аномалий для решения цитологических задач -анализ последствий воздействия на клетку специфических ингибиторов изучаемого процесса или структуры с целью определения роли или функции последних ,-предмет экспериментальной клеточной биологии (McCurdy et al., 1991; Karyophyllis et al., 1997; Binarova et al., 1998a;).
Однако мы убедились, что анализ аномалий самих по себе, безотносительно их генетической подоплеки, биологической или физиологической значимости является также весьма информативным подходом к изучению процессов внутриклеточных преобразований на уровне морфологических структур. Особенно эффективен этот подход для изучения клеточного деления и дифференцировки. Блокируя, замедляя или искажая ход клеточного процесса, аномалии обнаруживают его детали, скрытые в норме. Полностью нарушая или искажая взаимодействие клеточных структур, аномалии обнаруживают их роль в этом взаимодействии и в изучаемом процессе. Такой подход будет тем более успешным, чем большее количество аномалии используется в анализе. Заранее предсказать, какую именно новую информацию удастся получить в результате такого анализа, невозможно. Может быть, поэтому этот подход до сих пор не используется в изучении структурного аспекта внутриклеточных процессов. Тем не менее, он имеет ряд существенных достоинств, главные из которых - высокая эффективность, методическая простота, а также возможность получить информацию, недоступную для других цитологических методов исследования. Мы назвали этот подход морфологической диссекцией.
Прекрасной моделью для изучения деталей и промежуточных этапов динамики микротрубочкового цитоскелета посредством морфологической диссекции является мейотическое деление в материнских клетках пыльцы (МКП). Мейоциты крупны (десятки микрон в диаметре), многочисленны, синхронизованы по стадиям
11
деления, лишены клеточной стенки. А главное, разнообразные аномалии мужского мейоза у растений легко доступны, то есть могут быть получены в достаточно большом количестве. Нарушениями мейотического деления характеризуются отдаленные гибриды, аллоплазматические линии, гаплоиды, полиплоиды, анеуплоиды и, конечно же, обширная коллекция мейотических мутантов, известная у высших растений (Kaul, 1988).
Правомерен ли выбор мейотического деления, которое является специализированным, в качестве модели для изучения деления растительной клетки вообще, и перенос полученных результатов на митотическое деление? Механизм динамики цитоскелета в отсутствие морфологически идентифицируемых центросомальных структур является важнейшей нерешенной проблемой клеточной биологии. Результаты такого исследования, полученные на любом виде делящихся бесцентриолярных клеток, вскрывают прежде всего общие принципы «цикла цитоскелета без центросом» и имеют соответствующее теоретическое значение. Поэтому выбор модели в данном случае диктуется прежде всего ее информативностью. Кроме того, цикл цитоскелета в ходе мейотического деления в МКП практически не отличается от такового в митотическом делении бесстеночных клеток, например, эндосперма - классической модели для изучения цикла цитоскелета в делении растительной клетки (Smirnova, Bajer, 1998). Морфологическими элементами цитоскелета, организующимися в цитоскелетные структуры и выявляемыми на световом уровне классическими методами визуализации цитоскелета, являются пучки МТ в комплексе с МФ или без них.
Многие промежуточные стадии цитоскелетного цикла для растительной клетки до сих пор не описаны. Анализ характера этих переходов сделает возможным выявить их закономерности и способ регуляции на морфологическом уровне. Полученная информация такого рода представляет собой важный материал для проверки и дальнейшей разработки теории центросомы и клеточного центра эукариотной клетки.
Цель и задачи исследования. Целью настоящей работы было поставлено выяснение морфологических механизмов регуляции цикла морфологических структур цитоскелета в делящейся растительной клетке в отсутствие идентифицируемой центросомы. Конечной целью было построение модели
12
регуляции динамики микротрубочкового цитоскелета в растительной клетке на морфологическом уровне на основании полученных данных.
Для выполнения этой цели были поставлены конкретные задачи:
1. Представить цикл динамики цитоскелета в делящейся растительной клетке в виде непрерывного процесса морфологических преобразований со всеми переходными стадиями.
2. Создать модель для изучения мофологических процессов динамики микротрубочкового цитоскелета в ходе деления растительной клетки.
3. Создать обширную коллекцию аномалий различной этиологии по мобильным стадиям мейотического деления у различных видов однодольных и двудольных растений.
4. Разработать варианты методов визуализации микротрубочкового цитоскелета -как классических так и иммуноокрашивания,- оптимальных для работы с материнскими клетками пыльцы и адекватных поставленным задачам.
'ф 5. Провести детальный цитологический анализ динамики цитоскелета в мейозе у всех аномальных форм для выявления составляющих событий и характеристик этого процесса.
6. Сравнить цикл цитоскелета в мейозе у видов с последовательным и одновременным цитокинезом.
7. Провести анализ цикла цитоскелета в мейозе фертильных отдаленных гибридов первого поколения и прочих форм - продуцентов нередуцированных гамет - для выяснения цитоскелетных механизмов мейотической реституции.
8. Составить каталог аномалии веретена деления растительной клетки. 9.Составить аналог аномалий цитокинеза растительной клетки.
10. Составить каталог механизмов мейотической реституции.
11. Составить диагностикум аномалий растительного мейоза по его продуктам
Научная новизна и практическая ценность работы. В результате проведенных в настоящей работе исследований внесен существенный вклад в решение важной проблемы клеточной биологии: морфологической регуляции перестроек цитоскелета в ходе деления бесцентриолярной клетки. Представленные к защите результаты и выводы оригинальны и получены впервые.
Разработан и успешно применен новый подход к цитологическому изучению процессов внутриклеточных морфологических преобразований: морфологическая
13
диссекция, представляющий собой сравнительный анализ возможно большего числа аномалий изучаемого процесса с целью выявления его неизвестных переходных стадий и характеристик. Цитоскелетный цикл в делящейся растительной клетке впервые представлен в виде полного, непрерывного и замкнутого процесса внутриклеточных морфологических преобразований. В том числе впервые описан ход перестроек цитоскелета в профазе и формирование перинуклеарного цитоскелетного кольца. Впервые описана стадия ранней прометафазы как вход цитоскелета в зону бывшего ядра. Впервые выявлены главные морфологические процессы средней прометафазы: формирование биполярных фибрилл веретена.выявлены новые механизмы реорганизации цитоскелета, участвующие в формировании биполярного веретена в поздней прометафазе. Впервые описан механизм формирования подвижного фрагмопласта в мейозе у однодольных видов и предложена модель его центробежного движения. Предложена модель временной регуляции цитокинеза. Впервые проведено сравнение циклов цитоскелета в мейозе '• с последовательным и одновременным цитокинезом и показано отсутствие принципиальных различий между ними. Выявлены новые механизмы цитоскелетного цикла: перемещение стабильных элементов цитоскелета, изменение их профиля и консолидация в единую структуру. Внесен существенный вклад в понимание морфологических механизмов регуляции цикла цитоскелета в делении растительной клетки в пользу гипотезы самосборки.
Практическая ценность настоящей работы заключается в том, что полученное цельное представление о морфологических механизмах мобильных стадий мейотического деления позволит приблизиться к решению таких проблем селекции, как естественная полиплоидизация, преодоление стерильности отдаленных гибридов первого поколения и апомиксис. Описаны 26 новых аномалий анастрального веретена в дополнение к 4, известным ранее в литературе, а также 23 аномалии цитокинеза. Впервые описаны 18 цитоскелетных механизма мейотической реституции у однодольных и двудольных видов. Разработан диагностикум аномалий растительного мейоза по его продуктам. Составленные каталоги представляют ценность при анализе морфологического фенотипа мейотических мутаций, особенно у таких сложных для цитологического анализа объектов, как арабидопсис. Полученные знания о цитоскелетном цикле в делении растительной клетки могут быть использованы при чтении университетского курса
14
лекций по цитологии и клеточной биологии. Результаты настоящей работы используются для чтения лекций по курсу цитогенетики в Санкт-Петербургском и Новосибирском Государственных университетах и в Университете Джапура (Индия).'
Апробация работы. Материалы диссертации были представлены на III Всесоюзной конференции «Генетика и цитология мейоза» (Новосибирск, 1990), на международном совещании «Fidelity of chromosome transmission and mitosis" (Ленинград, 1990), на 5-м Международном Когрессе по клеточной биологии (1992, Мадрид), на Съездах ВОГИС 1992 и 1994 гг, на 4-м Европейском Конгрессе по клеточной биологии (1994, Прага), на Гордоновской конференции «Meiosis» (1996, США), на международном симпозиуме "Plant Cytoskeleton: A Key for Biotechnology" (Ялта, 1998), на открытом семинаре Вагенингенского университета (Нидерланды, май 2001), на Московском Межинститутском семинаре по клеточной биологии (2 апреля 2003 г.), на Международном Сипмозиуме по проблемам мейоза (Санкт-Петербург, октябрь 2003), на I Съезде клеточных биологов (Санкт-Петербург, октябрь 2003), а также на отчетных сессиях Института цитологии и генетики СО РАН. Публикации по теме работы. По теме работы опубликовано 36 статей в рецензируемых отечественных и зарубежных журналах.
Структура и объем работы. Диссертация включает введение, обзор литературы, 7 глав результатов исследований и их обсуждения, заключение и перспективы, выводы, список цитируемой литературы и приложение, состоящее, в свою очередь, из 4 глав. Работа изложена на 360 страницах машинописного текста, включая 45 схем, 10 таблиц и 36 сводных рисунков, содержащих 453 микрофотографии.
Автор выражает глубокую искреннюю благодарность коллегам-растениеводам - создателям коллекций интереснейшего материала, послужившего источником нового знания о механизмах деления растительной клетки: A.M. Орловой, Г.М. Серюкову, Е.Г. Серюковой, А.И. Щаповой, Н.П. Гончарову, Н.М. Ковалевой, A.C. Машненкову, И.Н. Голубовской, СП. Соснихиной, А.Н. Жаркову, С.Ф. Ковалю, А.А.Козловой, Э.Р. Забировой, O.A. Шацкой, СИ. Малецкому, С.Г. Вепреву, Е.В. Дейнеко, P.O. Давояну, И.М. Бебякиной, СВ. Зеленцову, Я. Кестерсу, М. Раманне, К. Хейтинг, X. де Йонгу, X. ван Экку, Д. Хайхену, Р. Хеттену, К. Бутелье, К. Коничелле,
П. де Мело.
15 Глава 1. Цитоскелет в делении растительной клетки. Обзор литературы
Цитоскелет растительной клетки играет ключевую роль в таких фундаментальных биологических процессах, как клеточное деление, клеточный рост, а также морфогенез, органогенез и развитие растения (см. обзор: Васильев, 1996а). Поскольку растительная клетка лишена возможности изменять свою форму и расположение в ходе развития организма из-за наличия жесткой клеточной стенки, основным механизмом растительного органо- и морфогенеза оказывается пространственная ориентация клеточных делений, определяемая цитоскелетом. Необычайно важным этот процесс является для развития растительного эмбриона, поскольку начальное направление клеточных делений определяет поляризацию эмбриона и тип ткани, развивающейся из каждой дочерней клетки.
Кардинальная роль цитоскелета буквально во всех аспектах жизнедеятельности растительной клетки и растения в целом объясняет повышенный интерес к этой структуре, особенно усилившийся в последние годы.
1.1. Микротрубочки и ассоциированные с ними белки (MAP)
Цитоскелет растительной клетки представляет собой совокупность микротрубочек и актиновых микрофиламентов. Микротрубочки (МТ) были открыты методом электронной микроскопии (Ledbetter, Porter, 1963), и последовавшие затем интенсивные исследования показали, что они являются обязательным компонентом любой эукариотной клетки. Для выполнения внутриклеточных функций микротрубочки объединяются в пучки, взаимодействуя латерально. Эти пучки организуются в различные цитоскелетные структуры, причем толщина МТ пучков (количество микротрубочек в каждом из них) является характеристикой каждой структуры и зависит от ее функции. Так, сегрегация хромосом осуществляется МТ пучками веретена деления, которые содержат гораздо больше микротрубочек каждый, чем, например, МТ пучки интерфазного цитоскелета. Фиксация альдегидами (формалин, глутаральдегид), сохраняющая микротрубочки, позволяет наблюдать наиболее толстые пучки МТ в световой микроскоп при классических цитологических методах окрашивания. Такие пучки были описаны еще в конце 19 века как «ахроматиновый аппарат веретена» и «фибриллы фрагмопласта» (Wilson, 1928). Тонкие пучки интерфазного
16
цитоскелета также визуализируются на световом уровне при альдегидной фиксации, но уже иммуноокрашиванием с применением флуоресцеинов (см. обзор Lloyd, 1987).
Микротрубочки (МТ) представляют собой полый цилиндр 250А в диаметре, состоящий из гетеродимеров белков а- и ?— тубулина, организованных в 13 протофиламентов, которые соединяются латерально и составляют стенки цилиндра (см. обзор Avila, 1990). Микротрубочки являются весьма динамичными органеллами со временем полужизни (в растительных клетках) порядка одной минуты (Hush et al., 1994). Микротрубочки удлиняются за счет присоединения гетеродимеров тубулина на концах цилиндра, причем скорость присоединения на одном из концов («+»-конец) в несколько раз выше, чем на другом («-« конец) (Mitchison, 1992). МТ могут также спонтанно деполимеризоваться, теряя димеры тубулина с (+)- или (-)-конца. Совокупность этих явлений называется динамической нестабильностью (Cassimeris, 1993; Desai, Mitchison, 1997). Это свойство позволяет микротрубочкам после выполнения необходимых функций быстро деполимеризоваться и затем быстро восстанавливаться в новой локализации для выполнения иных функций.
МТ являются поляризованными структурами, что имеет огромное значение для широкого спектра выполняемых ими задач. Эта полярность обеспечивается асимметричным строением гетеродимеров а- и ?-тубулина и их соединением по типу «голова к хвосту» в процессе полимеризации протофиламентов, из которых состоят микротрубочки (Derksen et al., 1990). Поляризованность МТ обеспечивает такую их важнейшую функцию, как направленный внутриклеточный транспорт (например, транспорт везикул при экзоцитозе или хромосом к полюсам веретена). Поляризованность микротрубочек играет также важнейшую роль в процессах их взаимных перемещений при перестройках цитоскелета из одной пространственной конфигурации в другую.
Для того, чтобы микротрубочки могли выполнять все разнообразие своих функций, они должны взаимодействовать с другими компонентами клетки. Это могут быть другие микротрубочки, микрофиламенты (актиновые фибриллы), клеточные органеллы, плазматическая мембрана, а также, возможно, какие-то другие макромолекулы и макромолекулярные структуры. Эти взаимодействия осуществляются посредством различных микротрубочкоассоциированных
17
белков (microtubule associated proteins - MAPs) (см. обзор Mandelkow, Mandelkow, 1995).Среди различных классов MAP особенно хорошо изучены фибриллярные и моторные.
К первому классу относятся белки tau и МАР2, которые обеспечивают стабильность микротрубочек и латеральные связи между ними и другими органеллами. Электронные микрофотографии цитоплазмы растительных клеток показывают наличие на микротрубочках структур, которые связывают в виде латеральных сшивок, или мостиков, соседние микротрубочки, а также соединяют микротрубочки с мембранами и мембранными пузырьками (Jiang, Sonobe, 1993; Yasuhara et al., 1993).
Белок МАР65, первоначально выделенный из фрагмопластов табака, усиливает полимеризацию тубулина in vitro и способствует организации микротрубочек в пучки (Smertenko et al., 2000; Lloyd, Hussey, 2001). Этот белок ассоциирован с интерфазными микротрубочками, с препрофазным пучком, а также аккумулируется в зоне перекрывания микротрубочек фрагмопласта. Показано, что МАР65, изолированный из интерфазных клеток моркови, формирует in vitro мостики между микротрубочками размером 25-30 нм (Chan et al., 1999).
Ко второму классу относятся белки динеин и кинезин (а также кинезин-подобные белки), осуществляющие транспорт вдоль микротрубочек к их (-)- или (+)-концу посредством гидролиза АТФ (Hoyt, Geiser,1996). Эти белки важны как для перемещения органелл, так и для построении различных микротрубочковых систем, обеспечивая взаимное скольжение МТ друг относительно друга. Кинезинподобные белки - наиболее хорошо изученные моторные белки у высших растений. Они располагаются в веретене деления и во фрагмопласте. Один из таких белков - кинезинподобный кальмодулинсвязывающий белок КСВР - обладает (-)-направленной транспортной активностью и способностью связывать микротрубочки в пучки (Song et al., 1997; Као et al., 2000). Конститутивная активация КСВР антителами к кальмодулину вызывает преждевременное формирование веретена деления в клетках тычиночных волосков традесканции, что указывает на роль КСВР в построении веретена. Он концентрируется также в полюсных районах растительного веретена, что указывает на его роль в их формировании (Vos et al., 2000).