Peter Mitchell a tvorba ATP v bunkách

.:: ÚVOD

Veda niekedy vytvára dojem, že ňou dosiahnuté poznanie je pevné a neochvejné. V roku 1963 bolo štúdium procesov, ktorými si bunka vytvára energiu, veľmi vzdialené od tejto predstavy. Jeden vedec o tom žartovne poznamenal: „Ten, kto nie je dostatočne zmätený, len nedostatočne chápe celú situáciu.“

Poznanie procesu, ktorým bunka premieňa energiu získanú v Krebsovom cykle do použiteľnej formy, bolo centrálnou úlohou výskumu. Vedci tej doby vedeli, že práve v tomto procese dochádza k spotrebe kyslíka, ktorý svojimi pľúcami dýchame. Taktiež, že prostredníctvom neho pôsobí smrtiaci kyanid, arzén, či niektoré pesticídy. A v neposlednom rade vedeli, že si bunky práve v tomto procese vytvárajú väčšinu adenozín trifosfátu (ATP) - primárnej molekuly, ktorá prenáša energiu. ATP potrebujeme v našich svalových bunkách, aby sme mohli chodiť, používať hmat, rozprávať, prehĺtať, žmurkať, nadychovať sa, pumpovať krv. Existencia bunky závisí na reakciách schopných tvorby ATP aj kvôli tomu, aby mohli prebiehať mnohé iné chemické procesy, ktoré vyžadujú práve ATP. Vedci vedeli, že energia je nevyhnutná pre udržiavanie organizácie živej hmoty, ale zatiaľ nikto nedokázal vysvetliť, ako si bunky tvoria ATP.

Obr. 1: Peter Mitchell so svojou kolegyňou, Jennifer Moyle

Biochemici sa síce pokúšali vystopovať pokračovanie energetickej dráhy použitím rovnakých stratégií, aké použil Hans Krebs a jeho kolegovia, ale bez úspechu. Už vtedy existovali dôkazy, že proces prebieha ako sled reakcií, preto sa snaha sústredila na izoláciu a identifikáciu jednotlivých medziproduktov. Ako roky ubiehali, viacerí biochemici oznámili, že v tejto úlohe uspeli, avšak zakaždým sa ukázalo, že to tak nie je. Séria zdanlivých víťazstiev, ktoré sa napokon ukázali byť mylné, bola skľučujúca. Jeden učiteľ ironicky poznamenal pred svojimi študentami: „Nič horšie sa nemôže stať človeku, ktorý na tomto probléme pracuje ako to, že ho vyrieši.“ Napokon, omyly vo vede často upadnú do zabudnutia, ale v tomto prípade jeden z prominentných vedcov priznal, že úsilie výskumníkov sa stretávalo s „nápadným neúspechom.“

Zdalo sa, že tejto oblasti by mohli prospieť úplne nové myšlienky. A práve v tejto atmosfére predstavil Peter Mitchell (obr. 1) svoju originálnu hypotézu. Bolo to radikálne a z hľadiska súčasného poznania nové víťazné riešenie. Avšak Mitchellové myšlienky neboli jeho súčasníkmi všeobecne akceptované ešte jeden a pol dekády zatiaľ čo frustrácia z neúspechu na tomto poli pokračovala. Mitchell napokon za svoju prácu získal Nobelovu cenu. Táto kapitola je o tom, ako sa Mitchellovi podarilo rozlúštiť mätúci hlavolam a prečo iným biochemikom trvalo ešte pomerne dlho, kým napokon prijali jeho riešenie.

.:: ČO PREDCHÁDZALO CHEMIOSMOTICKÝM MYŠLIENKAM

Myšlienky Petra Mitchella boli revolučné. Na ich základe bolo treba prehodnotiť predstavy o biochémii v kontexte s biológiou. Mitchellovi však až také revolučné nepripadali. Prirodzene totiž vyplynuli z jeho skúseností získaných počas práce, ktorej sa venoval v čase, keď sa ešte vôbec nezaoberal syntézou ATP v bunkách. Sledovanie toho, ako sa Mitchell svojou činnosťou dopracoval k správnemu riešeniu, môže byť veľmi užitočné pre pochopenie samotných procesov.

Začiatkom 40-tych rokov pracoval Mitchell ako postgraduálny študent biochémie na Cambridgeskej univerzite s bunkovými membránami. Membrány predstavovali a stále predstavujú zaujímavý objekt skúmania, keďže fungujú ako bariéra a ich celistvosť je pre prežívanie bunky zásadná. Niektoré molekuly môžu do bunky vstupovať, zatiaľ čo iné nemôžu. Dôsledkom toho je, že tekutina vo vnútri membrány má odlišné zloženie ako tekutina vonku - membrána funguje ako osmotická bariéra. V tom čase, Mitchell spolupracoval práve s biochemikom, ktorý skúmal, ako presne taká bariéra funguje.

Mitchella však zaujímala predovšetkým odpoveď na konkrétnu otázku, ako sa niektoré látky aktívne transportujú skrz membránu bunky. Niektoré látky totiž membránami prenikajú ľahko, pasívne, ako keby cez filter. Iné molekuly však naopak vyžadujú energiu, aby sa aktívne dostali na druhú stranu osmotickej bariéry. To platí predovšetkým pre molekuly niektorých živín, ktoré je potrebné v bunke zhromaždiť. Látky sa však spontánne zhromažďovať nezvyknú, práve naopak, spontánne sa rozptyľujú. Zhromažďovať ich pomocou aktívneho transportu do vnútra bunky vyžaduje dodanie energie a Mitchella zaujímalo práve to, akým spôsobom sa energia využíva na presun látok.

Vedci si často pomáhajú analógiami, ktoré by im mohli pomôcť pri rozmýšľaní nad nezvyčajným problémom. Môžeme si predstaviť známe príklady, kde energia vedie k pohybu. Napríklad padajúca voda uvoľňuje pri svojom páde energiu a ak dopadá na lopatky mlynského kolesa, roztočí ho. Podobne stlačená pružina môže uvoľniť svoju energiu a poháňať autíčko na hranie. Mohlo by aj na bunkovej úrovni niečo „padať“ alebo „pracovať s pružinou“ takým spôsobom, aby sa vďaka tomu molekuly aktívne pohybovali na druhú stranu membrány? 

Koncom 40-tych rokov dve nezávislé skupiny biochemikov videli problém membránového transportu rozdielne. Jedna z nich študovala štruktúru membrány a to, ako táto štruktúra umožňovala niektorým látkam prechádzať skrz. Druhá skupina študovala membránové proteíny, membránové enzýmy a reakcie, ktoré katalyzovali. Uvedomovali si úlohu energie v celom procese, ale ich modely fungovania enzýmov nezahŕňali pohyb. Mitchell uvažoval o oboch otázkach bunkovej biochémie naraz. Vnímal teda transport cez membránu ako fyzikálny jav, a zároveň ako chemickú reakciu vyžadujúcu energiu. Predstavoval si chemickú reakciu, do ktorej by ako substráty vstupovali latky na jednej strane membrány a vystupovali by z nej tie isté látky ako produkty, len na druhej strane membrány. „Aktívny“ transport teda vnímal ako chemickú reakciu naprieč membránou. 

Mitchell neskôr vytvoril nový pojem „chemiosmotický“, aby popísal chemické reakcie spojené s pohybom cez membránu. „Chemi“ kvôli tomu, že reakcie boli chemické, „osmotický“ kvôli tomu, že sa uskutočnovali cez osmotickú bariéru - membránu. Mitchell si požičal grécky koreň slova „osmo“, čo znamená „tlačiť“. Popisované reakcie vôbec nesúvisia s fyzikálnym javom osmózy, aj keď obe slová zdieľajú spoločný základ. Samozrejme, Mitchella nepotešilo, keď sa v učebniciach neskôr začal používať pojem, ktorý bol podľa neho hrubo zavádzajúci, a to „chemiosmóza“. Nemohol však zabrániť tomu, aby inými autormi nedochádzalo k dezinterpretácii. 

Na začiatku svojej kariéry pracoval Mitchell buď samostatne alebo spoločne s Jennifer Moyle, kolegyňou z Cambridgeskej univerzity. Experimentoval s baktériami a skúmal, ako transportujú rôzne látky cez membránu. Zároveň sa teoreticky zaoberal aj chemickými reakciami prebiehajúcimi v trojrozmernom priestore. Ako by však enzýmy mohli také reakcie katalyzovať? Mitchell sa pokúsil znázorniť svoje predstavy membránových proteínov - enzýmov prostredníctvom drevených mechanických modelov (obr. 2). Podľa jeho teórie by tieto membránové proteíny - enzýmy boli schopné z jednej strany membrány viazať dva reaktanty substráty do svojho stredu. V priebehu tohto procesu by membránový proteín - enzým využil energiu na zmenu svojho tvaru. Vstupný kanál by sa uzavrel a otvoril by sa kanál na druhej strane membrány. Celý mechanizmus by teda fungoval podobne ako jednosmerná brána alebo turniket na staniciach metra, štadiónoch alebo športových halách. Každý postavený model Mitchell ukázal svojim kolegom a opýtal sa ich na ich názory, na základe ktorých svoje modely ďalej upravoval. Týmto spôsobom si dokázal celý proces lepšie predstaviť a zároveň mu to dopomohlo k myšlienke, že reakcie môžu mať aj smer.

Obr. 2: Mitchellove rané predstavy o membránových proteínoch - enzýmoch „pred“ a „po“.

V určitom okamihu Mitchell uvidel vzťah medzi energiou a transportom v opačnom smere. Zatiaľ čo dovtedy rozmýšľal len nad spôsobom, akým sa využíva energia na transport látok, od určitého momentu začal premýšľať nad tým, či by sa mohol pohyb látok cez membránu využívať ako zdroj energie. Inými slovami začal uvažovať nad transportom, ktorý by spôsobil uvoľnenie energie v dôsledku presunu látky z jednej strany membrány, kde by bola jej koncentrácia vysoká, na druhú stranu, kde by bola jej koncentrácia nízka. Bolo by možné využiť túto energiu na syntézu ATP? Pre lepšiu predstavu sa zamyslime nad príkladmi, ktoré sme si už spomínali, ale v opačnom smere. Aby pružina mala energiu na pohon autíčka na hranie, musíme ju najskôr stlačiť, čo je forma pohybu. Podobne, mechanickým otáčaním vodnej turbíny môžeme pumpovať vodu proti gravitácii.

Koncom 50-tych rokov začal Mitchell stavať na výsledkoch výskumu jednej zo svojich postgraduálnych študentiek. Tá prišla na to, že u baktérií je transport jedného konkrétneho sacharidu spojený s pohybom vodíkového katiónu (protónu). Mitchell si uvedomil, že častice pohybujúce sa skrz membránu môžu byť aj úplne jednoduché. Ak by koncentrácia protónov na jednej strane membrány bola vyššia ako na druhej strane, bunka by možno mohla využívať pohyb protónov na syntézu ATP. 

Mitchell síce pôvodne pracoval s baktériami, ale neskôr svoju pozornosť obrátil aj na produkciu ATP v komplexnejších bunkách. V eukaryotických bunkách sa ATP vyrába v membránach organel zvaných mitochondrie. ATP sa produkuje aj v membráne chloroplastov nachádzajúcich sa v bunkách rastlín. Mohli by sa protóny zúčastňovať na syntéze ATP v oboch týchto organelách? Ako by sa v bunkách mohla vytvoriť nerovnováha protónov na membráne? Mitchell mal o oboch procesoch určitú predstavu, na základe ktorej napísal krátky špekulatívny článok, ktorý mu uverejnili v roku 1961.

Krátko na to sa Mitchellova kariéra z osobných dôvodov prudko zvrtla. V čase, keď učil na Edinburskej univerzite, sa uňho prejavili žalúdočné vredy. Inštitucionálne zázemie, ako neskôr poznamenal, nevyhovovalo jeho temperamentu. Ako 43-ročný bol teda zo zdravotných dôvodov donútený opustiť svoj formálny akademický život. Presťahoval sa na vidiek do Cornwallu v južnom Anglicku. Tam podľa jeho vlastných slov, vlastnoručné dojenie ôsmych kráv každé ráno počas niekoľkých mesiacov spravilo s jeho zdravotnými ťažkosťami zázraky. V tom období si tiež zaumienil, že si založí malý súkromný výskumný inštitút, kde by mohol pracovať v menej byrokratickom prostredí ako predtým. Pozval doň aj svoju dlhoročnú spolupracovníčku Jennifer Moylovú, ktorá mala vynikajúce praktické zručnosti s laboratórnym výskumom a ona túto ponuku prijala. Mitchellov brat pomohol tento projekt financovať. Ďalšie dva roky Mitchell s pomocou svojej rodiny renovoval rozpadajúcu sa vilu z 19. storočia, aby v nej postavil komplex laboratórií, pracovne, knižnicu a niekoľko obytných izieb, ktoré sa stali jeho domovom. Počas tejto 3-ročnej výskumnej prestávky napísal Mitchell niekoľko teoretických článkov, ale bez funkčného laboratória jeho myšlienky ostávali len v teoretickej rovine.

V roku 1965 Mitchella pozvali, aby na konferencii prezentoval svoje chemiosmotické myšlienky. Avšak Mitchell chcel zároveň prezentovať aj experimentálne údaje, a tak spolu s Moylovou narýchlo pozháňali lacné vybavenie, dokonca si niektoré podomácky vyrobili. Vďaka nim sa im podarilo namerať rozdiel v koncentrácii protónov (pH) v roztoku mimo mitochondrií, ktoré podporovali Mitchellovu novú teóriu. Výsledky boli dokonca lepšie ako očakávali. Mitchell ich na konferencii prezentoval, ale len máloktorí účastníci súhlasili s jeho závermi. Skutočná kontroverzia okolo otázky produkcie ATP vzbĺkla onedlho na to.

.:: PRELÍNAJÚCE SA VÝSKUMNÉ TRADÍCIE

Mitchell svoje predstavy predstavil v odbore s bohatou minulosťou a úspešnou výskumnou tradíciou. Po objave Krebsovho cyklu sa vedci snažili určiť, aké ďalšie kroky vedú k tvorbe ATP. Vedelo sa, že citrátový cyklus produkuje vysoko-energetické elektróny prenášané pomocou tzv. elektrónových prenášačov NADH a FADH2. Začiatkom 50-tych rokov chemici vyskúmali ďalšie pokračovanie energetickej dráhy. Zistili, že NADH a FADH2 prenášajú vysoko-energetické elektróny na sériu proteínov vnútornej mitochondriovej membrány známej ako dýchací reťazec alebo respiračný reťazec (po anglicky electron transport chain - elektrónový transportný reťazec). V dýchacom reťazci sa pri presúvaní z prenášača na prenášač elektróny dostávali do stále nižších energetických hladín a uvoľnená energia sa nejakým spôsobom využívala na výrobu ATP. 

Elektróny sa po dosiahnutí svojej najnižšej úrovne presunú na molekulový kyslík a po spojení s protónmi vytvoria molekuly vody. Tento bunkový proces veľmi úzko súvisí s našou potrebou dýchať. Prijímanie elektrónov kyslíkom na konci dýchacieho reťazca umožňuje ďalším elektrónom, aby prechádzali reťazcom a odovzdávali svoju energiu za vzniku ďalšieho ATP. Ak však kyslík chýba, tok elektrónov sa zastaví a ďalšie ATP sa nevytvorí. Napríklad, nedostatok kyslíka v bunkách srdcového svalu znamená, že postihnuté bunky si nemôžu tvoriť dostatok ATP na svoje zmršťovanie a prestanú prispievať k pumpovaniu krvi. Dôsledkom je, že človeka postihne infarkt myokardu. Výskum energetickej dráhy sa sústredil okolo zásadnej otázky: ako súvisí transport elektrónov v dýchacom reťazci s tvorbou ATP? 

Biochemici boli zvyknutí hľadať odpoveď na podobné otázky objavovaním nových biochemických dráh. Uvažovali, že musia existovať ďalšie ešte neobjavené biochemické reakcie. Tento predpoklad však znamenal, že je potrebné objaviť aj ďalšie medziprodukty, ktoré by uchovávali energiu a ďalšie enzýmy, ktoré by reakcie katalyzovali, čím by sa z komplexného procesu stal ešte komplexnejší! Biochemici merali pokles energie elektrónov, aby zistili, pri ktorom kroku sa uvoľní dostatok energie na syntézu ATP. Podobne ako Krebs a jeho kolegovia, aj oni hľadali molekuly medziproduktov. 

Mitchell sa na otázku syntézy ATP pozeral úplne z iného uhla. Názorový stret, ktorý následne vzplanul, dobre ilustruje, ako veľmi sa Mitchellove predstavy o syntéze ATP odlišovali od dráh v energetickom metabolizme ako glykolýza alebo Krebsov cyklus. Vďaka tomu taktiež môžeme vidieť, ako vedecké poznanie musí niekedy prechádzať revolučnými zmenami svojej perspektívy.

Keďže dýchací reťazec sa nachádza vo vnútornej membráne mitochondrie, Mitchell si predstavil, že tento systém možno bude zahŕňať aj transport cez túto membránu. Konkrétne by pohyb záporne nabitých elektrónov medzi elektrónovými prenášačmi mohol pomocou nejakej elektrickej interakcie presúvať cez membránu kladne nabité protóny. Podľa tejto hypotézy by neboli potrebné žiadne ďalšie medziprodukty, ako predpokladali biochemici. Ako prechodná forma energie by namiesto toho slúžila nerovnováha protónov medzi oboma stranami vnútornej mitochondriovej membrány. Dýchací reťazec by najprv vytvoril túto nerovnováhu. Následne by sa protóny snažili nerovnováhu vyrovnať presúvaním sa na opačnú stranu, pričom by prechádzali cez enzým, ktorý by ich energiu využil na syntézu ATP, čo naznačovali Mitchellove modely pripomínajúce turnikety.

Kľúčovým krokom bolo zistiť, ako pohyb elektrónov, postupne strácajúcich energiu, dokáže presúvať protóny cez membránu. Mitchell si predstavoval, že elektróny nielen postupne odovzdávajú energiu, ale že sa zároveň aj pohybujú v priestore. Začínali by na prvej prenášačovej molekule na jednej strane membrány a vďaka elektrickej interakcii by záporne nabitý elektrón prirodzene pritiahol protón z tej istej strany membrány (obr. 3A). Následne by elektrón pri presune na ďalší prenášač prišiel o časť energie. Tento ďalší prenášač by bol na druhej strane membrány a elektrón by sa tak aj s protónom v závese dostal na druhú stranu (obr. 3B). Mitchell si predstavoval, že akonáhle by sa elektrón naviazal na prenášač na druhej strane membrány, protón by sa už nemohol ďalej viazať k elektrónu a uvoľnil by sa (obr. 3C). Vďaka tejto interakcii by sa protóny pomocou elektrónov transportovali cez membránu.

Proces by sa neustále opakoval, zatiaľ čo elektróny by postupne uvoľňovali energiu pri presune z prenášača na prenášač a napokon sa zlúčili s kyslíkom. Celkovo by sa takto prepravilo veľké množstvo protónov a vytvorilo zdroj nerovnováhy na membráne. Posledným krokom by bol enzým poháňaný vysokou koncentráciou protónov, ktorý by vyrábal ATP. Celý proces by podľa Mitchella fungoval vďaka tomu, že prenášače elektrónov by boli na membráne usporiadané striedavo (obr. 3D). Biochémia živého systému by teda nevyhnutne závisela na jeho jedinečnom molekulovom usporiadaní.

Obr. 3: Mitchellove predstavy o tom, ako pohyb elektrónov prenáša protóny cez membránu.

Mitchellov pohľad na syntézu ATP zdôraznil niektoré ťažkosti prebiehajúceho výskumu mitochondrií. Nikomu sa totiž nedarilo pozorovať mitochondriové reakcie v skúmavke v neprítomnosti neporušenej membrány. Mimoriadne náročné bolo aj izolovať a študovať jednotlivé súčasti dýchacieho reťazca. Mitochondriová membrána bola podľa Mitchella dôležitá, pretože bránila návratu protónov po ich transporte na druhú stranu prenášačmi. Ak by však došlo k narušeniu membrány, koncentrácia protónov na oboch stranách by sa vyrovnala, energia koncentračného rozdielu by sa stratila a k produkcii ATP by nedošlo. Nečudo, že celistvá membrána bola nevyhnutnou súčasťou celého procesu. 

Vtedajší biochemici však interpretovali tento problém odlišne. Predstavovali si, že membrána by mohla skôr slúžiť ako lešenie alebo ako kostra, ktorá zabezpečuje, že všetky súčasti dýchacieho reťazca sú upevnené v správnej polohe voči sebe, aby mohli správne spolupracovať. Aj podľa tohto vysvetlenia bola membrána nevyhnutnou súčasťou, ale z úplne iného dôvodu, ako uvádzal Mitchell. 

Vedcom, ktorí pracovali na vysvetlení syntézy ATP, znela Mitchellova hypotéza o protónoch a membránach ako špekulácia. Mitchella vnímali ako vedca, ktorý nie je dostatočne oboznámený s touto oblasťou biochémie a nemá dostatočné poznatky o energetike reakcií. Mitchell navyše skúmal baktérie, nie mitochondrie komplexnejších eukaryotických buniek. Endosymbiotická teória pôvodu mitochondrií ešte nebola dostatočne akceptovaná a len máloktorí biochemici si mysleli, že štúdium baktérií by mohlo byť relevantné aj pre mitochondrie. Prevažujúci názor by sa dal zhrnúť slovami jedného biochemika: „Nechce sa mi veriť, že jediná a primárna funkcia tohto neuveriteľne komplikovaného reťazca reakcií je presúvať protóny na správne miesto.“ Tieto diskusie pokračovali počas celých 60-tych rokov 20. storočia.

.:: STRATÉGIE PRE VYRIEŠENIE SPORU

Ako teda napokon došlo k všeobecnému prijatiu chemiosmotickej hypotézy? Kontroverzia sa určite nevyriešila okamžite. Mitchell neustúpil od svojich predstáv, ani keď boli značne kritizované. Aj keď bol milý a priateľský, bol taktiež tvrdohlavý a húževnatý, keď išlo o jeho myšlienky. Podľa mladšej generácie biochemikov mali v tom čase všetci lídri v odbore veľké ego. Keďže išlo o centrálny problém biológie, nebolo pochýb, že v stávke je Nobelova cena a získať ju chceli všetci významní vedci vrátane Mitchella. 

K riešeniu sporu čiastočne prispelo aj to, že sa samotné predstavy v priebehu času vyvíjali. Koncepty, ktoré Mitchell pôvodne predložil sa v mnohých veciach líšili od tých, ktoré biochemici neskôr prijali. Mitchell opakovane prehodnocoval svoje predstavy tak, aby v nich neboli koncepčné problémy a aby zodpovedali novým dôkazom. Podľa jeho prvého článku sa dokonca protóny mali presúvať cez membránu v opačnom smere. Bola to síce jednoduchá chyba, ale veľmi zásadná pre biochemika, ktorý by sa snažil meraním overiť tento proces. Mitchell taktiež z väčšej časti iba odhadoval, koľko protónov treba nechať prejsť membránou na syntézu jednej molekuly ATP, pričom iní vedci zosmiešňovali jeho predbežné návrhy a považovali ich za veľmi nerealistické. Navyše stav nerovnováhy protónov, ktorý Mitchell predpokladal, bol neslýchaný a pravdepodobne by bunku zničil. Ani jeho pôvodná predstava o striedajúcich sa elektrónových prenášačoch na membráne nezodpovedala nameraným údajom. Preto napokon opustil koncept v tejto podobe a postupne ho nahradil omnoho sofistikovanejšou verziou, o ktorej už viacerí vedci povedali, že sa vo veľkej miere zhoduje s nameranými údajmi.

Mitchell bol vytrvalý a flexibilný. Nebol ochotný obetovať svoju ústrednú myšlienku o tom, že reakcie prebiehajú v trojrozmernom priestore a skrz membránu, a preto usilovne pracoval na modeli, ktorý by zodpovedal nameraným údajom. Keďže jeho financie boli obmedzené, musel koncentrovať svoje úsilie. Pri popoludňajšom čaji rozmýšľal nad teoretickými problémami a nad tým, aký experiment by mohol priniesť dôležité poznatky pre jeho ďalšiu prácu. Nasledujúce ráno Jennifer Moyle spravila experiment (o Mitchellovi bolo známe, že nebol príliš zručný pri laboratórnych pokusoch). Popoludní diskutovali o teoretických dôsledkoch týchto výsledkov. Mitchell potom rozmýšľal ďalej, niekedy porovnával svoje výsledky s výsledkami publikovanými vo vedeckej literatúre a potom sa spoločne s Moyle rozhodli, ktorým smerom ďalej. Výnimočná súhra Mitchellových teoretických úvah a experimentálnych výsledkov Jennifer Moyle bola nevyhnutná pre doladenie interpretácie chemiosmotickej hypotézy tak, aby zohľadňovala všetky výhrady. 

Mitchell taktiež osobne spolupracoval s ostatnými biochemikmi. Keďže svoje pracovisko mal v malom laboratóriu mimo hlavných centier výskumu, ľahko sa mohol dostať do izolácie od vedeckej komunity. Aby tomu zabránil, udržiaval aktívnu korešpondenciu s ďalšími významnými mysliteľmi v tomto odbore. Keď mal s nimi určité spory ohľadom časti svojej hypotézy, často im telefonoval, aby im prezentoval svoju predstavu a následne sa snažil zapracovať ich pripomienky. Do svojho laboratória pozýval na návštevu ďalších vedcov vrátane svojich najsilnejších kritikov. Počas niekoľkodňových návštev spoločne o celej veci diskutovali a často aj spoločne zrealizovali krátky experiment. Tieto osobné návštevy nie vždy presvedčili Mitchellových kritikov, ale napomohli aspoň tomu, aby podrobnejšie zvážili chemiosmotickú perspektívu. Tento pocit porozumenia bol veľmi dôležitý, keďže Mitchellove predstavy sa radikálne líšili od myšlienok hlavného prúdu vedcov v tomto odbore.

.:: UMELÁ REALITA

Vedcom sa niekedy podarí navrhnúť a zrealizovať zásadný experiment, ktorý im pomôže rozhodnúť sa medzi dvoma kontrastnými hypotézami. V tomto prípade však boli predstavy natoľko komplexné, že na potvrdenie Mitchellovej hypotézy bolo potrebné spraviť mnoho testov, z ktorých každý dával odpoveď len na jednu čiastkovú otázku. Jeden z nich je však obzvlášť pozoruhodný, pretože je príkladom takého dramatického a dobre usporiadaného experimentu, o akom väčšina vedcov sníva. Tiež nám ukazuje, ako sa dajú dôležité výsledky interpretovať rôznymi spôsobmi. 

V čase, keď Mitchell dokončoval renováciu vily pre svoj výskumný inštitút, dostal list od Andrého Jagendorfa z Cornellovej univerzity. Jagendorf písal, že urobil niekoľko zaujímavých pozorovaní pri štúdiu rastlinných buniek, ktoré potvrdzovali niektoré časti Mitchellovej hypotézy z roku 1961. Spolu so svojím postgraduálnym študentom merali zmeny koncentrácie protónov, ktoré nastali v dôsledku prenosu elektrónov v chloroplastoch. Tieto reakcie, v ktorých sa zachytáva slnečná energia pomocou chlorofylu, sú veľmi podobné tým, ktoré prebiehajú v mitochondrii. Tieto úvahy zneli sľubne. Avšak vynárala sa otázka, ako by sa dalo otestovať, že tieto zmeny nevznikajú náhodné alebo dôsledkom nejakého neznámeho faktoru.

Jagendorfovou stratégiou bolo vytvoriť umelú nerovnováhu protónov na membráne a zdokumentovať jej efekt. Inkuboval preto chloroplasty v kyslom roztoku (nízke pH), aby sa protónmi nasýtili obe strany membrány tylakoidov. Chloroplasty po inkubácii následne vložil do roztoku s nižšou koncentráciou protónov (vyšším pH), čím vytvoril nerovnováhu protónov na membráne. V roztoku s vyšším pH došlo v chloroplastoch k tvorbe ATP. Keďže experiment prebiehal za úplnej tmy, mohol si byť istý, že chloroplasty pri tomto procese nevyužívajú slnečnú energiu. Tento experiment potvrdil, že práve vytvorená nerovnováha protónov je zodpovedná za tvorbu ATP, a teda tento proces prebieha aj v chloroplastoch vystavených svetlu v prirodzených podmienkach.

Výsledky experimentu s kyslým kúpeľom boli prevratné. Vedci dokázali indukovať prirodzenú funkciu chloroplastu aj za umelých podmienok a zároveň demonštrovali, že príroda sa správa spôsobom, ktorý biológovia ani biochemici predtým neočakávali. Pre výskumníka, ktorý zvykol o syntéze ATP rozmýšľať v rovine molekúl medziproduktov, boli tieto výsledky úchvatné. Z dnešného pohľadu sa pokusy s kyslým kúpeľom zdajú byť nezdolateľným dôkazom o chemiosmotickej hypotéze (dnes už chemiosmotickej teórii). Tento pokus skutočne potvrdil jednu z jej kontroverzných predpovedí. Samotný pokus síce nestačil na dokázanie celej teórie, dokázal však demonštrovať zásadné nové zistenie. Pred pokusom bolo otázkou, či nerovnováha protónov môže vôbec viesť k syntéze ATP. Po experimente sa však otázkou stalo, či je možné syntetizovať ATP aj bez protónov. Jagendorfove výsledky nevyvrátili predstavu o chemických medziproduktoch, zmenili však charakter celej debaty. Taká bola sila tejto demonštrácie. A práve vďaka sérii viacerých takýchto experimentov začali biochemici všeobecne prijímať chemiosmotické myšlienky aj bez toho, aby explicitne zavrhli svoje skoršie predstavy.

.:: EPILÓG

Mitchell získal Nobelovu cenu v roku 1978. Neskôr ho zobrazili na karikatúre (obr. 4) ako Krištofa Kolumba bioenergetiky (odbor, ktorý študuje energetiku bunky). Text k obrázku uvádza: „Mitchell sa plaví do chemiosmotického nového sveta napriek varovaniu, že to bude jeho koniec“. Čo nám tento obrázok môže napovedať o vedeckom skúmaní a o úlohe odlišne rozmýšľajúceho vedca? Mitchell raz poznamenal: „Veda nie je ako golf, ktorý hrá človek sám za seba. Skôr je ako tenis, kde hráč pošle loptičku na druhú stranu siete a očakáva, že sa k nemu vráti.“