Hans Krebs a hlavolam bunkovej respirácie (Joel B. Hagen)

.:: ÚVOD

Hans Krebs (obr. 1) si aj v pokročilom veku dobre spomínal na to, ako sa zavčas rána 20. júna 1933 plavil loďou popri bielych útesoch mesta Dover. Hoci bol plný optimizmu pri pomyslení na nový život v Anglicku, netešilo ho, že musel opustiť svoje rodné Nemecko. Ako vedca židovského pôvodu ho prepustili z výskumnej pozície na Freiburgskej univerzite krátko po tom, ako sa nacisti dostali k moci. Podobne ako mnohí ďalší nemeckí vedci aj Krebs urýchlene opustil krajinu. Niekoľko rokov strávil ako utečenec pracujúci na dočasných výskumných miestach. Krátko po vypuknutí druhej svetovej vojny v roku 1939 sa stal britským občanom. Za objav metabolického cyklu, ktorý dodnes nesie jeho meno, získal v roku 1953 Nobelovu cenu a v roku 1958 ho povýšili do šľachtického stavu.

Obr. 1: Hans Krebs

Krebs mal viac šťastia ako mnohí ďalší utečenci. Rok pred emigráciou z Nemecka objavil chemické kroky, pomocou ktorých sa v pečeni vytvára dôležitý odpadový produkt - močovina. Tento objav bol o to významnejší, že predstavoval prvý príklad nového typu bunkového procesu - biochemický cyklus. Krebsovi priniesol medzinárodné uznanie, vďaka ktorému ho po úteku z Nemecka pozvali pracovať na Cambridgeskú univerzitu patriacu medzi vedúce svetové pracoviská biochemického výskumu. 

Aj keď mu nacisti zabránili vziať si so sebou mnohé svoje osobné veci, vďaka zvláštnej zhode okolností sa mu podarilo vyviezť z Nemecka časť svojho laboratórneho vybavenia. A hoci po príchode do Anglicka na tom nebol finančne najlepšie, po usadení sa v Cambridgei dokázal prakticky ihneď pokračovať vo svojom výskume. O necelých päť rokov neskôr zverejnil vedecký článok oznamujúci objav, ktorý ho preslávil, a to cyklus kyseliny citrónovej (Krebsov cyklus resp. citrátový cyklus).

.:: CESTA K BIOCHÉMII

Krebs vyrastal v meste Hildesheim, ktoré bolo pri spojeneckom bombardovaní počas druhej svetovej vojny takmer úplne zničené. Ako syn významného chirurga chcel Krebs pokračovať v stopách svojho otca. Medicínu začal študovať krátko po skončení prvej svetovej vojny, avšak čoskoro si uvedomil, že viac ako medicínska prax ho zaujíma vedecký výskum. Ocitol sa tak na prahu náročného rozhodnutia. Nemecko sa v tom čase nachádzalo vo vážnej ekonomickej kríze a výskumných miest bolo veľmi málo. Po úspešnom absolvovaní štúdia medicíny ho však našťastie prijali ako asistenta jedného z najvýznamnejších nemeckých fyziológov - Otta Warburga. 

Warburg bol autokrat, ktorý nedovolil svojim asistentom pracovať na nezávislých projektoch. Napriek svojmu diktátorskému štýlu patril medzi vynikajúcich učiteľov. Mal vysoké nároky na seba i na svojich asistentov. Warburg ako vynikajúci fyziológ, ktorý významne prispel k štúdiu fotosyntézy, enzýmovej aktivity a metabolizmu rakovinových buniek, bol pre Krebsa ako mladého začínajúceho vedca vzorom. Krebs veľmi obdivoval svojho učiteľa a tvrdil, že úspechy, ktoré sa mu v živote podarilo dosiahnuť, boli čiastočne motivované snahou vypracovať sa na úroveň tohto významného fyziológa. 

Warburgovi patrí aj zásluha za to, že zdokonalil laboratórne vybavenie, ktoré neskôr Krebs použil vo svojom vlastnom výskume. Podobne ako ďalší fyziológovia, Warburg meral spotrebu kyslíka počas respirácie pomocou manometrov (obr. 2). Warburgov manometer bol ale nezvyčajný. Dal sa použiť nielen na štúdium respirácie celých organizmov, ale aj na štúdium respirácie buniek, čo vyžadovalo nakrájanie živočíšneho tkaniva pomocou žiletky na veľmi tenké plátky.

Podobne ako u mnohých iných experimentov aj tento priniesol viac otázok ako odpovedí. Sukcinát, fumarát aj malát zvyšovali respiráciu viac ako Krebs očakával. Okrem toho sa v reakčnej nádobke po reakcii nachádzali všetky tri zlúčeniny aj po skončení pokusu. Ak sú teda tieto štvoruhlíkové zlúčeniny skutočne medziproduktmi v postupnej oxidácii glukózy na oxid uhličitý, prečo nedošlo u tohto pridaného paliva k jeho úplnému spáleniu? A ak nie sú medziproduktmi, prečo sa respirácia v tkanivových rezoch tak výrazne zvýšila? 

Maďarský biochemik Albert Szent-Györgyi, nositeľ Nobelovej ceny za objav vitamínu C, navrhol jedno z možných vysvetlení týchto nečakaných výsledkov. Domnieval sa, že sukcinát, fumarát a malát nie sú reaktantmi v bunkovej respirácii, ale že slúžia ako katalyzátory, ktoré urýchľujú chemické reakcie bez toho, aby sa pri tom zároveň spotrebovali. Táto domnienka síce vysvetľovala, prečo bolo možné zistiť tieto látky v nádobke aj po ukončení pokusu, avšak ak by aj bola správna, biochemici stále netušili, ktoré látky sú tými skutočnými medziproduktmi, a teda pokračovali v ich hľadaní. Boli tieto tri látky katalyzátormi alebo medziproduktmi? Táto sporná otázka ostala nezodpovedaná ešte ďalšie dva roky.

.:: ÚLOHA KYSELINY CITRÓNOVEJ

Vedcom taktiež chýbali mnohé ďalšie kúsky hlavolamu. Najväčšiu záhadu predstavovala kyselina citrónová (citrát), ktorej molekula mala šesť uhlíkov. Biochemici dokázali zvýšiť bunkovú respiráciu pridaním citrátu do Warburgovho manometra, ale nedokázali prísť na logické miesto, kde by mal citrát patriť v rámci hypotetickej dráhy. Ani Krebsovi sa spočiatku nedarilo vymyslieť, akú úlohu by mohol citrát zohrávať a svoje teoretické úvahy o tomto probléme nikdy nezverejnil. 

V roku 1937 dvaja nemeckí biochemici, Franz Knoop a Carl Martius, zverejnili sériu reakcií, ktorá začínala citrátom a končila oxalacetátom (obr. 3 vľavo). V tejto schéme našli svoje dôležité miesto aj tri zlúčeniny, ktoré študoval Krebs a Szent-Györgyi, a to sukcinát, fumarát a malát. Bola snáď táto schéma veľkou chýbajúcou časťou v biochemickej dráhe vedúcej od glukózy k oxidu uhličitému? 

Po prečítaní ich článku sa Krebs rozhodol urobiť jednoduchý pokus na otestovanie Knoop-Martiusovej hypotézy - zablokovať v bunkách jednu z reakcií v hypotetickej dráhe pomocou chemického inhibítora. Ak by sa mu to podarilo, reakcie nasledujúce po zablokovanej reakcii by nemali prebiehať a medziprodukt vstupujúci do zablokovanej reakcie by sa mal hromadiť. Môžeme si to predstaviť ako horskú rieku, ktorá na svojej ceste preteká viacerými jazerami. Ak jej do cesty postavíme prekážku, voda prestane tiecť a začne sa hromadiť pred prekážkou. Krebs zablokoval reakciu vedúcu od sukcinátu k fumarátu. Ak bola Knoop-Martiusova dráha správna, vo Warburgovom manometri by sa mal hromadiť sukcinát. Na konci pokusu získal Krebs nasledujúce výsledky:

Testy s ďalšími inhibítormi priniesli podobné výsledky, ktoré podporovali Knoop-Martiusovu hypotézu, avšak stále zostávala nezodpovedaná pálčivá otázka týkajúca sa osudu sukcinátu, fumarátu a malátu. Prečo sa nespotrebovali počas respirácie? Podľa Knoop-Martiusovej hypotézy by sa predsa mali spotrebovať počas pomalého spaľovania glukózy.

.:: LINEÁRNA DRÁHA ALEBO CYKLUS?

Krebs po týchto pokusoch začal uvažovať nad myšlienkou, že celý proces by mohol byť cyklický, nie lineárny. To bola možnosť, ktorú nikto vrátane Krebsa predtým nezvažoval. Ak by boli konce Knoop-Martiusovej dráhy prepojené, viaceré kúsky hlavolamu by veľmi dobre zapadli na svoje miesto. Cyklus reakcií by dokázal elegantne vysvetliť, prečo sa pridané zlúčeniny ako sukcinát, fumarát a malát nespotrebovali počas bunkovej respirácie. Namiesto úplnej oxidácie totiž došlo pri každej otočke k ich regenerácii. Cyklus reakcií by taktiež dokázal vysvetliť zásadnú úlohu citrátu ako prvého medziproduktu. Výsledky Krebsových pokusov s chemickými inhibítormi boli v dobrej zhode s hypotézou o cykle, ale aj s hypotézou o lineárnej dráhe. Otázne bolo, či sa Krebsovi podarí nájsť experimentálny dôkaz, ktoré by podporoval jeho hypotézu o cykle namiesto Knoop-Martiusovej hypotézy o lineárnej dráhe. Konkrétne sa snažil zistiť, či v bunke dochádza k tvorbe citrátu z oxalacetátu. V kľúčovej sérii experimentov Krebs zistil, že keď sa do Warburgovho manometra pridá súčasne pyruvát aj oxalacetát, množstvo citrátu sa zvýši. Toto zistenie bolo mimoriadne významné aj preto, lebo bolo dobre známe, že pyruvát je hlavným produktom glykolýzy. Týmto pokusom sa Krebsovi podarilo pevne spojiť oba konce Knoop-Martiusovej dráhy, čím vytvoril cyklus, ktorý dnes nazývame Krebsovým cyklom (obr. 3 vpravo). 

Necelé štyri mesiace po prečítaní Knoop-Martiusovho článku bol Krebs pripravený oznámiť svoj objav, ktorý nazval „cyklus kyseliny citrónovej“ (citrátový cyklus). Rozhodol sa zaslať krátky článok do časopisu Nature, jedného z najčítanejších vedeckých časopisov na svete. Keďže vychádzal ako týždenník, vedci často využívali tento časopis, aby čo najskôr informovali vedeckú komunitu o dôležitých objavoch. Je ironické, že časopis Nature tento článok odmietol, čo sa Krebsovi predtým ani potom nestalo. Na samotnom odmietnutí by nebolo nič nezvyčajné, pretože takmer každému vedcovi sa v jeho kariére stane, že mu vedecký časopis odmietne zverejniť článok. Editor navyše nebol biochemikom a musel selektovať, ktoré z mnohých zaslaných rukopisov časopis napokon zverejní. Táto príhoda nám však pripomína, že niekedy ani veľmi významné vedecké objavy nie sú okamžite rozpoznané. 

Krebsa samozrejme veľmi zarazilo, že jeho článok odmietli. Rozhodol sa teda poslať dlhší článok do vtedajšieho najvýznamnejšieho biochemického časopisu, ktorý ho urýchlene zverejnil. Biochemici, uvedomujúc si dôležitosť Krebsovho výskumu, naň začali nadväzovať. V priebehu nasledujúcich rokov sa cyklus kyseliny citrónovej podarilo dokázať u veľkého množstva organizmov vrátane mnohých druhov baktérií. Zistilo sa, že zohráva významnú úlohu nielen pri oxidácii glukózy a sacharidov, ale aj pri metabolizme lipidov a proteínov. Cyklus, ktorý sa časom začal nazývať po svojom objaviteľovi „Krebsov cyklus“, bol centrálnym uzlom energetického metabolizmu v takmer všetkých bunkách. 

Krebs rád prirovnával svoj výskum k riešeniu hlavolamu. Veľmi dobre si však uvedomoval, že jeho cyklus je tiež len súčasťou ešte väčšieho hlavolamu. Ani on, ani nikto iný v tom čase nevedel, kde presne v bunke dochádza k respirácii. Aj keď niektorí vedci navrhovali, že by to mohlo byť v mitochondriách, experimentálne sa to podarilo dokázať až o desaťročie neskôr. Dôležitá úloha ATP ako primárneho nosiča energie nebola v tom čase dostatočne preskúmaná a trvalo ešte ďalších 30 rokov, kým vedci prišli na to, akým procesom sa ATP v bunke tvorí. Aj keď Krebs zistil, že pyruvát spája glykolýzu a cyklus kyseliny citrónovej, samotné vzájomné prepojenie ostalo neobjasnené. Na dôležitú úlohu koenzýmu A v prepojení týchto dvoch biochemických dráh sa prišlo až o desať rokov neskôr po objave cyklu. Dnes vieme, koľko kúskov hlavolamu v roku 1937 stále chýbalo, to však vôbec neznižuje význam Krebsovho objavu. Jeho výskum by nám mal pripomínať, že vedecké poznanie sa často buduje po veľmi malých kúskoch.

.:: EPILÓG

Ako si môžeme vysvetliť vedeckú kreativitu? Vďaka čomu je jeden vedec úspešnejší ako druhý? Prečo bol práve Krebs schopný vidieť biochemický cyklus tam, kde iní vedci videli lineárnu biochemickú dráhu? Na tieto otázky nie je jednoduchá odpoveď, ale Krebsova vedecká kariéra nám môže poskytnúť zaujímavý pohľad na povahu kreatívneho procesu, pričom vyvracia nesprávne predstavy o tom, ako môže dôjsť k významnému objavu. 

Spomeňme si, že Krebs niekoľko rokov pred dokončením svojej práce na cykle kyseliny citrónovej už jeden biochemický cyklus objavil. Proces produkcie močoviny bol prvým príkladom biochemického cyklu a jeho objav priniesol Krebsovi medzinárodné uznanie. Prispel tento objav k tomu, že Krebs bol vnímavejší pri hľadaní ďalších biochemických cyklov? Vieme presne určiť, v ktorom okamihu výskumu si Krebs uvedomil, že sa jedná o cyklus? Historik Frederic Holmes, ktorý podrobne študoval Krebsove laboratórne denníky, nenašiel dôkazy o náhlom objave. Podobne ako iní biochemici si aj Krebs najskôr myslel, že bunková respirácia je lineárnou dráhou, a až postupom času ju dokázal vidieť ako cyklický proces. 

Ak Krebsov objav nie je dôsledkom nečakaného vnuknutia, ako si môžeme vysvetliť tento objav? Holmes poukazuje na niekoľko dôležitých prvkov Krebsovho bádania. Podobne ako mnohí úspešní vedci, Krebs bol hlboko oddaný výskumu. Už na začiatku svojej kariéry veľmi dobre vedel, akým hlavným výzvam a vedeckým problémom sa venujú jeho súčasníci. Po dôslednom zvažovaní sa rozhodol venovať svoj život objasňovaniu niektorých z nich. Zvyčajne to znamenalo tráviť v laboratóriu šesť dní v týždni. Dôsledný a veľmi pedantný prístup k práci sa u Krebsa miešal s intelektuálnou flexibilitou. Ak sa mu nepodarilo podporiť nejakú hypotézu experimentálnymi dôkazmi, rýchlo ju dokázal zavrhnúť. Táto ochota zmeniť smer na základe výsledkov svojich pokusov znamenala, že málokedy uviazol v slepej uličke.

Takto by sa dal charakterizovať Krebsov kreatívny proces. Kúsky biochemického hlavolamu sa snažil nájsť a poskladať celé roky. Aj keď sa mu ho nepodarilo vyriešiť celý, svojím výskumom prispel k objasneniu jeho dôležitej časti. Po prečítaní Knoop-Martiusovho článku sa pokúsil hypotézu prepracovať z iného uhla pohľadu. Po pár dňoch rozmýšľania a experimentovania si naplno uvedomil, že prepojenie oboch koncov Knoop-Martiusovej dráhy je ďalším biochemickým cyklom. Krebsovým kreatívnym momentom bolo napokon správne rozpoznanie toho, čo pred ním nikto iný nerozpoznal.