Abstract

新奇原生生物SRT308株が明らかにするユーグレノゾアの初期進化.

ユーグレノゾアはディスコバに属する原生生物の一群であり、光合成性の藻類であるユーグレナ類を始めとして、ヒトの病原体として知られるTrypanosomaを含むキネトプラスト類や、海産の藻類捕食者であるディプロネマ類等を含む巨大な分類群である。ユーグレノゾアは鞭毛に付随するパラキシアルロッド、管状の射出装置、複雑な捕食装置、円盤状のミトコンドリア（Mt）クリステ等によって他のディスコバ生物とは明確に区別される。また、Mtゲノムは他のディスコバ生物に比べて少数の遺伝子をコードしており、系統ごとに特徴的な構造を有することが知られている。

今回我々はユーグレノゾアの特異な細胞構造及びMtゲノムの進化を明らかにするため、ユーグレノゾアに近縁な新奇原生生物であるSRT308株について分子系統解析、微細構造観察及びMtゲノム解析をおこなった。153遺伝子を用いた分子系統解析からは、SRT308株はユーグレノゾアの最も基部から分岐することが明らかとなった。電子顕微鏡観察からは、本生物がユーグレノゾアとよく似た微小管性鞭毛根や円盤状のMtクリステをもつ一方で、パラキシアルロッドや管状の射出装置を欠いていることが示された。Mtゲノム解析からは、SRT308株がユーグレノゾア以外のディスコバ生物に見られるような典型的な環状のMtゲノムをもち、比較的少数の遺伝子をコードしていることが明らかとなった。本発表では、今回明らかになったSRT308株の特徴から、ユーグレノゾアの初期進化を考察する。

有孔虫の大規模分岐年代推定.

「生物はいつ誕生したのか？」これは古生物学だけでなく地球科学においても根幹的な問いである。祖先真核生物が誕生し、現在の主要真核生物系統に多様化していったことは議論の余地はないが、それではこの進化いつどのようにして起こったのであろうか？近年の大規模遺伝子解析により、主要真核生物系統の系統関係は明らかになりつつある。しかし、その分岐時期に関してはいまだに高精度に推定されているとは言い難い。その理由として、a)曖昧な化石記録、b)分類群サンプリングの偏りが挙げられる。この問題を解決することで分岐年代推定の解像度が改善されるかを検証するために、堅牢な化石記録を持つ微化石生物に着目し、有孔虫・放散虫・珪藻・渦鞭毛藻を含む真核生物主要系統であるSARグループの大規模分岐年代推定を行うことにした。しかし、微化石生物の中で有孔虫の分子データは非常に限られており、そのことで有孔虫内の系統関係もあやふやな状態であった。そこで、有孔虫の分子データを拡充し、①有孔虫内の系統関係を明らかにし、②堅牢な化石記録に基づき、分類群サンプリングも十分に行ったSARグループの大規模分岐年代推定を行った。その結果、①有孔虫内の系統関係を高い系統学的支持で復元することに成功し、②放散虫と有孔虫の分岐時期がカンブリア紀前期（502-523 Ma）であることがわかった。これは捕食者の目が発達した時代であり、捕食圧が高まったことが放散虫と有孔虫の分岐を促したことがわかった。また、放散虫・有孔虫ともに硬殻を持つ系統がその直後に出現しており、硬殻が外敵の防御から獲得された形質であるとすると、高い捕食圧が放散虫と有孔虫の進化を加速させた可能性が示唆された。

有中心粒太陽虫類におけるミトコンドリアゲノムの比較解析.

ミトコンドリアは真核生物の祖先にα-proteobacteriaが細胞内共生したことによって誕生したオルガネラだが、その内部にはバクテリアに由来するミトコンドリアゲノム(mtDNA)が存在する。起源は共通であるが、mtDNAは系統ごとに独自の進化を遂げ、サイズ、遺伝子組成、ゲノム構造、可動遺伝因子などの点で真核生物の中で非常に多様化している。しかし現在までに解読されたmtDNAの大部分は動物、植物、菌類で占められており、真核生物の多様性を網羅しているとは言い難いのが現状である。

有中心粒太陽虫類は従属栄養性の原生生物で、核コード遺伝子を用いた最新の大規模分子系統解析から、ハプト藻類と近縁であることが示されている。核ゲノム情報が集中的に調べられた一方で、mtDNAについては未着手であったので、我々は本系統群に属するPolyplacocystis contractilis NIES-2498と未記載種Marophrys sp. SRT127のmtDNAを解読した。両種のmtDNAはゲノムサイズ、遺伝子組成、転移性イントロンの種類などは共通していたが、シンテニーは異なっており、共通祖先から分岐したあとに数度のゲノム再編成があったものとみられる。またP. contractilisのmRNAではシチジンがウリジンに変換されるC-to-U RNAエディティングが600箇所以上で確認されたが、Marophrys sp.ではこのような転写後修飾は確認されなかった。C-to-U RNAエディティングは陸上植物とヘテロロボサ類のオルガネラでも知られており、どちらの生物群でもDYW型PPRタンパク質がC-to-U RNAエディティングで中心的な役割を果たしていると考えられている。そこでP. contractilisとMarophrys sp.のトランスクリプトームデータを取得ところ、興味深いことにC-to-U RNAエディティングが発見できなかったMarophrys sp.からもDYW型PPRタンパク質が検出された。このことは(1) 有中心粒太陽虫類は C-to-U RNAエディティングの成立に先立ってDYW型PPRタンパク質を獲得した、あるいは(2)有中心粒太陽虫類の共通祖先でC-to-U RNAエディティングが成立していたが、Marophrysに至る系統では二次的に喪われた、のどちらかを示唆している。

Evolutionarily distinct gene-sets for autophagosome formation in dinoflagellates harboring endosymbiotic diatoms.

Autophagy is an intracellular degradation mechanism by which cytoplasmic materials are delivered to and degraded in the lysosome, and proposed to have been established at an early stage of eukaryotic evolution. Dinoflagellates harboring endosymbiotic diatoms (so-called “dinotoms”), which retain their own nuclei and mitochondria in addition to plastids, have been investigated as an intermediate toward the full integration of a eukaryotic alga into the host-controlled organelle (i.e. plastid). Pioneering studies systematically assessed the degree of the host governance on a number of metabolic pathways in dinotoms. However, little attention has been paid to the impact of the endosymbiotic lifestyle on the autophagy operated in the diatom endosymbiont. In this study, we searched ATG3, 4, 5, 7, 8, 10 and 12, which are required for autophagosome formation, in the RNA-seq data from two different dinotom-harboring dinoflagellates. We detected two sets of the ATG homologues in each of the two RNA-seq data -- one was placed within the clades of the homologues of free-living diatoms and the other showed an intimate affinity to the dinoflagellate homologues. These results suggest that dinotom-harboring dinoflagellates maintain two evolutionarily distinct sets of the factors for autophagosome formation, one of which is most likely operated in the cellular compartment derived from the endosymbiotic diatom. To examine whether the diatom endosymbionts operate autophagy that is equivalent to those in yeasts and mammals, we need to survey the factors involved in initiation and protein degradation for autophagy.

Phylogenomic analysis assessing the positions of “orphans” including Microheliella maris.

Deep branching lineages in the tree of eukaryotes are potentially represented by some of “orphan” species, of which phylogenetic positions remain uncertain in previous studies. In this study, we generated transcriptomic data from “orphans” including a heliozoan-like unicellular eukaryote Microheliella maris, and assembled a phylogenomic alignment containing 338 genes (98,904 amino acid positions in total). Maximum-likelihood (ML) analyses of “338-gene” alignment robustly reconstructed major taxonomic assemblages, such as (1) SAR, (2) Haptista, (3) Cryptista, (4) Discoba, (5) Metamonada, (6) CRuMs and (7) Amorphea. M. maris was placed at the basal position of the Cryptista clade (including Palpitomonas blix) with full statistical support. As little morphological characteristic is shared between M. maris and cryptists, it is not appropriate to consider M. maris as members of Cryptista. Rather, M. maris likely hints a previously overlooked lineage that is closely related to Cryptista. Besides M. maris, two undescribed “orphans” were placed separately within CRuMs, and another “orphan” was united with malawimonads in 338-gene phylogeny.

Genome analysis of a symbiotic nitrogen-fixing cyanobaterium in a pelagic dinoflagellate, Histioneis depressa.

Acquisition of organic nitrogen compounds is crucial for protists inhabiting oligotrophic pelagic environments. In this regard, symbiosis with a nitrogen-fixing cyanobacterium has emerged as a promising strategy to secure a nitrogen source. Past studies reported various protists from a broad phylogenetic range have established symbiotic relationships with nitrogen-fixing cyanobacteria and some of these symbionts are known to be ecologically important (i.e., UCYN-A cyanobacteria in symbiosis with haptophytes). However, only a limited member of nitrogen-fixing cyanobacterial symbionts has been subjected to the studies using molecular techniques (e.g., whole genome sequencing).

Pelagic dinoflagellate species Histioneis spp. (Dinophyceae, Dinophysiales) are known to possess prominent chambers enclosed by developed cingular lists for hosting cyanobacterial symbionts. A previous study showed that Histioneis depressa possesses two morphologically distinct types of cyanobacterial symbionts and at least one of the two is most likely to have nitrogen-fixation capacity. However, mainly due to difficulties in sample collection and cultivation, further features of this cyanobacterial symbiont, including genetic or metabolic characteristics are unclear.

Here, we amplified and sequenced the genome of symbiotic cyanobacteria isolated from a single H. depressa cell collected from a marine environment. The draft genome sequence of the symbiont displayed high similarity to those of marine nitrogen-fixing cyanobacteria Crocosphaera spp. and was shown to code protein components for nitrogenase, confirming its nitrogen-fixation ability. In this presentation, the symbiotic relationship between the cyanobacterial symbiont and the host will be discussed on the basis of the metabolic capacity of the H. depressa symbiont deduced from its genome information. Further, we will also discuss the distribution and behavior of this cyanobacterial lineage in natural environments based on results of metagenomic analyses.E

Distribution of plant-type mitochondrial C-to-U RNA editing in diverse eukaryotes.

C-to-U RNA editing in land plants converts the specific cytidines in mitochondrial and plastid transcripts into uridines. RNA binding PPR (pentatricopeptide repeat) proteins with DYW motif of probable cytidine deaminase are the key factor of C-to-U RNA editing in land plants. Two heterolobosean protists, which are distantly related to land plants, were also revealed to encode DYW-type PPR proteins and their mitochondrial transcripts undergo C-to-U RNA editing (Rüdinger et al. 2011, Fu et al. 2014). The co-occurrence of mitochondrial RNA editing and DYW-type PPR proteins in the phylogenetically distant groups motivated to survey PPR proteins in various eukaryotes (Schallenberg-Rüdinger et al. 2013), and they suggested that Malawimonas jakobiformis, which is distantly related to land plants or heteroloboseans, potentially have plant-type C-to-U RNA editing system. Now that the next generation sequencing data are available in the broader lineages of eukaryotes than in the past, we re-investigated the distribution of DYW-type PPR proteins in eukaryotes. Besides of land plants and heteroloboseans, we identified DYW-type PPR protein genes in Centrohelida, Dinoflagellata, Foraminifera, and Plasmodiophora brassicae. In the presentation, we will discuss whether these organisms employ plant-type C-to-U RNA editing on their mitochondrial transcripts.

A novel type of mitochondrion-localized DNA polymerase unites orphan eukaryotes into a new ‘supergroup’.

Mitochondrial genomes are replicated by the nucleus-encoded proteins including DNA polymerases. So far, evolutionarily distinct types of DNA polymerase involved in mitochondrial genome (mtDNApol) have been known. “DNA polymerase Gamma” and “PolIA-D” have been known as mtDNApol in human and yeast, and trypaonsomatids, respectively. Separately, “plant and protist organellar DNA polymerase” has been identified as mtDNApol mainly in photosynthetic eukaryotes but also in some heterotrophic species. All of the three mtDNApol types bear sequence similarity to bacterial DNA polymerase I (PolI). In this study, we surveyed PolI-like polymerases (PolI-like pol) in the transcriptome/genomic data from heterotrophic eukaryotes to depict the evolution of mtDNApol. Curiously, we noticed that Discoba, Malawimonadida and Ancyromonadida possess none of the three mtDNApol types but share a previously-undescribed PolI-like pol. The novel PolI-like pol were predicted to bear typical mitochondrial-targeting signals at the N-termini, arguing strongly that these polymerases are localized in mitochondria. The mitochondrion-localized PolI-like pol shared among Discoba, Malawimonadida and Ancyromonadida prompts us to propose a novel ‘supergroup’ in eukaryotes. If the PolI-like pol reported here were the ancestral type of mtDNApol, Discoba, Malawimonadida and/or Ancyromonadida are significant to root of the eukaryotic tree.

新奇真核微生物の探索と細胞内共生に伴う宿主ゲノムの進化：真核生物初期進化の理解に向けて．

単一の共通祖先から現存する真核生物系統群が、どんな順番で、どのような進化過程を経て多様化したのかは十分に理解されていない。この原因の一つは、真核生物の多様性を占める単細胞真核生物（真核微生物）の真の多様性を把握できていないことである。また、細胞内共生を通じたオルガネラの獲得は、真核生物の細胞とゲノムの進化を考えるうえで重要なイベントである。しかし、どのような進化過程を経て共生細胞がオルガネラ化したのか、その実態は十分に理解できているとは言えない。これまで私の研究グループは、(1) 自然環境から新奇真核微生物を単離し、その系統的位置を解明することにより真核生物の多様性の把握と初期分岐の復元を目指している。また、(2) オルガネラ確立にともなう細胞内共生体と宿主間での遺伝子転移の検出とその傾向について研究を行っている。今回のセミナーでは、上記2点について最近の研究成果を紹介したい。

Re-exploration of the protein performing plant-type C-to-U RNA editing in diverse eukaryotes.

C-to-U RNA editing in land plants converts the specific cytidines in mitochondrial and plastid transcripts into uridines. RNA binding PPR (pentatricopeptide repeat) proteins with DYW motif of probable cytidine deaminase are the key factor of C-to-U RNA editing in land plants. Two heterolobosean protists, which are distantly related to land plants, were also revealed to encode DYW-type PPR proteins and their mitochondrial transcripts undergo C-to-U RNA editing (Rüdinger et al. 2011, Fu et al. 2014). The co-occurrence of mitochondrial RNA editing and DYW-type PPR proteins in the phylogenetically distant groups motivated to survey PPR proteins in various eukaryotes (Rüdinger et al. 2013), and they suggested that Malawimonas jakobiformis, which is distantly related to land plants or heteroloboseans, potentially have plant-type C-to-U RNA editing system. Now that the next generation sequencing data are available in the broader lineages of eukaryotes than in the past, we re-investigated the distribution of DYW-type PPR proteins in eukaryotes. Besides of land plants and heteroloboseans, we identified DYW-type PPR protein genes in Centrohelida, Dinoflagellata, Foraminifera, and Plasmodiophora brassicae. As suggested by the presence of DYW-type PPR protein, we identified hundreds of C-to-U RNA editing in the mitochondrial genome of a centrohelid Polyplacosystis contractilis NIES-2498. We further discuss whether the rest of the lineages listed above employ plant-type C-to-U RNA editing on their mitochondrial transcripts.

真核生物におけるSMCタンパクファミリーの多様化と二次的喪失．

ATPaseスーパーファミリーに属するSMCタンパク質は、染色体の構造維持に必須である。真核生物では6つのSMCパラログ（SMC1-6）が、3種類のヘテロ二量体を形成する。SMC1-3とSMC2-4二量体は、それぞれ染色体分離の際に姉妹染色体を束ねるコヒーシンと染色体を凝集させるコンデンシンを構成する一方、SMC5-6二量体はDNA修復に関わる。2004年に発表された先行研究はSMCタンパク質の系統解析基づき、真核生物におけるSMCタンパク質ファミリーの進化モデルを提唱した。しかし当時解析された配列データは真核生物の多様性を十分に俯瞰しているとはいえないため、本研究では多様な真核微生物を対象にSMC1-6を探索し、新たな配列データをもとに系統解析を行った。我々の解析結果は先行研究の結論とは矛盾しなかったが、SMC5と6の両方あるいはどちらか片方を二次的に欠失した系統を複数検出した。

ユーグレノゾアにおけるミトコンドリア局在DNAポリメラーゼの進化.

ミトコンドリア（mt）でのDNA複製には核コードのDNAポリメラーゼが必要である。これまで動物や酵母のmtでは”PolG”が、広範な真核生物のmtでは”POP”がDNA複製に関わっていることが判明している。ユーグレノゾアを構成する主要系統群の１つであるキネトプラスト類に属するトリパノソーマ原虫のmtでは、PolGともPOPとも異なる4つの タンパク質（PolIA，B，C ＆ D）がDNA複製に関わることが実験的に示されている。本研究ではキネトプラスト類とその近縁系統である ディプロネマ類とユーグレナ類においてmt局在DNAポリメラーゼ（mtDNApols）を探索し、トリパノソーマPolIA-Dの起源を解明することを目指した。我々の解析結果は、上記3系統の分岐と共にmtDNApolsが段階的に変遷・多様化したことを示唆する。

ゼロから始める大規模分子系統解析．

原生生物研究において、研究対象生物の正確な系統的位置を知ることは非常に重要である。これまでの研究においては、系統的位置を推測する方法として、SSU rDNAなどの真核生物に保存的な分子マーカーを用いた単一遺伝子系統解析が広く行われてきた。しかし、対象生物が真核生物進化の比較的早期に分岐したと考えられる場合や既存の系統に属さない場合は、単一遺伝子の情報量ではその系統的位置を正確に推測できないことが多い。この問題に対する、一つの解決策が大規模分子系統解析である。近年のシーケンス技術の長足な発展で、大規模配列データを簡便に取得でき、200を超える遺伝子セットによる大規模分子系統解析が可能となった。実際に、系統的帰属が不明な新奇真核生物の系統的位置が続々と解明されてきている。今回、大規模分子系統解析の概要とそのケーススタディを紹介し、新しく原生生物研究を始めた研究者への大規模分子系統解析を始める足掛かりとしたい。

翻訳終結因子Cドメインにみられる部分的欠失の進化とタンパク質機能・構造に与える影響

翻訳終結因子eRF1のアミノ酸配列を系統的に広範な真核生物間で比較したところ、微胞子虫ホモログのCドメインに30~40アミノ酸残基の欠失を発見した。微胞子虫類の近縁系統がもつ（部分的欠失のない）eRF1アミノ酸座位の置換速度の解析では、微胞子虫ホモログの部分的欠失に相当する領域の機能的制約が弱いことが示唆された。また分子動力学シミュレーションにより、Cドメインの部分的欠失はeRF1立体構造に大きな影響を及ぼさないと推測された。従って、微胞子虫eRF1-Cドメインに発見された部分的欠失は機能的に中立であると考えられる。また古細菌は、真核生物eRF1と相同な翻訳終結因子（aRF1）をもつ。aRF1配列を精査したところ、微胞子虫eRF1と相同な部分的欠失が複数の古細菌系統のaRF1配列で発見された。eRF1と同様に、aRF1-Cドメインの当該領域の欠失は機能的に中立だと考えられる。

フィロジェノミック解析により推測されたMicroheliella marisの系統的位置.

真核生物がどのように多様化したのか、また現存の系統のうちどの系統がもっとも原始的なのか等の真核生物大系統間の系統関係は、地球上の生物進化を理解する上で不可欠な情報である。これまでの解析で系統的位置がはっきりと解明されていない‟orphan生物”の中には真核生物の初期分岐を解明する上でカギを握る生物が含まれる可能性が高い。本研究では、orphan生物の一種であるMicroheliella marisの系統的位置を、338遺伝子データに基づくフィロジェノミック解析により検討した。M. marisは軸足をもつアメーバ状真核微生物の一種であり、これまでに詳細な顕微鏡観察と187遺伝子データに基づく分子系統解析がおこなわれたが、その系統的位置を確定することが出来なかった。本研究ではM. marisからトランスクリプトームデータを取得し、この配列データを用いて338遺伝子から構成される分子系統解析用アライメントを作成した。この338遺伝子データを最尤法により解析したところ、①M. marisはクリプチスタ生物群にふくまれるクリプト藻、ゴニオモナス、カタブレファリス類、Palpitomonas bilixとともにブートストラップ値100%で支持される単系統群を形成すること、②このクレード中でM. marisは最も基部から分岐することが判明した。典型的なクリプチスタの形態的特徴をもたないM. marisがクリプチスタ生物と極めて強い近縁性を示したことから、クリプチスタの初期進化、さらには真核生物の初期進化を理解する上で重要な生物であると考えられる。

有孔虫Ammonia beccariiのミトコンドリアに局在するDNA分子群．

真核生物はすべてミトコンドリアを持っており、その共生イベントは真核生物の誕生と密接に関わると考えられている。これまでミトコンドリアの起源は複数遺伝子解析で行われてきたが、ミトコンドリアはゲノム縮退が進んでおり、使用できる遺伝子数が少ない。これまでの解析では、ミトコンドリアはαプロテオバクテリアに近縁であることが示唆されたが、その信頼性はそれほど高いものではなかった。この問題は、できるだけ遺伝子種数の多いミトコンドリアゲノムを新たに発見し、解析に用いることで解決できる可能性がある。

有孔虫はRhizariaに含まれる単細胞真核生物であり、大きな細胞（300µm程度）を持ち、細胞内に多くのミトコンドリアを持つという特徴がある。有孔虫の多くは難培養であり、真核生物全体の中でミトコンドリアゲノム情報が欠けている数少ないグループであった。そこで、本研究では有孔虫Ammonia beccariiの培養株をもちいてミトコンドリアゲノムの解読を試みた。その結果、有孔虫ミトコンドリアゲノムと思われる配列として、GC含量の多い256 kbpの環状DNA分子（High_GCゲノム）1種類と、GC含量の少ない24~227 kbpの14種類の線状・環状DNA分子（Low_GCゲノム）が見つかった。これまで知られている最もタンパク質コード遺伝子数が多いミトコンドリアは、約60種類程度のタンパク質をコードするヤコバ類のミトコンドリアであるが、驚くべきことにHigh_GCゲノム上には95遺伝子、Low_GCゲノム上には108遺伝子が同定された。in situハイブリダイゼーション実験結果から、これら複数のDNA分子はいずれも有孔虫細胞内のミトコンドリアに局在すると考えられる。本発表ではこの有孔虫ミトコンドリア局在DNA分子群にコードされる遺伝子の機能と起源について解析した結果を紹介する。