Abstracts

新規エクスカバータ鞭毛虫 Tsukubamonas globosa gen. et sp. nov. の分類学的・系統学的研究

We report the ultrastructure and phylogenetic position of a free-living heterotrophic flagellate Tsukubamonas globosa gen. et sp. nov. This flagellate was isolated from a pond in the campus of University of Tsukuba. The cell is spherical and its size is approximately 15 µm in diameter. Light microscopic observations revealed that the cell is naked and highly vacuolated, and the vegetative cells are always swimming with rotating moation. Although the light microscopy show no clear affinity to any taxonomic groups, our electron microscopic observations revealed that T. globosa possessed a shallow but typical ventral feeding groove that is one of the hallmark characteristics of the supergroup Excavata (Simpson and Patterson 1999). The multigene phylogeny using α-tubulin, β-tubulin, Actin, 90 kDa heat shock protein, and translation elongation factor 2 also showed that T. globosa belongs to a subgroup in Excavata, “Discoba,” which is proposed as a phylum or super phylum level by several recent studies. There are three major groups in “Discoba” (euglenozoans, heteroloboseans and jakobids). Although the detailed position of T. globosa in the “Discoba” clade could not be resolved by the present analyses, some ultrastructural similarities to other members in “Discoba” were recognized. In conclusion we considered that taxonomically and phylogenetically T. goloosa is a novel and missing-link protist within “Discoba”.

【目的】 近年の様々な原生生物における網羅的発現遺伝子解析や単細胞PCR法を用いた研究によって、これまで所属不明として扱われてきた多くの原生生物の系統学的・分類学的位置が明らかになってきた。その一方、野外には未だ多くの新規原生生物が未発見のまま存在している（例えばEpstein and López-García 2008）。このような生物種は「missing-link」として、複雑な生物進化を解明する糸口を提供する可能性がある。TKB-055株は筑波大学構内の兵太郎池で獲得したサンプルより確立した従属栄養性の原生生物である。予備的な観察からは本株の既知の生物群に対する明確な類縁性は確認されず、本株が高次レベルで新規原生生物である事が示唆された。本研究ではより詳細な形態観察と系統的位置の推定を行い、本株の分類学的位置の決定を目的とした。

【方法】 光学顕微鏡観察は生細胞を用いて行った。透過型電子顕微鏡観察は、一般的な試料作成法の一つであるEikrem and Moestrup (1998)に準拠して作製した試料から連続切片を作製し観察した。培養細胞よりDNAを抽出し、これをテンプレートとしSSU rDNAの塩基配列を決定した。培養細胞よりtotal RNAを抽出後、これをテンプレートにcDNAを合成した。このcDNAをテンプレートにし、α-tubulin, β-tubulin, Actin, 90 kDa heat shock protein, translation elongation factor 2をコードする遺伝子配列を決定した。系統解析は最尤法を用いて行った。タンパク質コードの遺伝子は対応するアミノ酸配列に変換後、それぞれの配列ごとにパラメーターを最適化するSeparateモデルを用いて解析を行った。

【結果, 及び考察】 光学顕微鏡観察からTKB-055株は二本鞭毛性の球状細胞で大きさはおよそ直径15 µmであった。細胞内には複数の液胞が存在する事が確認された。また栄養細胞は常に回転（自転）するという特徴的な遊泳様式を示した。電子顕微鏡による観察の結果、本株の細胞内にはGolgi体や核膜より生じる典型的な小胞体は確認されなかった。その一方で細胞端に浅いVentral feeding groove（以下、VFG）と呼ばれる構造が確認された。VFGはExcavata生物群の特徴として知られる、微小管で裏打ちされた補食に関係する溝構造である (Simpson and Patterson 1999)。Excavataは真核生物の巨大生物群の一つであり、MetamonadaとDiscobaという２つのサブグループに分けることが提唱されている（例えばHampl et al. 2009）。今回行ったSSU rDNAによる系統解析では、TKB-055株の位置を特定することが出来なかったが、複数遺伝子解析の結果Discoba クレードに含まれる事が強いサポートをもって示された。以上の結果は本株がこれまで認識されていなかった新たなExcavata生物である事を示すものであり、これより分類学的にはTKB-055株をDiscobaに含まれる新規原生生物Tsukubamonas globosa gen. et sp. nov.として扱う事が妥当であると結論した。本研究ではDiscoba clade内でのT. globosaの詳細な系統的位置は解明出来なかったが、電子顕微鏡による観察結果をもとに立体構築した本株の鞭毛装置構造からはDiscoba内のサブグループであるHeteroloboseaとJakobidaのそれに対する類縁性が確認された。これはT. globosaがDiscoba内での形態的進化のカギを握る生物で特にHeterolobosea – Jakobida間をつなぐ生物である可能性を示している。

【参考文献】Simpson AG, Patterson DJ (1999) Europ J protistol 35: 353–370; Epstein S, López-García P (2008) Biodivers Conserv 17: 261–276; Eikrem W, Moestrup O (1998) Phycologia 37: 132–153; Hampl V, Hug L, Leigh JW, Dacks JB, Lang BF, Simpson AG, Roger AJ (2009) Proc Natl Acad Sci USA 106: 3859–3864

エピテミア科珪藻類共生体spheroid bodyの進化

真核生物の多様性・進化を考える上で、真正細菌類の細胞内共生を通じた、ミトコンドリア・葉緑体等のオルガネラ獲得は重要なイベントである。細胞内共生真正細菌からオルガネラへと変化する過程は、その中間段階にあると考えられる多様な生物種を用いたアプローチが有効であると考えられているが、これまでの研究により十分に理解されているとはいえない。エピテミア科の珪藻Epithemia, Rhopalodia は、葉緑体・ミトコンドリアとは独立な、シアノバクテリア共生体を細胞内に持つことが知られている。このspheroid bodyと称される共生体は、珪藻細胞内の他のオルガネラ同様、娘細胞へと受け継がれる。さらにこれまでのspheroid bodyの観察より (1)クロロフィルの自家蛍光がない、(2)チラコイド膜が未発達である、(3)フィコビリソームが存在しないことが分かっている。このような特徴から光合成能を欠くと考えられ、自由生活性のシアノバクテリアと比べて極めて特異である。これらのことは、共生体が珪藻に依存し、制御を受けていることを示唆している。また、spheroid bodyは、窒素固定を行い、その窒素化合物をホストに供給していると考えられている。エピテミア科珪藻細胞内のspheroid bodyの状態は、細胞内共生シアノバクテリアがオルガネラ化する初期段階とも考えうる。

このようにエピテミア科珪藻と共生シアノバクテリアは細胞内共生によるオルガネラ化という生物進化における一大イベントを考える上で大変興味深いが、細胞学的・分子生物学的研究は近年Rhopalodia gibbaのみにとどまっており、spheroid bodyが単一起源か否かを含めて、進化については不明な点が多い。

本研究ではエピテミア科珪藻共生体の起源・進化について考察するため、筑波大学構内を含めた４つの採集地から得られたEpithemia, Rhopalodiaを材料とし、形態観察および共生体の16S rDNA、ホストの18S rDNAの系統解析を行った。単細胞PCRによる系統解析の結果、今回用いたエピテミア科複数種の共生体から得られた配列は、2004年にJulia et al.が報告したRhopalodia gibba共生体のものに極めて類似度が高く、エピテミア科共生体は大変高いブートストラップ確率で単系統群を形成した。さらに共生体の系統はホストであるエピテミア科珪藻の系統と一致していた。以上のことからエピテミア科珪藻の共生体は単一起源であり、エピテミア科珪藻はその共通祖先細胞で１度共生体を獲得した後、種分化してきたと考えられる。新たな細胞内共生のモデルとして、このエピテミア科珪藻と共生体の相互関係を探ることにより、細胞内共生を通じたオルガネラ獲得過程の一端を解明することが可能であろう

Searching for the origin of green-colored plastids in the dinoflagellate Lepidodinium chlorophorum.

Most of photosynthetic dinoflagellates possess red alga-derived, peridinin-containing plastids. However, multiple dinoflagellate lineages are known to secondarily replace the original peridinin-containing plastids by plastids of other eukaryotic algae via endosymbioses. The dinoflagellates belong to the genus Lepidodinium are one of the lineages bearing non-canonical plastids containing chlorophylls a and b. Based on preliminary analyses of pigment composition, it is widely believed that Lepidodinium plastids were derived from a prasinophycean green alga. However, this hypothesis has not yet been fully examined by molecular phylogeny. In our previous multi-gene analysis (Takishita et al. 2008 Gene 410: 26-36), the taxon sampling of members of Prasinophyceae was inadequate — Prasinophyceae, which is known to be paraphyletic and can be sub-divided into several groups, was represented by only two species, Ostreococcus tauri and Nephroselims olivacea. Here, we re-visited the origin of Lepidodinium plastids by analyzing a new multi-gene data set with much better sampling of Prasinophyceae. Eleven plastid-encoded genes (psaA–B, psbA–D, atpA–B, petD, tufA, and rbcL) were newly sequenced from six prasinophycean algae, one ulvophycean alga, and one pedinophycean alga. In the 11-gene phylogeny, Lepidodinium showed no affinity to any prasinophycean algae, but robustly grouped with members of “core chlorophytes“ comprised of Tetrasemlis spp., Ulvophyceae, Trebouxiophyceae, and Chlorophyceae. The results presented here clearly indicate the green plastids in Lepidodinium are derived from a alga belong to core-chlorophytes.

Evolution of the mitochondrial genomes from two closely related raphidophytes Chattonella marina and Heterosigma akashiwo.

Increasing accumulation of mitochondrial (mt) sequence data from various eukaryotic lineages has revealed the diversity of genome size, gene content, and gene order of this organelle. Since mitochondrion has been acquired once in the last common ancestor of whole extant eukaryotes, the diversity of mt genomes was likely generated after divergence into extant eukaryotes. Complete mt genome sequences of a large protist assemblage called stramenopiles unveiled so far indicated few gene orders were conserved in this group, but a mechanism for the variable gene order in stramenopiles remains unsolved. In this study, we completely sequenced the mt genomes of Chattonella marina (Subrahmanyan) Hara et Chihara and Heterosigma akashiwo (Hada) Hada, which are members of stramenopiles. Genome organizations of both species are nearly identical with a few differences which can be explained by inversion of gene clusters and transpositions of two tRNA genes. Close investigation of and comparison between the two mt genomes detected high sequence similarity between trnN-orf54 and a tRNA-like region (called trnX region) in C. marina mt genome. This observation provides an evidence of partial genome duplication event of trnN-orf54 fragment in C. marina mt genome followed by substitution and deletion events causing the trnX region missing orf54 copy after divergence into Chattonella and Heterosigma. Further survey of the duplicated regions in 8 other Chattonella spp. strains indicated the duplication took place early in Chattonella evolution and the subsequent deletion events stepwise but independently occurred among the strains used. Our observation suggests inversion, transposition, and duplication-random loss may be primary driving forces for mt genome evolution in stramenopiles.

Origin of nitrogen-fixing cyanobacterial symbionts in epithemiacean diatoms.

Diatoms of the family Epithemiaceae possess endosymbiotic cyanobacteria termed spheroid bodies in their cells. The spheroid body cannot grow outside of the host cell and is vertically inherited like other endosymbiotic organelles. It is generally accepted that these endosymbionts lack the ability of photosynthesis, but fix nitrogen and provides the fixed products to the host cells. From these characteristics, the possibility has been discussed that the spheroid body is a nitrogen-fixing organelle derived from an endosymbiotic cyanobacterium.

The spheroid bodies in the diatom cells can provide new insights into the process establishing organelles in eukaryotic cells. However, neither molecular data of the spheroid body (except those of Rhopalodia gibba) nor those of the host cells have been reported so far. To understand the first step of the evolutionary process from a free-living cyanobacteium to the spheroid body, we isolated both host and endosymbiont SSU rDNA sequences from three epithemiacean diatoms Epithemia turgida, Epithemia sorex, and Rhopalodia gibba.

The phylogeny of host SSU rRNA sequences clearly indicated the monophyly of epithemiacean diatoms. Consistent with the host phylogeny, the spheroid bodies formed a robust clade in the radiation of cyanobacteria. Therefore, we conclude that the spheroid body has been vertically inherited from the common ancestor to the extant epithemiacean diatoms.

202万樹形に対する網羅的探索結果に基づく発見的樹形探索法の効率評価

実データから最尤系統樹を推定する場合、一般的に各種発見的樹形探索法が用いられる。この解析から得られる「最尤系統樹」は、配列データから生成可能なすべ ての樹形に対する尤度を計算した結果ではないため、真の最尤系統樹かどうかの保証がない。本研究では、10 taxaを含む約300データセットを解析し、生成可能な2,027,025樹形に対する網羅的尤度計算から真の系統樹を得た。次に同じアライメントを用 いて発見的樹形探索を行い、その結果が網羅的探索からの結果と一致しているか否かを検討した。各10 taxonデータセットから近隣結合法と逐次付加法により初期系統樹を作成し、その後Nearest neighbor interchange（NNI）法とsubtree pruning & regrafting（SPR）法を用いて探索を行った。驚くべきことに、NNI法とSPR法の探索効率は極めて悪く、発見的樹形探索の結果は初期系統樹 に大きく依存することが判明した。一方、1データあたりの初期系統樹の数を増加させることにより、最尤系統樹の発見効率を大きく改善することができること が分かった。

エピテミア科珪藻類共生体spheroid bodyの進化

エピテミア科の珪藻類Epithemia spp.とRhopalodia spp. は、葉緑体・ミトコンドリアに加えて、シアノバクテリアを起源とする細胞内共生体（spheroid body）を持つ。これまでの研究から、spheroid bodyは珪藻細胞外では増殖できず、珪藻細胞内で窒素固定を行っていることが分かっている。従って、エピテミア科珪藻とその共生体は、細胞内共生からオ ルガネラ化へ至る過程を研究するための新たなモデルとなりうる。ところが細胞学的・分子生物学的研究が行われているのはR. gibbaだけであり、エピテミア科珪藻類におけるホスト‐共生体の進化に関する基本的情報が不足している。本研究ではspheroid bodyの起源・進化を解明するため、日本各地から単離・株化したEpithemia属・Rhopalodia属 珪藻類を材料とし、共生体の16S rDNA、ホストの18S rDNA遺伝子の単離と系統解析を行った。その結果、エピテミア科共生体・ホストともには単系統群を形成した。つまり、spheroid bodyは単一起源であり、エピテミア科珪藻類の共通祖先で獲得されたと考えられる。

ラフィド藻類ミトコンドリアゲノムの進化

ス トラメノパイル類は光合成性および従属性、寄生性生物を含む多様な真核生物によって構成される巨大生物群である。本生物群におけるミトコンドリアゲノム （mtDNA）は、ゲノム構造や遺伝子組成が多様であることが知られている。本研究において我々は、光合成性ストラメノパイル類であるラフィド藻類近縁種 2種Chattonella marinaとHeterosigma akashiwoの全mtDNA塩基配列を決定した。前者のmtDNAは44,772 bp、後者のmtDNAは39,690 bpの環状ゲノムであることが判明した。C. marina mtDNAのアラニンtRNA遺伝子がアスパラギンtRNA遺伝子の重複によって生じ、H. akashiwo mtDNAのORF404およびORF189/ORF168が重複によって生じたと考えられた。さらに推定遺伝子重複領域の塩基配列を様々な近縁種ならび に株で決定したところ、部分重複イベント後、近縁種・株間でランダムな欠失が起こっていることが判明した。この小さな進化スケールでおこる部分重複と欠失 の蓄積が、mtゲノムの大規模構造変化の主要原因の1つと推定された。

クロロフィルa, bを持つ緑色渦鞭毛藻類Lepidodinium chlorophorumの葉緑体起源

光合成渦鞭毛藻の多くは、chlorophyll cを 持ち、カロテノイド系色素としてペリディニンを持つ葉緑体を保持している。渦鞭毛藻類の祖先型葉緑体は、ペリディニンタイプであり、二次共生した紅藻類に 由来すると考えられている。渦鞭毛藻類の中には、祖先型葉緑体を一度手放した後、三次共生により新たな葉緑体を獲得した生物種も知られている。渦鞭毛藻Lepidodinium chlorophorumは、祖先型葉緑体ではなく、chlorophyll bを含む緑色の葉緑体を保持している。L. chlorophorum葉緑体からプラシノ藻特有の色素を検出したとの報告もあり、この渦鞭毛藻類葉緑体はプラシノ藻起源であると考えられている。しかし、８種類の葉緑体遺伝子配列に基づく分子系統解析では、L. chlorophorum葉緑体はプラシノ藻類との近縁性を示さなかった。今回、６種のプラシノ藻類と３種の緑藻類から、新たに11 種類の葉緑体遺伝子配列を決定し分子系統解析を行った。また、詳細な色素解析を行い、三次共生植物L. chlorophorum葉緑体起源を詳細に検討したので報告する。

複数遺伝子解析による Fornicata 生物群の系統進化の解明

Fornicata 生物群にはミトコンドリアを持たない生物が含まれる。これらの生物の中にはミトコンドリアが退化したと考えられるオルガネラを有するものが存在する。この ようなオルガネラを比較解析することによりミトコンドリアの進化の過程を知る上で重要な知見を得ることが出来ると考えられる。しかしながら、 Fornicata 生物群の内部の系統関係については未だ不明瞭な点が多く、SSUrRNA を除くとタクソン数、配列既知の遺伝子数ともにあまり多くない。そこで今回我々は、Fornicata と考えられるDysnectes brevis、NY0173 株などの新規生物を加え、α-tubulin、β-tubulin を使用して複数遺伝子による系統解析を行った。その結果、Fornicata 生物群の単系統性が支持されCarpediemonas、NY0173 株、D. brevis、Diplomonads の順に分岐したとする可能性の高いことが明らかとなった。

Apicoplast 由来配列を含む色素体rpo 分子系統樹におけるアーティファクトの検出

Apicomplexa 類は色素体様のオルガネラであるApicoplast をもつ。このApicoplast ゲノム由来のRNA ポリメラーゼ(rpo)遺伝子の配列を用いた解析では、Apicomplexa 類とEuglena 類との単系統性が強く支持されることが分かっている。しかしながらこの解析結果における分子系統樹ではApicomplexa 類の枝長が極めて長いことから、両者の単系統性は何らかのアーティファクトによって支持されていることが示唆された。そこで今回その可能性について検証し た結果、両者のアミノ酸組成の類似が単系統性の形成に大きく影響していることが判明した。

A novel, free-living parabasalid from Pacific mangrove sediments groups strongly with parasitic trichomonads as inferred from ultrastructural and molecular phylogenetic data.

The Trichomonada consists mainly of parasitic lineages that infect both vertebrate and invertebrate hosts and possess non-canonical mitochondria associated with anaerobic lifestyles. Ultrastructural and molecular phylogenetic evidence indicate that this taxon is split into four main subgroups: the Monocercomonadidae, the Trichomonadidae, the Devescocinidae and the Colonymphidae. Only six species in four genera of trichomonads are known to be free-living flagellates that inhabit anaerobic environments: Monotrichomonas carabina, Monotrichomonas sp., Ditrichomonas honigbergi, Pseudotrichomonas keilini, Honigbergiella ruminantium, and Honigbergiella sp. These free-living flagellates form a well-supported clade as inferred from phylogenetic analyses of SSU rRNA gene sequences and are classified as the Monocercomonadidae. We isolated a novel free-living trichomonad from mangrove sediments near Ishigaki Island, in the southern part of Japan, and investigated its ultrastructural characters and molecular phtylogenetic position based on SSU rRNA gene sequences. Our Maximum Likelihood tree demonstrated that this flagellate is separated from the monocercomonadid clade and instead grouped strongly within the Trichomonadidae, which also includes the human parasite, Trichomonas vaginalis. This free-living flagellate had several trichomonadid features, including two to three anterior flagella (depending on the life stage), a posterior flagellum with a lamellar-type undulating membrane, and an axostyle that protruded from the posterior end of the cell. Morphological and molecular evidence show that this flagellate is a novel free-living trichomonad that provides insights into the evolutionary history of both parasitic and free-living lifestyles within the Parabasalia.

渦鞭毛藻類Lepidodinium chlorophorum葉緑体の変異遺伝暗号について

Lepidodinium属渦鞭毛藻類は緑藻類を起源とする「3次葉緑体」を持ち、我々はLepidodinium属葉緑体の起源を探索してきた。その過程で、L. chlorophorumと進化的に広範な緑藻類葉緑体遺伝子配列のアミノ酸使用頻度・コドン使用頻度等を精査したところ、L. chlorophorum葉緑体ゲノムにコードされるタンパク質遺伝子は変異遺伝暗号を用いている可能性があることが判明したので報告する。大多数の生物がもちいる標準遺伝暗号では、ATAコドンはイソロイシン(Ile)をコードする。しかし、L. chlorophorum葉緑体ゲノム中のタンパク質遺伝子ではメチオニン(Met)をコードしている可能性が高い。これまでの研究から、変異暗号ATA=Metは酵母や後生動物ミトコンドリアゲノムにおいて多数報告されており、真核生物進化の過程でATA=Ile→Metへの変化は独立に複数回起こったと考えられる。そのため、これら暗号変化のドライビングフォース、暗号変化に関連するタンパク質合成機構の進化は興味深い。また、変異暗号が頻繁に発見されるミトコンドリアと異なり、葉緑体ゲノムにおける変異暗号の使用は極めて稀である。これまでマラリア原虫等を含むアピコンプレクサ類退化葉緑体ゲノムにおける変異暗号は報告されているが、L. chlorophorum葉緑体変異暗号は第2例目となる貴重な発見である。