Abstract

糞線虫の持つ細菌様フェロケラターゼ遺伝子の同定

ヘムは全ての生命に必須の物質で、ほとんどの生物は完全なヘム合成帰依を持ち、δ-アミノレブリン酸から7ステップの酵素反応を経てヘムを合成する。一方、線虫類は例外的にヘム合成系を欠損することが知られ、C. elegansにおいては、上述7ステップの反応を触媒する酵素を全て欠くことが報告されている。またそのほかの線虫類においてもヘム合成形の酵素として単離されたものはない。このことから線虫類は、自らはヘムを合成せず、食餌性に取り入れたヘムを自身のヘムタンパク合成に利用していると考えられる。最近、我々はベネズエラ糞線虫ゲノムから、ヘム合成系の最終酵素であるフェロケラターゼ（FC）と考えられる配列を見出した。公共データベースを用い、さまざまな線虫類の配列を検索したところ、FC遺伝子は糞線虫やフィラリア類など、動物寄生線虫の一部にしか存在しないことが分かった。予想されるアミノ酸の配列を用い系統樹解析から、動物寄生線虫フェロケラターゼはヒトや昆虫などの動物FCが属するミトコンドリア型FCからは遠く離れ、むしろプロテオバクテリア類とクレードを形成した。このことから、動物寄生線虫のFC遺伝子は細菌からの水平伝播により会得されたことが強く示唆された。組換えタンパクとして精製された糞線虫フェロケラターゼは人工基質であるメソボルフィリンにZn²⁺を挿入する反応を触媒した。また、糞線虫FCはFC欠損大腸菌株の増殖能を回復させ、本酵素が実際にFC活性を持つことが確認された。一部の線虫類がヘム合成系酵素群のなかでFCのみを持つ意義については不明であり、今後考察を深めて生きたい。

Genome evolution of the nitrogen-fixing cyanobacterial endosymbiont in the diatom Epithemia turgida. (This is not the official abstract -- but this summary has been sent to Matt Brown in Dalhousie University)

Rhopalodiacean diatom cells are known to possess the spheroid bodies, which are nitrogen-fixing obligate cyanobacterial endosymbionts. The host phylogeny inferred from eukaryotic small subunit (SSU) rRNA sequences recovered the robust monophyly of rhopalodacean diatom species/strains within the diatom radiation. Similarly, the endosymbiont phylogeny inferred from prokaryotic SSU rRNA sequences recovered the spheroid body sequences as a highly supported clade with a specific affinity to free-living, nitrogen-fixing cyranobacterial sequences. The host and endosymbiont phylongenies as a whole indicated that a common ancestor of rhopalodiacean diatoms transformed a single nitrogen-fixing cyanobacterium into the spheroid body. As the spheroid bodies are solely found in members of the genus Rhopalodiacea, the ‘evolutionary age’ of this obligate endosymbiont is most likely much younger than those of mitochondria and plastids, which are found in a wide spectrum of eukaryotes. We are currently conducting the genome sequencing of the spheroid body in Epithemia turgida as the model of endosybiotic genome reduction. So far, we obtained 6-7 contigs of which lengths can be summed up to approximately 2.6 Mbp, which is much smaller than the genome size (4.9 Mbp) of a free-living relative of the spheroid bodies, Cyanothece sp. ATCC51142.

放散虫と有孔虫が互いに姉妹群とする「レタリア仮説」に基づいたアクチン、チューブリンおよびペプチド伸長因子の複雑な進化シナリオ／Complex evolutionary histories of actin, tubulins and elongation factor protein in Rhizaria based on the "Retaria" hypothesis.

放散虫と有孔虫は骨格を有する遠洋性プランクトンであり，古い化石記録を持つことから古生物学的に有用な生物である．近年，分子系統解析の結果から，放散虫と有孔虫は姉妹関係にあり（レタリア仮説），これら2つの原生生物系統群はエンドミクサやフィロサと共にリザリアという大きなグループ（真核生物スーパーグループ）に属することが支持されている．

細胞骨格を構成するアクチンやチューブリン，そして翻訳(mRNAの情報からタンパク質合成する反応)の際に機能するペプチド伸張因子等は真核生物に必須のタンパク質であり，またその系統は生物自体の系統と一致する場合が多い．しかし，放散虫では，それらの遺伝子情報が少ないために，放散虫を含めたリザリア内で，該当のタンパク質遺伝子がどのような進化を経てきたかは謎のままであった．本研究では多様な放散虫からアクチン，（αおよびβ）チューブリン，ペプチド伸張因子をコードする遺伝子を取得し，それらの進化パターンを分子系統解析により推測した．

その結果，放散虫のアクチン，αチューブリン，およびβチューブリンには2つのパラログが存在することが示された．アクチンにおいては放散虫と有孔虫の共通祖先で遺伝子の重複が起きたこと，αチューブリンのパラログの1つは他生物からの水平伝搬によって獲得されたこと，βチューブリンのパラログの1つは放散虫と有孔虫の共通の祖先で既に“特殊化”していたことが示唆された．また，放散虫には，ペプチド伸張因子の1つとして一般的に知られているelongation factor-1αではなく，“non-canonical”なelongation factor-like (EFL) proteinをコードする遺伝子が存在し，その遺伝子は有孔虫やエンドミクサの一種であるグロミアのEFLと共通の祖先を持つことが示唆された。以上のことから，これらのタンパク質をコードする遺伝子は，リザリアの系統内において複雑な進化的道筋を辿ってきたと考えられる。

Radiolaria and Foraminifera are important pelagic organisms in the field of paleontology due to their good and long fossil record of shells. Recent molecular phylogenetic analyses have shown that these two protist groups are sister to each other (known as “Retaria” hypothesis) and belong to one of large taxonomic assemblages of eukaryotes Rhizaria, togather with two other groups Endomyxa and Filosa.

Cytoskeletal proteins (actin, α-tubulin, and β-tubulin) and translation elongation factor proteins are essential in a eukaryotic cell. Phylogenies of genes encoding actin, α-tubulin, β-tubulin, and elongation factor proteins are frequently coincident with the organismal phylogeny. However, the evolutionary processes of these protein genes in the rhizarian lineage remain unclear due to less availability of radiolarian gene sequences. In the present study, the genes encoding actin, α-tubulin, β-tubulin, and one of elongation factor proteins were identified from diverse groups of Radiolaria, and the evolutionary histories of these genes are discussed based on the phylogenetic analyses.

Two paralogues of actin, α-tubulin, and β-tubulin were identified from radiolarian species examined. The phylogenies reconstructed in this study suggest that the actin gene was duplicated in a common ancestor of Radiolaria and Foraminifera and that one of two α-tubulin paralogues was laterally transferred from an unknown organism. It is also suggested that the highly divergent one of two β-tubulin paralogues originated from a common ancestor of Radiolaria and Foraminifera. Furthermore, we identified the gene encoding “non-connonical” elongation factor-like (EFL) protein rather than the more commonly known protein elongation factor-1α from several species of Radiolaria. Based on the EFL phylogeny the radiolarian homologues could have been vertically inherited from a common ancestor of Radiolaria, Foraminifera and an endomyxan species Gromia. In summary, our present study unveils the complex evolutionary scenarios of these essential protein genes within the lineage of Rhizaria.

メタゲノミクスで探る東京湾沿岸の藻類・プロティスト相／Microbial eukaryotes living in the coastal marine of Tokyo bay insights from the metagenome.

塩基配列決定技術の革新的な進歩は，その微細さ故に研究が遅れていたピコプランクトンの存在や多様性を白日の下に晒し、難培養性生物群での系統分類学的研究を急速かつ簡便に行うことを可能とした。さらに環境メタゲノム解析による大規模な配列取得で，これらの生物が極めて多様な環境に生育し、バイオマスとしても膨大に存在することが知られるようになってきた。したがって、マイクロビアルループ、さらには地球生態系の物質循環システムにおける、生産・消費・分解者としての、真核微生物の果たす役割は極めて重要である。しかしながら、その実体が不明、あるいは形態情報に基づく記載と系統的位置がリンクしていない生物が数多く存在するなど、真核生物の多様性の実態解明はその端緒についたばかりといっても過言ではない。ましてやその生理・生態的な情報はほとんどわかっておらず、真核微生物の生態系への影響評価のためには、まずその系統分類学的な情報に基づく実態を，正確かつ網羅的に把握する作業が必要とされている。我々の研究グループでは、生物種とオミクス情報に基づく環境物質の同時フェノタイピングによる相関解析で，水圏生態系の藻類・プロティスト複合系の生態構造解明と未知生物の分類学的解決を目指したプロジェクトを展開している。この一環として，プロジェクト研究対象地域である東京湾沿岸における真核藻類・プロティスト相の網羅的な把握のため、2010年の初夏から初冬の東京湾沿岸の環境試料を、サンガー法による18S rDNAの環境配列決定した。BLAST検索および系統解析に基づいて生物種のアノテーションを行い、同所における真核微生物相とその季節消長の解明を行った。

調査対象期間全体を通じて得られた環境配列のうち、オピストコンタ、ストラメノパイル、アルベオラータが，それぞれ約25％ずつを占め、残りがリザリア、クリプト藻、緑色植物、紅藻、カタブレファリス、テロネマ、ハプト藻などに由来した。東京湾では，初夏から秋にかけて大規模な赤潮が発生するため、ラフィド藻のHeterosigma akashiwoの赤潮時には，表層水では取得配列の半数以上が同藻に由来するが，数メートル下から採水した試料では繊毛虫や寄生性渦鞭毛藻類が優占するなど、実際の生物量を反映した配列が取得された。夏期には取得配列の大半が中心類珪藻由来となるが，オピストコンタの配列も数多く取得できた。その大半はメタゾアに由来し、菌類は盛夏以外ではほとんど検出されず、ツボカビ類は８月のみ大量に検出された。一方，ピコビリ藻類と完全に一致する環境配列や、MAST（MArine STramenopile）などの海産ストラメノパイルと近縁性を示す配列も確認できた。さらにBLAST検索で既知生物と90％以下の相同性を示す環境配列が多数取得されたことは，東京湾のような普遍的水圏環境においても，新規分類群や分類学的処置の必要な真核微生物が多数存在することを強く示唆するものである。現在それらの生物の実体解明に向け、形態観察と塩基配列取得をリンクさせた研究手法の技術開発にも取り組んでいる。

Karenia属渦鞭毛藻類の三次葉緑体獲得に伴う葉緑体型GAPDHの進化

Karenia属渦鞭毛藻類は，元々有していたペリディニン型葉緑体をハプト藻類由来葉緑体へと置換（三次共生）した。このため渦鞭毛藻核では，内在性のペリディニン型葉緑体用遺伝子は、共生したハプト藻により持ち込まれた相同遺伝子と置換されたと考えられている。これまでの研究により，Karenia brevisは光合成CO2固定用遺伝子としてgapC1-fdと呼ばれるハプト藻葉緑体型遺伝子に加え，従来のペリディニン型葉緑体用gapC1-pも有していることが分かっている。本研究では，三次共生に伴う遺伝子置換のモデルとして，K. brevisと近縁種K. mikimotoiのgapC1-pとgapC1-fdについて転写産物の一次構造および転写産物量の比較を行った。K. brevisでは，機能的であろうと考えられる一次構造をもつgapC1-pとgapC1-fd転写産物が確認された。一方，K. mikimotoiではgapC1-fdは機能的一次構造を有した転写産物が確認されたが，gapC1-pは有意な転写産物量が検出できず，PCRでは偽遺伝子の転写産物だけがかろうじて確認された。すなわち，偽遺伝子化したgapC1-pはK. mikimotoiゲノムから駆逐される直前だと考えられ，K. brevisゲノム上のgapC1-pとは遺伝子置換の異なる中間段階にあたることを示唆する。

ローリングサークル型複製法に基づく原生生物ミトコンドリアゲノムのシーケンス解析 ミトコンドリア（mt）ゲノムは、遺伝子構成や構造に系統間で大きな多様性が観察される。そのためmtゲノムの比較解析はオルガネラゲノム進化のみならず、宿主（真核）ゲノムの進化を考える上で重要な知見を提供し得る。一般的にmtゲノム配列を決定するにはまず大量の細胞からmtDNAを精製する必要があったが、この方法は全ての原生生物に応用可能とはいえない。我々の研究対象となる原生生物種はmtDNAを十分量取得できるほど実験室内で増殖するとは限らず、増殖速度の遅い生物種をもちいたmtゲノム解析はきわめて困難であった。上記のmtゲノム解析に必要な細胞量にかかる制約を回避するため、数ピコグラムのDNAからφ29ファージDNA合成酵素をもちいたローリングサークル型複製（RCA）によってmtゲノムを増幅し、パイロシークエンス法により配列決定を行なう新しい手法を考案した。我々は、この方法によりディスコバクレードに属するTsukubamonas globosaのmtゲノムを完全決定することに成功した。さらに現在、同方法によるカタブレファリス類Leucocryptos marinaとハプト藻類Chrysochromulina sp.のmtゲノム解析を進めている。本発表ではまずRCA法によるmtDNA増幅の詳細について触れ、さらに本法の利点と欠点を議論する。

渦鞭毛藻Lepidodinium EST解析によるヌクレオモルフ関連遺伝子の探索

クリプト藻類，クロララクニオン藻類は二次共生により色素体を獲得した生物群だが，色素体の起源となった光合成性真核藻類の核が縮退した構造が存在する。この縮退共生核はヌクレオモルフ（NM）と呼ばれ、コードされるゲノム情報は二次共生に伴う共生体核ゲノムの縮退過程を解明する重要な手掛かりとなっている。 渦鞭毛藻類Lepidodiniumは，元々保持していたペリディニンを含む典型的渦鞭毛藻色素体を，細胞内共生した緑藻の色素体と交換したと考えられる。電子顕微鏡観察はLepidodiniumにもNM様構造体の存在を示唆するが，残念ながらこれまで分子生物学的手法を用いた研究の対象にはなっていなかった。我々はL. chlorophorumのNM関連遺伝子の探索を行い，これまでに共生緑藻由来と考えられる大サブユニットおよび小サブユニットリボソームRNA（rRNA）遺伝子の配列とそのオペロン構造の取得に成功した。これらのデータは，L. chlorophorum NM様構造内のゲノムの存在を示唆する初めての分子データとなる。またrRNA遺伝子以外のNM遺伝子を探索するため網羅的発現遺伝子解析をおこなったので，その解析結果について報告する。

塩基配列情報で探る東京湾沿岸の真核微生物相とその季節変動

水圏生態系における生物多様性と物質代謝の関わりを解明するためには，生物・物質双方の正確なプロファイリングが必要である。しかし，顕微鏡レベルでは識別が困難な分類群も多く，それらの生物量を把握するには別のアプローチが必要である。そこで本研究では，生物計数とメタボローム解析の相関解析を行ったサンプルについて，環境配列を決定した。

本研究では2010年の5月から12月の東京湾沿岸（湾奥部）に毎月１回，表層（1m）と中層（3.5m）で定期採水し，0.2µm以上80 µm以下のフィルター分画について，2組の18Sr RNA遺伝子ユニバーサルプライマーで増幅し，クローニングを経て塩基配列を決定した。得られた真核生物の環境配列(2339 reads)は，BLAST検索と最尤系統樹構築によるアノテーション（生物群同定）を繰り返し，それぞれの系統的位置を決定し，系統型ごとの月別の出現傾向を明らかにした。

期間全体を通しての内訳は，ストラメノパイル(31%)，アルベオラータ(30%)，オピストコント(29%)，リザリア（5%）, CCTH(3%)，アーケプラスチダ(1%)，その他(1%)であった。アルベオラータでは渦鞭毛藻類が71%を占めるが,その中には，ルゴール固定サンプルによる生物計数では同定できていなかった寄生性渦鞭毛藻類と推定される配列が多数得られた。同様にケルコゾア生物，卵菌類，MAST(Marine Stramenopiles)，ツボカビ類，さらにはピコビリ藻類などの微細，固定困難，希少，実体不明生物などについても，その存在を確認するとともに，それらの出現パターンに関する知見も得られた。

光合成能進化研究のモデルとしての無色珪藻類Nitzschia spp.

真核生物による光合成能の獲得は複数回起こっており，藻類の多様性を生み出す要因の一つとなっている。その一方真核細胞進化では，光合成能を捨てる進化も複数回起きている。珪藻類は水圏生態系における一次生産者として重要な役割を果たしているが，Nitzschia属における7種は光合成を行わない珪藻類として報告されている。本研究では，沖縄県のマングローブ林サンプルから，Nitzschia属従属栄養性珪藻類33株を確立した。光学顕微鏡観察の結果，本株は「線状皮針形」と「S字形」の2タイプに分けられ，明瞭な葉緑体は観察されなかった。本研究で確立したすべての株は光要求性を示さず，蛍光顕微鏡下で自家蛍光が検出されなかったため，クロロフィル合成は起きていないか、非常にわずかかだと考えられる。核LSU rRNA遺伝子の部分配列を用いた分子系統解析の結果，本株は2つのグループに分けられ，細胞形態の差異を反映していた。走査型電子顕微鏡観察により，「線状皮針形」の株はN. putrida，そして「S字形」株の一部はN. leucosigmaと同定された。さらに、これらの従属栄養性珪藻類から葉緑体SSU rRNA遺伝子のほぼ全長が得られたため，本株は葉緑体ゲノムのみならず葉緑体構造の痕跡を有していると考えられる。分子系統解析の結果，他の光合成能を失っている葉緑体遺伝子によく見られるように、本株の葉緑体SSU rRNA遺伝子には有意な進化速度の上昇が確認された。

珪藻Epithemia turgida細胞における窒素固定シアノバクテリア共生体のゲノム解析

我々は、珪藻Epithemia turgida細胞の窒素固定をつかさどるシアノバクテリア共生体（楕円体）のゲノム解析を行った。この共生体ゲノムは約2.7 Mbpと判明し、オルガネラ化に伴うゲノム縮退の途上にあると考えられる。

ローリングサークル型複製法に基づく原生生物ミトコンドリアゲノムのシーケンス解析

増殖速度が遅い原生生物種のミトコンドリア（mt）ゲノム解析を行うために、少量のDNAからローリングサークル型複製酵素を用いてmtゲノムを増幅し、パイロシークエンス法により配列決定する新しい手法を考案した。

Karenia属渦鞭毛藻類の三次葉緑体獲得に伴う葉緑体型GAPDHの進化

我々は、葉緑体置換によりハプト藻類由来葉緑体を獲得したKarenia属渦鞭毛藻類の葉緑体型GAPDH遺伝子を例とし、渦鞭毛藻類における葉緑体獲得に伴う遺伝子水平移動・置換をモデル化したので報告する。

Dysnectes brevisミトコンドリア関連タンパク質における輸送シグナル配列の探索

Dysnectes brevisは、嫌気環境に適応したミトコンドリア関連オルガネラ（MRO）をもつ。D. brevisの網羅的発現遺伝子解析ではMROで機能すべき複数のタンパク質が同定されたが、これら「MRO関連タンパク質」は細胞質で合成され、MROに輸送されるはずである。このタンパク質輸送機構の一端を解明すべく、MRO関連タンパク質遺伝子の全長を決定し、MRO局座位シグナルを探索したので報告する。

RY-coding and non-homogeneous models can ameliorate the maximum-likelihood inferences from nucleotide sequence data with parallel compositional heterogeneity.

In phylogenetic analyses of nucleotide sequences, ‘homogeneous’ substitution models, which assume the stationarity of base composition across a tree, are widely used. However, a homogeneous model-based analysis can yield an artifactual tree when two distantly related sequences achieved similar base frequencies in parallel. Such potential difficulty can be countered by two approaches, ‘RY-coding’ and ‘non- homogeneous’ models. The former approach converts four bases into purine and pyrimidine to normalize base frequencies across a tree, while compositional heterogeneity is explicitly incorporated in the latter approach. Although these approaches have been applied to real-world sequence data, their basic properties have not been fully examined by pioneering simulation studies. Here, we assessed the performances of the maximum-likelihood analyses incorporating RY-coding and a non- homogeneous model (RY-coding and non-homogeneous analyses) on simulated data with parallel convergence to similar base composition. Both RY-coding and non- homogeneous analyses showed superior performances compared with homogeneous model-based analyses. Curiously, the performance of RY-coding analysis appeared to be significantly affected by a setting of the substitution process for sequence simulation relative to that of non-homogeneous analysis. The performance of a non-homogeneous analysis was also validated by analyzing a real-world sequence data set with significant heterogeneity in AT content.

A new strategy of organellar genome sequencing incorporating rolling circle amplification: protist mitochondria genomes.

Mitochondrial (mt) genomes have enormous diversity with respect to gene content and genome structure. Comparisons of mt genomes, therefore, can be informative for elucidating mt genome evolution, as well as inferring the phylogenetic relationship amongst eukaryotes. In the ‘traditional’ strategy for mt genome sequencing, a large quantity of mitochondria or mt DNA is firstly purified from a large amount of cells. However, this strategy is not always suitable for all protists of our interests -- many of scientifically interesting species are slowly growing and are difficult to yield a sufficient amount of cells to initiate mt genome sequencing. Thus, we are developing a new strategy combining rolling circle amplification (RCA) using phi29 DNA polymerase and 454 pyrosequencing technique, which requires only several picograms of total DNA. With this strategy, we successfully completed the mt genome of Tsukubamonas globosa, a member of the Discoba clade. Now we are trying to determine the mt genomes of the katablepahrid Leucocryptos marina, and its prey organism, the haptophyte Chrysochromulina sp. In this presentation, we report the detailed conditions for RCA, and discuss the pros and cons of our new strategy.

A model for endosymbiotic genome reduction: rhopalodiacean diatoms and their nitrogen-fixing organelles, spheroid body.

Members of the diatom family Rhopalodiaceae possess two distinct cyanobacteria-derived organelles, plastids for photosynthesis and ‘spheroid bodies (SBs)’ for putative nitrogen fixation. The origin of plastids found in a broad spectrum of eukaryotes can be traced back to early eukaryotic cell evolution. On the other hand, the SBs are only found in a subgroup of diatoms, suggesting that a nitrogen-fixing cyanobacterial endosymbiont was transformed into the organelle in the ancestral rhopalodiacean diatom cells after the extant major diatom lineages diverged. We regard that the SBs represent an intermediate intracellular structure between non-obligatory cyanobacterial endosymbionts and organelles that are completely integrated into the host cell systems (i.e. mitochondria and plastids). Here we present the results from our recent investigations on rhopalodiacean diatoms and their SBs. We examined the evolutionary origin of the SBs in rhopalodiacean diatom species, and the nitrogen fixation activity by tracing ¹⁵N. Finally, we introduce our on-going sequencing of the SB genome in a rhopalodiacean diatom Epithemia turgida.

Is the replacement of a gene encoding plastid-targeted GAPDH on-going in the dinoflagellate genus in Karenia?

The vast majority of photosynthetic dinoflagellates has plastids containing a unique cartioind peridinin and encodes a single gene encoding plastid-targeted GAPDH (peridinin-type GapC1 or GapC1-p) in their nuclear genomes. On the other hand, the dinoflagellate genus Karenia is known to bear tertiary plastids derived from a haptophyte endosymbiont, and possess the endosymbiotically acquired ‘gapC1-fd,’ in addition to the endogenous gapC1-p. We here compared the primary structure and abundance of two types of gapC1 transcripts in K. bervis (Kb) and K. mikimotoi (Km). No significant expressional difference was detected between the two gapC1 genes in Kb cells, while gapC1-fd transcripts appeared to be much more abundant than gapC1-p transcripts in Km cells. As expected for dinoflagellate mRNAs, Kb gapC1-fd and gapC1-p, and Km gapC1-fd transcripts possessed the spliced leaders (SL) and poly-A tails at their 5′ and 3′ ends, respectively. However, only truncated gapC1-p transcripts without the SL or poly-A tail were isolated from Km cells, suggesting that Km gapC1-p is a recently established pseudogene. These results indicate that Karenia gapC1 genes are an excellent model to study orthologous gene replacements associated with tertiary endosymbiosis.

The phylogenetic position and mitochondrial genome sequence of the enigmatic discobid Tsukubamonas globosa.

Discoba (Excavata) is a unicellular eukaryotic assemblage that comprises four subgroups: Heterolobosea, Euglenozoa, Jakobida and Tsukubamonadida. This clade is especially important for understanding the early evolution of mitochondrial (mt) genomes, as the jakobid Reclinomonas americana retain the most ancestral (i.e. gene-rich) genome of any mt genomes determined to date. Amongst discobids, the Tsukubamonadida is the most recently established group and contains a single representative species (Tsukubamonas globosa) whose precise phylogenetic position within the Discoba has not yet been resolved. We conducted a pyrosequencing-based transcriptomic survey of T. globosa and, based on these data, we assembled a phylogenomic alignment of 157 proteins. Our phylogenomic analyses show that T. globosa branches at the base of the union of Euglenozoa and Heterolobosea. In addition, we completely sequenced the mt genome of T. globosa (48,463 bp in length and A+T content of 66.2%). The mt genome of T. globosa can be mapped as circular, and encodes 56 putative protein-coding and 27 RNA genes, indicating that T. globosa is second only to R. americana in terms of its coding capacity. In light of the relationships amongst the major members of the Discoba clade and their mt genome data, we discuss the evolution of mt gene repertoires in this protist clade.

Seasonal succession of eukaryotic community detected by environmental sequences in Tokyo Bay, Japan.

To elucidate the production mechanisms of the organic matter in aquatic ecosystem, the exact knowledge of the plankton biomass is required. Quantitative estimation by counting the numbers of organisms is the most common and effective method, but some alga and protists such as picoplanktons are hardly identified under the light microscopes caused by their size or the fragileness. Recently, the environmental sequence analyses have been applied because of its powerful performance for uncovering biodiversity of microbes.

In this study, we monthly collected the coastal surface and middle seawater in Tokyo bay, Japan, from the late spring to the early winter in 2010, and determined 18S rDNA sequences via the PCR amplification using two universal primer sets and subcloning. At present, 2339 reads of eukaryotic sequences were obtained, and over 485 phylotypes were recognized. Consequently, we obtained the basic information concerning the monthly eukaryotic composition and the seasonal succession of each organism including the heterotrophic or the parasitic ones in this area. Furthermore, we found the sequences corresponding to picobilliphytes and many unclassified eukaryotes.

Evolutionary analysis of mitochondrial ancestry of diplomonads: Phylogenomoics of mitochondrial-related organelles in Carpediemonas-like organisms.

Metamonads are a large group of anaerobic protists consisting of parabasalids and Fornicata (diplomonads, retortamonads, and their free-living relatives the Carpediemonas-like organisms), plus Trimastix and oxymonads. Recent advances in understanding their diversity and phylogenetic relationships make metamonads an excellent system for studying the evolution of anaerobic mitochondriarelated organelles. Mitochondria-related organelles in Metamonads range from the relatively large hydrogenosomes of parabasalids, which possess a wide variety of functions and are involved in energy generation, to the extremely reduced and tiny ?mitosomes? of the diplomonad Giardia, whose only known function is iron-sulfur cluster assembly. Other metamonads, including the free-living Trimastix and Carpediemonas-like organisms usually possess relatively large double-membrane bound organelles, but their functions and metabolism remain almost entirely unknown. In the presented study we performed extensive transcriptome sequencing of several of the least studied metamonads, including Trimastix, retortamonads, and several Carpediemonas-like organisms. We have used thorough in-silico analyses of the transcriptomic data to infer putative proteomes of mitochondrion-related organelles of each of these organisms. We compare these in the context of the well-resolved phylogenomic tree of metamonads and suggest the evolutionary steps leading from very complex ancestral mitochondrial organelles to the highly reduced mitosomes of Giardia.

細胞共生体由来オルガネラ進化に関する新たな展開／New aspects of the evolution of endosymbiotic bacterium-derived organelles.

Mitochondria (mt) and plastids (pl) were established through the endosymbiosis of an alpha-proteobacteirum and that of a cyanobacterium, respectively, and have greatly contributed to shaping the modern architectures of eukaryotic cells and genomes. In standard biology textbooks, the functions of these organelles -- respiration and photosynthesis -- have been fixed at an early stage of eukaryotic evolution. Nevertheless, such a classical view appeared not to be necessarily true for mt and pl in phylogenetically diverged eukaryotes. In this presentation, we present a few examples wherein mt/pl was drastically altered with regard to morphology and function, as well as the preliminary data on a young organelle in a certain group of diatoms, which was derived from a nitrogen-fixing cyanobacterium.

新奇真核微生物がもたらす新しい真核生物大系統像／Searching for missing pieces in natural environments: With the emphasis on the importance of culture strains of enigmatic eukaryotes for global eukaryotic phylogeny.

For decades, researchers in evolutionary biology have tackled to reconstruct the tree of life, since the accurate organismal phylogeny is indispensable as the very basic knowledge to infer various aspects in biological evolution. Unfortunately, we have yet to succeed in reconstructing the “true” organismal tree of eukaryotes owing to insufficiency of sequence data and incomplete coverage of eukaryotic diversity. Although it has become relatively easy and inexpensive to generate large volume of sequence data from target organisms by next-generation sequencing technologies, none of phylogenomic alignments comprising more than 100 genes can have covered all of the previously-described lineages or novel unicellular eukaryotes that remain undiscovered in nature. In this talk, we introduce our efforts on establishing culture strains of enigmatic eukaryotes isolated from natural environments, and their potential impacts for global eukaryotic phylogeny.

フォルニカータ生物群におけるミトコンドリア関連オルガネラの縮退進化―ハイドロジェノソームからマイトソームへ

フォルニカータ生物群は多様な原生生物からなる系統群であり、ディプロモナス、レトルタモナスとそれらの祖先として位置づけられるCarpediemonas様生物（CLO）から構成される。その姉妹群は同じく嫌気性原生生物のパラバサリア生物群である。フォルニカータやパラバサリアに属する生物はいずれも典型的なミトコンドリアをもたず、代わりにミトコンドリア関連オルガネラ（MRO）をもつと考えられている。ヒト寄生虫であるTrichomonas vaginalis（パラバサリア）はハイドロジェノソームという比較的大きなMROをもち、これが基質レベルでのATP産生やその他さまざまな細胞機能に関与している。同じくヒト寄生虫であるGiardia intestinalis（ディプロモナス）は形態的にも機能的にも縮退したマイトソームをもっているが、このオルガネラは鉄-硫黄クラスターの生合成のみに関与している。一方、系統樹上でGiardia にいたる枝から分岐するCLOのほとんどがMRO様オルガネラをもっているが、それらの生化学的機能の詳細は全く分かっていない。本研究では２つのCLO生物種 NY0171株および Dysnectes brevis に関して詳細なトランスクリプトーム解析を行った。得られたデータを他のフォルニカータ生物のデータと比較し、フォルニカータ生物の系統樹推測を行うとともに、各生物のMROのプロテオームを推定した。その結果、解像度の高いフォルニカータ系統樹が得られ、祖先型のハイドロジェノソーム様のMROから Giardia のマイトソームへと段階的な縮退進化が起こったことが示唆された。

The phylogenetic position and mitochondrial genome sequence of the enigmatic discobid Tsukubamonas globosa.／新奇単細胞真核生物 Tsukubamonas globosa の系統的位置とミトコンドリアゲノム

Discoba生物群は、単細胞真核生物からなる単系統群であり、4つのサブクレード、即ちヘテロロボサ類、ユーグレノゾア類、ヤコバ類、ツクバモナディダ類から構成される。ヤコバ類の一種であるReclinomonas americanaのミトコンドリア（mt）ゲノムはもっとも原始的な遺伝子構成を保持しているため、R. americanaを含むDiscoba生物群はmtゲノムの初期進化を考察する上で極めて重要な生物種であると考えられている。ツクバモナディダ類はTsukubamonas globosaの発見と共に2011年に確立されたが、この時点ではDiscoba生物群内部でT. globosaの系統的位置は確定できなかった。本研究では、次世代シークエンス技術を用いた T. globosaのトランスクリプトーム解析を行い、そこから生成した配列データを基に157個のタンパク質（アミノ酸）配列をふくむ巨大アライメントを作製した。この157タンパク質アライメントによる系統解析では、姉妹群となるヘテロロボサ類とユーグレノゾア類の基部から T. globosaが分岐した。また、我々は T. globosaのmtゲノムを完全解読することに成功した。 T. globosa mtゲノムは、全長48,463塩基対（AT含量66.2%）の環状分子であり、52個のタンパク質と29個のRNAをコードしていた。157タンパク質系統解析により解明したDiscoba生物群内部の系統関係を基に、 T. globosa、ヤコバ類、ヘテロロボサ類、ユーグレノゾア類間でmtゲノムデータを比較することにより、この生物群内部でのミトコンドリアゲノムにおける遺伝子構成の進化について考察する。

Discoba (Excavata) is a unicellular eukaryotic assemblage that comprises four subgroups: Heterolobosea, Euglenozoa, Jakobida and Tsukubamonadida. This clade is especially important for understanding the early evolution of mitochondrial (mt) genomes, as the jakobid Reclinomonas americana retains the most ancestral (i.e. gene-rich) genome of any mt genomes determined to date. Amongst discobids, the Tsukubamonadida is the most recently established group and contains a single representative species (Tsukubamonas globosa) whose precise phylogenetic position within the Discoba has not yet been resolved. We conducted a pyrosequencing-based transcriptomic survey of T. globosa and, based on these data, we assembled a phylogenomic alignment of 157 proteins. Our phylogenomic analyses show that T. globosa branches at the base of the union of Euglenozoa and Heterolobosea. In addition, we completely sequenced the mt genome of T. globosa (48,463 bp in length and A+T content of 66.2%). The mt genome of T. globosa can be mapped as circular, and encodes 52 putative protein-coding and 29 RNA genes, indicating that T. globosa is second only to R. americana in terms of its coding capacity. In light of the relationships amongst the majormembers of the Discoba clade and their mt genome data, we discuss the evolution of mt gene repertoires in this protist clade.

The genes encoding EF-1α and EFL genes co-exist in distantly related eukaryotic genomes.／真核生物における翻訳伸長因子EF-1αとEFLを両有するゲノムの分布

Elongation factor 1α（EF-1α）およびそのパラログであるelongation factor-like（EFL）は、真核生物におけるタンパク質の翻訳伸長に関わる中心タンパク質である。これら2つのタンパク質コード遺伝子は真核生物系統樹上でモザイク状の分布を示すが、このような複雑な分布は、両方の遺伝子を有していた祖先的真核生物から進化した末裔においてどちらか一方の遺伝子をランダムに失うことで形成されたと考えられる。これまでの研究で、珪藻Thalassiosira pseudonanaと接合菌Basidiobolus ranarumのゲノム中ではEF-1αとEFLを両方保持していることが分かっている。これらの2種は珪藻類と菌類の祖先的ゲノム状態を保持している稀有なケースと考えられてきた。珪藻類と菌類以外にも、EF-1αのみを有する種とEFLのみを有する種が混在する単系統群がいくつか知られているが、珪藻類や菌類のように両方の遺伝子を有する現存種はこれまで見つかっていなかった。本研究で行ったRT PCR法による探索と公開データベース中のゲノムやESTデータの探索により、系統的に互いに近縁ではない5つの生物群、すなわち（Thalassiosira以外の）珪藻類、ゴニオモナス類、ラン菌類、アプソモナス類およびツボカビ類から、新たにEF-1αとEFL両遺伝子を有する種を同定した。今回報告する最新のEFL/EF-1α遺伝子の分布は、両遺伝子を有する種はこれまで考えられてきたほど稀有ではなく、「EFL/EF-1α遺伝子両有ゲノム」が多様な系統群に分布していることを示唆している。

Genes encoding elongation factor 1α (EF-1α) and those for its distant paralogue called elongation factor like (EFL) protein, which are one of the core components involved in protein synthesis in eukaryotes, are patchily distributed in eukaryotes. This complex EF-1α/EFL distribution can be derived from the ancestral organism possessing both EF-1α and EFL genes, followed by differential losses of either of the two elongation factor genes in the descendants. Prior to this study, the diatom Thalassiosira pseudonana and the fungus Basidiobolus ranarum (Zygomycota) were known to possess both EF-1α and EFL genes in their genomes, suggesting that these extant genomes retain the ‘dual-EF’ status from their ancestral genomes. Similar to diatoms or fungi, several monophyletic assemblages comprising ‘EF-1α-containing’ and ‘EFL-containing’ species are known to date, but no species possessing the two elongation factor genes (‘dual EF-containing’ species) has been found outside of diatoms or fungi. In this work, we successfully identified new dual EF-containing organisms from goniomonads, oomycetes, fungi, diatoms, apsomonads, and chytridiomycota fungi, which were distantly related to one another, by experimental survey of EF-1α/EFL genes, and mining of EF-1α/EFL sequences in public transcriptomic/genomic data. The updated distribution of dual EF-containing organisms strongly suggests that the genomes with the dual-EF status are not very rare amongst eukaryotes as we previously thought, and more dual EF-containing organisms remain unidentified.

A comparative transcriptomic analysis of the mitochondrion-related organelles in members of an anaerobic protist group, Fornicata.／嫌気環境に適応したフォルニカータ生物群におけるミトコンドリア関連オルガネラのトランスクリプトーム比較解析

フォルニカータ生物群は多様な原生生物からなる系統群であり、ディプロモナス、レトルタモナスとそれらの祖先として位置づけられるCarpediemonas様生物（CLO）から構成される。その姉妹群は同じく嫌気性原生生物のパラバサリア生物群である。フォルニカータやパラバサリアに属する生物はいずれも典型的なミトコンドリアをもたず、代わりにミトコンドリア関連オルガネラ（MRO）をもつと考えられている。ヒト寄生虫であるTrichomonas vaginalis（パラバサリア）はハイドロジェノソームという比較的大きなMROをもち、これが基質レベルでのATP産生やその他さまざまな細胞機能に関与している。同じくヒト寄生虫であるGiardia intestinalis（ディプロモナス）は形態的にも機能的にも縮退したマイトソームをもっているが、このオルガネラは鉄-硫黄クラスターの生合成のみに関与している。一方、系統樹上でGiardia にいたる枝から分岐するCLOのほとんどがMRO様オルガネラをもっているが、それらの生化学的機能の詳細は全く分かっていない。本研究では２つのCLO生物種 NY0171株および Dysnectes brevis に関して詳細なトランスクリプトーム解析を行った。得られたデータを他のフォルニカータ生物のデータと比較し、フォルニカータ生物の系統樹推測を行うとともに、各生物のMROのプロテオームを推定した。その結果、解像度の高いフォルニカータ系統樹が得られ、祖先型のハイドロジェノソーム様のMROから Giardia のマイトソームへと段階的な縮退進化が起こったことが示唆された。

Fornicates are a diverse group of anaerobic protists consisting of diplomonads, retortamonads, and their relative paraphyletic assemblages known as Carpediemonas-like organisms (CLOs). Fornicata are believed to be closely related to parabasalids, which also are an anaerobic protist lineage. Both fornicates and parabasalids are considered to lack typical mitochondria but instead to possess mitochondrion-related organelles (MROs). A human parasite, Trichomonas vaginalis (parabasalid), possesses the relatively large MROs, the hydrogenosomes, which are responsible for variety of cellular functions and are involved in substrate-level ATP synthesis, while an another human parasite, Giardia intestinalis (diplomonad), possesses tiny MROs, the mitosomes, of which function is extremely reduced and limited to iron-sulfur cluster assembly. CLOs that are basal to diplomonads including Giardia have also been shown to possess MRO-like organelles, but their functions and metabolism remain almost entirely unknown. In the present study we performed extensive transcriptomic sequencing of the two CLOs, strain NY0171 and Dysnectes brevis, and the resultant transcriptomic data, together with those of other fornicate organisms, were used to (i) phylogenetically infer the internal relationship amongst the fornicate lineages, and (ii) comparatively infer MRO proteomes in the fornicate organisms. On the basis of the well-resolved fornicate phylogeny, we here propose the evolutionary process descending from ancestral hydrogenosome-like organelles to the highly reduced mitosomes of Giardia.

ミトコンドリア関連オルガネラの縮退進化

ヒト寄生虫である Giardia（ディプロモナス）は嫌気・微好気性真核生物であり、嫌気環境に適応したミトコンドリア関連細胞内小器官(MROs)であるマイトソームを持つ。このオルガネラはミトコンドリアから進化したと考えられているものの、その機能は縮退しており、鉄-硫黄クラスターの生合成のみに関与していると考えられている。一方、系統樹上でGiardia の祖先と考えられるCarpediemonas-Like Organisms (CLOs) のほとんどがMRO様オルガネラをもっているが、それらの生化学的機能の詳細は全く分かっておらず、どのような進化過程を経てGiardiaのマイトソームに至る機能縮退が起きたのかは不明である。そのため、本研究ではCLOの有するMROの機能解明に向けた分子基盤を提供するため、２種のCLO NY0171株および Dysnectesに関して詳細なトランスクリプトーム解析を行った。推定されたCLOsのMROプロテオームから、CLOsのMROは基質レベルのATP合成および一部のアミノ酸代謝経路を有していることが推定された。CLOの系統学的位置からGiardiaは、好気性ミトコンドリアを嫌気環境に適応したオルガネラに進化させた後、さらに段階的な機能縮退によりマイトソームを獲得したことが強く示唆された。