Abstract

無色系統群の研究から炙り出される真核藻類の進化―ゲノミクスの視点を含めて

地球上に現存する生物種が、単一の共通祖先からどのような進化を経て確立されてきたかを解明することは、生物学における最も主要な研究課題の一つである。我々筑波大学・微生物分子進化研究グループでは、この生物の多様化・進化について特に真核生物に注目し研究を進めている。

真核生物の細胞・ゲノム体制の進化には、ミトコンドリアと色素体の起源となった細胞内共生体が重大な影響を与えたはずである。これまでミトコンドリアを一度も持ったことがない真核生物は確認されていないため、ミトコンドリアは真核生物進化のごく初期に確立され、真核生物進化を通じて垂直的に伝播してきたと信じられている。一方、色素体やその痕跡を持たない真核生物は多く存在するため、色素体はミトコンドリア共生よりも後に獲得されたと考えられる。現存する全ての色素体は一つの細胞内共生シアノバクテリアに由来すると考えられている（一次共生）。一次共生の後、真核藻類が無色（従属性）真核細胞内に共生するN次共生（N≧2）が複数回起こり、真核系統間を水平的に伝播したことが分かっている。N次共生により獲得された個々の色素体（共生体）の起源は、色素組成・形態的特徴・色素体ゲノムコード遺伝子の分子系統解析により明らかにされつつある。一方、真核生物の進化史における色素体伝播経路を理解するためには、N次共生体を受け入れた宿主細胞の系統関係を解明しなければならない。特に、真核藻類は複数の主要な真核生物系統群に散在するため、色素体進化の全体像解明には色素体の有無に関わらず真核生物全体の系統関係を精度よく解明する必要がある。

従来から、真核生物の系統解析には小サブユニットリボソームRNA（SSU rRNA）遺伝子等が使用されてきた。しかし、SSU rRNAであれ、他の主要解析マーカーであれ、単一遺伝子配列に保持されている進化的情報は真核生物の主要系統群間の関係を解明するには不十分である。この単一遺伝子解析の情報量不足に関する問題は、複数の遺伝子配列を結合し解析することで（理論的には）解決可能である。近年、真核生物大系統の解明を目指し、真核生物の核ゲノム解析・網羅的転写物解析（EST解析）からの大量配列データを用いた100遺伝子以上の遺伝子配列を含むアライメントの系統解析、所謂phylogenomic解析が行われている。我々の研究グループでも、従属栄養性真核生物種を中心にphylogenomic解析を行ってきた。本講演では、我々の研究結果に基づき、①ハプト藻類とクリプト藻類が比較的近縁であること、②各種従属栄養性生物種がハプト藻類やクリプト藻類と近縁関係にあり、本グループが予想を越えた多様性をもつこと、③これらの系統群中の光合成能進化に関する仮説、等を議論したい。これらの知見は、色素体進化を解明する上で、無色系統群と光合成性系統群との関係を解明することが必須であることを強く示唆する。

最尤系統樹の信頼性指標に対するバイアスの定量化

我々は通常、ブートストラップリサンプリングによって作成したデータを使って分子系統樹推定を繰り返し、得られた系統樹群から各分岐の出現確率を算出することで、分子系統樹推定の信頼性・不確実性を評価している。しかし、このときの各反復では網羅的探索や多数回の発見的探索は行わずにただ一度の発見的探索を行っていることが多いため、得られる信頼性指数にはかなりのバイアスが働いているはずである。そこで我々は、各反復における初期樹形が元データの最尤樹形から遠いときには最尤系統樹の信頼性は過小評価され、元データの最尤樹形を初期樹形にすれば逆に過大評価されると予想し、スーパーコンピュータ上でのシミュレーションデータ解析によってこの仮説の検証といくつかの典型的な条件におけるバイアスの定量化を行った。その結果、前述の仮説を支持する結果が得られた。

所属不明の原生生物Palpitomonas bilixの系統的位置の解明

Palpitomonas bilixは近年報告された二本の等長鞭毛を有する海産捕食性原生生物である。電子顕微鏡観察および核コード6遺伝子を用いた分子系統解析の結果から一次植物またはクリプト藻類との近縁性が示唆されているが、明確な結論は出ておらず本種は現在、分類学的位置の不明な原生生物として扱われている。また光合成性真核生物との近縁性が示唆されることから、光合成能の獲得または消失を考察する上でカギを握る生物としても期待されている。これらの背景から、より多くの遺伝子配列を用いた分子系統解析によるP. bilixの系統的位置の解明が待たれている。

今回、我々はP. bilixおよび祖先的クリプト藻類の一種Goniomonas sp. ATCC PRA-68について454 パイロシーケンシングを用いてEST解析を行い、104,136リード・8586コンティグ、132,161リード・8394コンティグをそれぞれから得た。得られた配列を用いて、161遺伝子アライメントを作製し、最尤法による系統解析を行った。その結果、P. bilixは高い支持のもとクリプト藻類と単系統群を形成した。本発表ではこの解析結果をもとにクリプト藻類周辺の系統進化、分類体系について考察する。

オミクス情報に基づく藻類・プロティスト複合系の多様性解明へのアプローチ

真核微生物の多様性は，分子生物学的手法の発達で飛躍的に解明された。しかし，環境配列のみが知られる実態不明な生物も数多い。これらの未知生物の分類学的情報の集積が，生物多様性の理解に極めて重要であることは自明であるが，難培養性やピコサイズの物も多く，環境中から生物を単離・同定する地道な作業が求められる。一方，藻類・プロティストが，マイクロビアルループの中で大きな影響力を持つことも知られているが，種構成の複雑さや未知生物の存在などから，その生態構造が十分に解明されているとは言えないのが現状である。そこで我々は，水圏生態系の藻類・プロティスト複合系について，生物種と代謝物質の同時フェノタイピングによる相関解析から，その生態構造解明と未知生物の分類学的解決を目指している。本プロジェクトでは，生活排水の影響で水質悪化が著しい印旛沼（千葉県）と東京湾沿岸（東京都）に着目し，2010年2月より月に一度，定期サンプリングを行い，得られた水サンプルは，各種顕微鏡による観察，培養株の確立，環境SSU rDNA配列を用いたコミュニティー構造解析，核磁気共鳴分光法を用いたメタボローム解析などを行っている。本発表ではそれらの試みのうち東京湾サンプルに関する解析の最新情報について報告する。

赤潮原因ラフィド藻類におけるミトコンドリアゲノムの全塩基配列

【目的】 ラフィド藻Chattonella marina var. marinaおよびHeterosigma akashiwoは、代表的な赤潮原因種である。本研究では、上述 2 種のラフィド藻類のミトコンドリア (mt)ゲノムの全塩基配列を決定し、両ゲノム中において多様性解析に有用と考えられる領域を同定したので報告する。

【方法】 両藻類細胞から抽出した全DNA を鋳型とし、mt遺伝子をPCR増幅後塩基配列の決定を行った。続いて、各遺伝子間領域 PCR増幅後塩基配列決定を行うことで、本藻全mt ゲノムを決定した。ORFの探索およびコードタンパク質の同定にはExPASyおよびtBLASTnを、rRNA・tRNAの同定にはBLASTnまたはtRNAscan-SEをそれぞれ用いた。

【結果】 Heterosigma mtゲノムは全長38,690bp 、全 A+T含量は64.5% であった。機能未知ORFを6種、合計68種類の遺伝子をコードしていると推測され、全長に対するコード領域は91.3%あった。一方Chattonella mtゲノムはcox1遺伝子にイントロンを2つ有しており、全長44,772bp 、全A+T含量は71.6%であった。Chattonella mtゲノムの遺伝子組成はHeterosigmaのものとほぼ同様であった。両ゲノムともに、それぞれ独立して起きたと考えられるゲノム断片の重複が検出され、同領域には株間で塩基配列の多型が見られた。

真核生物における翻訳伸長因子遺伝子の多様性

【背景】 細胞内におけるタンパク質合成の中心的役割を果たすことが知られている翻訳伸長因子タンパク質（EF）は，真核生物では特にeEF-1Dと呼ばれる。近年eEF-1Dを持たず翻訳伸長因子様遺伝子（EFL）を有する生物も報告され，真核生物におけるEF遺伝子の多様性が注目されている。我々は海洋生態系における主要な一次生産者である珪藻を含めた、様々な真核微生物におけるEF遺伝子の進化的・機能的背景について研究を行った。

【方法】 系統的に多様な海産珪藻およびラン菌Pythium属、従属栄養性真核微生物Goniomonasから抽出したRNAを用いて、逆転写PCR法に基づくEF遺伝子の探索を行った。またNCBI等のon line databaseで利用可能な配列データを探索し、他の真核生物におけるEF遺伝子情報を得た。得られた配列と既知の配列を用いて、RAxML ver.7.2.6 により最尤系統樹を作成した。転写産物の定量にはリアルタイムPCR 装置を用いた逆転写定量PCR 法に従った。

【結果】 遺伝子探索の結果，これまで珪藻の一種と菌類の一種でのみ知られていた「EFL遺伝子とeEF-1D遺伝子を両方有する種」を多様な真核生物から発見した。転写産物量の比較から、これらの生物ではEFLをタンパク質合成に用い、eEF-1Dは細胞骨格タンパク質との結合などの副次的な機能を果たしていると考えられる。EFLは真核生物間を頻繁に水平移動すると考えられていることから、EFLが水平移動により真核細胞内に侵入することで、元々有していたeEF-1Dがタンパク質合成に関する機能を失う、という進化的構図が推定される。

真核生物ゲノムの可塑性：渦鞭毛藻類葉緑体関連遺伝子の起源を例に

Plasticity of eukaryotic genomes: The proteomes of dinoflagellate plastids as a case study.

真核生物の細胞体制がどのように確立されたかを推測する上で、細胞内共生体に由来するオルガネラを無視することはできない。真核細胞内の主要オルガネラにはミトコンドリアと葉緑体（色素体）があるが、ミトコンドリアは細胞内共生したαプロテオバクテリアに由来し真核生物進化の極めて初期に確立したと考えられている。ミトコンドリア共生後、灰色藻類・紅藻類・緑色植物の祖先細胞が色素体の起源となるシアノバクテリアを細胞内に取り込んだと考えられる。

これらオルガネラ獲得過程では、共生体・宿主細胞のゲノム構造にも大きな変化が起こったはずである。共生体ゲノムにおいては、宿主細胞内での「生活様式」に不必要となった遺伝子群は削除され、オルガネラの機能と維持に必要な遺伝子の大部分は宿主核に転移したと考えられる（endosymbiotic gene transfer；EGT）。従って、細胞内共生体をもつ真核生物のゲノムには、EGTで獲得したとも考えられるバクテリア型遺伝子が検出される。

本講演では、主に渦鞭毛藻類ゲノムに存在する葉緑体関連遺伝子の起源について解説する。祖先的渦鞭毛藻細胞は紅藻を起源とするperidinin型葉緑体をもっていたと考えられるが、二次的な光合成能の消失や、元々もっていたperidinin型葉緑体を他の真核共生藻に由来する葉緑体と置換した「非peridinin型」葉緑体が見られる。近年非peridinin型葉緑体をもつ複数の渦鞭毛藻類からの網羅的遺伝子転写物（EST）データに基づき、葉緑体タンパク質のプロテオームが推測されてきた。興味深いことに、これらの渦鞭毛藻類は、非peridinin型葉緑体の起源となった真核藻類の葉緑体遺伝子をEGTで獲得すると同時に、（現在では失った）peridinin型葉緑体で用いられていた遺伝子を葉緑体置換後にも「使い回し」をしていることが分かった。さらに、細胞内共生体とは無関係なバクテリアや真核生物から遺伝子を水平的に獲得し、その産物を葉緑体に輸送しているケースも多数発見されている。従って、藻類をふくめ真核生物一般のゲノムは系統的にキメラな遺伝子の集合体であり、我々の想像以上に可塑性が高いと考えられる。

There is no doubt that the endosymbioses of alpha-proteobacterium and cyanobacterium, which gave rise to mitochondria and plastids, respectively, had great impacts on eukaryotic genome evolution. As the extent organelle genomes are extremely reduced comparing to their free-living relatives, the vast majority of endosymbiont genes became dispensable for the lifestyle in a eukaryotic cell and were eventually discarded. On the other hand, the genes, which are essential for functions and maintenance of endosymbionts/organelles, were transferred to the host (eukaryotic) genome. According to the 'gene flow' from the endosymbiot to host genomes (endosymbiotic gene transfer or EGT), bacterial genes-those with specific affinities to the bacterial homologs-encoded in eukaryotic genomes have been considered as the results of EGT. In this presentation, I discuss the origins of nucleus-encoded, plastid-targeted genes in dinoflagellates that experienced plastid exchange, and the putative plasticity of eukaryotic genomes: Eukaryotes most likely have the ability to integrate foreign genes not only from their endosymbionts, but also diverged organisms, which were involved in neither acquisition of mitochondrion nor plastid.

Rhopalodia科珪藻に見られる細胞内共生シアノバクテリアの起源と分子進化

Rhopalodia科に所属するRhopalodia属およびEpithemia属の珪藻は、細胞内にspheroid bodyと呼ばれる共生シアノバクテリアを有する。spheroid bodyの機能に関する決定的な証拠は未だ挙げられていないが、spheroid body を持つRhopalodia gibbaには他の珪藻には見られない窒素固定能が認められることから、spheroid bodyが窒素固定の場として機能している可能性が指摘されている。興味深いことに、spheroid bodyは、宿主（珪藻）細胞外では生存できず、葉緑体やミトコンドリアと同様に宿主細胞に依存していると考えられている。また、Spheroid bodyのチラコイドは著しく退化していること、および蛍光顕微鏡下で自家蛍光を呈さないことなどから、spheroid bodyは既に光合成能を失っているとされる。これらのことを踏まえるとspheroid bodyは、窒素固定に特化したオルガネラとして宿主細胞に統合されているか、もしくはその中途段階にあると考えられる。細胞内共生を通じたオルガネラ獲得は真核細胞の進化において極めて重要なイベントであるが、その進化機構を解明する上でRhopalodia科の珪藻が重要な手掛かりを持つ可能性は高い。しかし、これまで詳細な研究の対象となったのはRhopalodia科珪藻の中でR. gibba一種のみであり、spheroid bodyの起源や進化について不明な点が多く残されている。

本研究では、まずspheroid bodyの起源について考察するため、複数種のRhopalodia科珪藻（Rhopalodia属1種、Epithemia属2種）から宿主核およびspheroid bodyのrDNA配列を取得し、それぞれの分子系統解析を行った。宿主珪藻核のrDNAを用いた解析において、Rhopalodia科珪藻は高いブートストラップ値によって支持される単系統群を形成した。またSpheroid body rDNAを用いた解析においても、全種のSpheroid bodyは単系統であることが強く示唆され、さらにその系統関係は宿主rDNAによる解析と一致していた。このことは、spheroid bodyがRhopalodia科珪藻の共通祖先によって一度だけ獲得され、宿主珪藻の種分化の過程を通じて受け継がれてきたものであることを示している。

次に、異なる種におけるspheroid bodyの分子進化を比較するために、Epithemia turgidaのspheroid bodyゲノムから窒素固定遺伝子クラスター配列を取得し、既に公開されているR. gibbaの相同配列と比較を行った。先行研究において、R. gibba spheroid bodyの当該配列では偽遺伝子化や遺伝子の欠損などが起きていることが報告されていたが、比較の結果、E. turgidaのspheroid bodyにおいてもほぼ同様の変異が起きていることが認められた。しかし同時に、偽遺伝子内における欠損部位などに差異も見受けられ、宿主珪藻の種分化に伴ってspheroid bodyゲノムにもそれぞれ独自の遺伝的変化が起きていることが示唆された。

Members of the diatom family Rhopalodiaceae possess cyanobacterium-like structures termed spheroid bodies, as well as the typical plastid, in their cells. Although the precise function of the spheroid bodies in the diatom cells remains unclear, photosynthesis is unlikely to occur in the spheroid bodies as they are devoid of chlorophyll autofluorescence and only possess degenerate thylakoid membrane. Rather, the spheroid bodies are proposed to carry out nitrogen fixation for the host cells, since nitrogen-fixing capacity was observed in R. gibba, one of spheroid-body-bearing diatoms. In addition, past studies showed that the spheroid bodies cannot survive outside host cells, implying that they are well integrated into the host cell system. Understanding of the organelle acquisition mechanism through endosymbiosis is one of major issue for trace evolution of eukaryotes and, in this matter, in-depth investigations on the spheroid bodies in rhopalodiacean diatoms may provide key insights. However, because most of past studies for spheroid body have been done with only R. gibba, origin and evolutionary process of spheroid bodies in Rhopalodiaceae still remain unclear.

In this study, firstly we amplified the small subunit ribosomal DNA sequences from both host and spheroid bodies in three rhopalodiacean diatom species. Phylogenetic analyses considering these new sequences clearly indicate that the spheroid bodies were acquired by a common ancestor of rhopalodiacean diatoms and have been retained during host speciation. Then we detected nucleotide sequence of the nitrogen-fixation gene cluster from spheroid bodies of Epithemia turgida, and compared it with corresponding region of R. gibba which has been already reported. Two sequences shared most of gene eliminations and pseudogenizations that likely occurred along with the genome reduction, but also certain difference has been found. This implies that major genome mutations have occurred before the split of present rhopalodiacean diversity and then independent evolutions accompanying host speciation have been going in spheroid body genomes.

緑色渦鞭毛藻類Lepidodinium chlorophorumが持つ共生体退化核遺伝子について

クリプト藻類，クロララクニオン藻類は，二次共生により葉緑体を獲得した生物群だが，葉緑体の起源となった共生藻類の核を未だに保持している。，その葉緑体内に保持している。かつて共生藻の細胞質であったと考えられる空間 (periplastidal compartment) に穴の空いた二重の膜に囲まれた構造体nucleomorph (NM) が存在する。NMは縮退した共生体核であり，その構造内には独自の真核ゲノムを保持している。NMのゲノム情報は，葉緑体化に伴う共生体核ゲノムの縮退過程を解明する重要な手掛かりとなっている。 光合成性渦鞭毛藻類の大多数]は紅藻類由来の二次葉緑体をもつが，Lepidodinium chlorophorumは祖先型葉緑体を一度手放した後，緑藻類由来の葉緑体を新たに獲得したと考えられる。電子顕微鏡観察では，Lepidodinium葉緑体中にNMに類似した構造体観察されている。しかし，そのNM様構造体がゲノムを保持しているのかは長年の間謎であった。 今回，L. chlorophorumの共生緑藻由来と考えられるリボソーマルRNAの配列とそのオペロン構造を取得した。これらのデータは、L. chlorophorum NM様構造内のゲノムの存在を示唆する初めての分子データとなる。

渦鞭毛藻Lepidodinium「葉緑体型」GAPDH遺伝子の転写活性比較

光合成生物は、細胞質で合成され葉緑体に輸送されるGAPDH（グリセルアルデヒド3リン酸脱水素酵素）をもつ。一般に光合成性渦鞭毛藻類は「ペリディニン型」と呼ばれる葉緑体をもち、その葉緑体中ではGapC1と呼ばれる葉緑体型GAPDHが機能している。しかしLepidodinium属渦鞭毛藻類は、元々もっていたペリディニン型葉緑体を緑藻葉緑体と入れ替え［1］、葉緑体型と考えられる2種類のGAPDH、即ちGapC1-pとGapC1-fdを保持する［2］。前者は葉緑体交換以前から保持していた葉緑体型GAPDH、後者は水平伝播した葉緑体型GAPDHであると考えられている［2］。我々は、GapC1-pは消失したペリディニン型葉緑体の痕跡であり、Lepidodinium葉緑体ではGapC1-fdが主要葉緑体型タンパクとして機能しているという作業仮説を立てた。この仮説を検証する第一歩として、葉緑体型GAPDHをコードすると考えられる2つの遺伝子がどのような転写制御を受けているのか調べた。逆転写リアルタイムPCR法を用いて細胞内の転写産物量を比較した結果、予想に反し両遺伝子の転写産物量には大きな違いがなかった。本講演では、Lepidodinium葉緑体におけるGAPDH進化に関する新たな仮説を議論する。 ［1］Takishita et al. 2007 Gene 410:26-36. ［2］Matumoto et al. 2011 Protist in press.

ミトコンドリア7遺伝子に基づくカタブレファリス類Leucocryptos marinaの系統的位置

核コードrRNA遺伝子を用いた系統解析では、光合成生物であるクリプト藻類と従属栄養性真核微生物カタブレファリス類は強い近縁性を示すため、クリプト藻類を含む生物群中での葉緑体進化を考察する上で重要な生物だと考えられている。一方核コードタンパク質配列による系統解析では同生物間の強い近縁性は復元できていない。本研究ではカタブレファリス類の系統学的位置を検証するためカタブレファリス類Leucocryptos marinaのミトコンドリア（mt）ゲノムの部分塩基配列~12 kbpを決定し、mt遺伝子の系統解析を行った。決定されたミトコンドリアゲノム断片には9つのタンパク質遺伝子が含まれていた。このうち7遺伝子の予想アミノ酸配列からアライメント（1992アミノ酸座位）を作成し最尤法で系統解析を行なった。その結果、L. marinaはクリプト藻類と近縁性を示したが、ブートストラップ（BP）値は低かった。興味深いことにL. marina配列とクロララクニオン藻類Bigelowiella natans配列は共にロングブランチとなり2配列間には弱い「近縁性」が検出された。そこでB. natansを除いた解析を行なったところ、カタブレファリス類－クリプト藻類間の近縁性がBP値93％で支持され、rRNA解析と同様にカタブレファリス類がクリプト藻類に近縁であることが示された。

Tsukubamonas globosa is a deep-branching member in the Discoba clade: Morphology, phylogenomics, and mitochondrial genome.

We report the ultrastructure and phylogenetic position of a free-living heterotrophic flagellate, Tsukubamonas globosa. This flagellate was isolated from a pond in the University of Tsukuba, Japan. Under light microscopy, the spherical vegetative cells were naked and highly vacuolated, and always swam with a rotating motion. Electron microscopic observations revealed that T. globosa possessed a ventral feeding groove, which is one of the hallmark characteristics of the supergroup Excavata. However, the position of T. globosa was unresolved in the small subunit ribosomal RNA phylogeny. A multigene phylogeny using five major markers, such as α-tubulin, β-tubulin, actin, heat shock protein 90, and translation elongation factor 2, robustly united T. globosa with members of the "Discoba" clade of Excavata, composed of jakobids, euglenozoans, and heteroloboseans, albeit the precise position of T. globosa in this clade remained unresolved. Consequently, we conducted an expressed sequence tag (EST) analysis and prepared a large alignment including 20,645 amino acid positions to assess the precise phylogenetic position of T. globosa. Our phylogenomic analyses suggested that T. globosa most likely branched at the base of the clade comprising euglenozoans and heteroloboseans (Discicristata). Pioneering studies indicated that members of the Discoba clade, particularly jakobids which have the least derived (most bacterial-like) mitochondrial genomes, hold key information to understand the early mitochondrial evolution. Since our analyses placed T. globosa in an intriguing position in the Discoba clade, we are currently characterizing the complete mitochondrial genome of this organism.

Spliceosomal introns in a split form: Another aspect of intron evolution in eukaryotes.

Spliceosomal introns are a hallmark of eukaryotic genomes and are excised from premature messenger RNAs (pre-mRNAs) by spliceosomes that are amongst the largest, and most complex molecular machine in cells. The divergent unicellular eukaryotic parasite Giardia intestinalis, the causative agent of giardiasis, possesses spliceosomes, but only four canonical (cis-spliced) introns have been indentified in its highly reduced genome to date. We demonstrate that this organism utilizes spliceosome-mediated trans-splicing of 'split' introns (splintrons) for generating mature mRNAs from multiple pre-mRNAs, which carry partial coding regions and independently transcribed from different loci. These splintrons have properties that distinguish them from other major trans-splicing systems known within eukaryotes to date, except that for eri-6/7 gene expression in a nematode. As Giardia and the nematode are distantly related each other, the unique system to splice splintrons mediated by spliceosomes has been evolved independently at least twice in eukaryotic evolution.

Molecular evidence for the residual nuclear genome of the green algal endosymbiont in the dinoflagellate Lepidodinium chlorophorum.

Members of the dinoflagellate genus Lepidodinium acquired the current plastids from an endosymbiotic green alga. Microscopic works identified a residual nucleus, "nucleomorph," in the space corresponding to the cytosol of the endosymbiotic green alga, but no molecular evidence has yet to be reported. In this study, we successfully isolated eukaryotic small and large subunits of ribosomal RNA (SSU and LSU rRNA) sequences likely from Lepidodinium chlorophorum nucleomorph. The rRNA sequences appeared to be extremely divergent and bear only partial similarity to the homologues. We experimentally confirmed that these SSU and LSU rRNA sequences were next to each other. Although the SSU rRNA sequence is too divergent for phylogenetic analysis, LSU rRNA phylogeny recovered a robust affinity between the LSU rRNA sequences of L. chlorophorum and green algae, suggesting that these rRNA sequences were derived from the nuclear genome of the green alga that gave rise to the current Lepidodinium plastids. Consequently, this work provides the first molecular evidence for the nucleomorph in this dinoflagellate species.

The phylogenetic position of the katablepharid Leucocryptos marina based on seven mitochondrial gene sequences.

Katablepharids are one of the heterotrophic unicellular eukaryotes whose phylogenetic position remains uncertain. An intimate relationship between katabrepharids and cryptomonads was recovered by phylogenetic analyses of nuclear small and large subunits rRNA sequences. By combining the results from recent phylogenetic analyses, cryptomonads, haptophytes, and other miscellaneous heterotrophic lineages (including katabrepharids) were hypothesized to share a single photosynthetic ancestor. If so, katabrepharids are a key lineage to understand the evolution of plastids in this assemblage. Nevertheless, the tight katabrepharid-cryptomonad connection has been confirmed solely by the rRNA phylogenies, and the previous phylogenies of nuclear proteins failed to resolve the position of katabrepharids.

We here report a mitochondrial genome fragment (~12 kbp) of the katablepharid Leucocryptos marina. This genome fragment includes nine protein-coding genes, and seven out of the nine mitochondrial proteins (1,992 amino acid positions in total) were analyzed by a maximum-likelihood (ML) method to investigate the position of katabrepharids in the global eukaryotic phylogeny. The first ML anlaysis reconstructed a clade of cryptomonads and Leucocryptos, albeit this relationship was supported only by a bootstrap percent (BP) of 42 %. We have noticed the possibility in which Leucocryptos was erroneously attracted to the chlorarachniophyte Bigelowiella natans in the first analysis. Thus, we conducted the second ML analysis excluding Bigelowiella, and recovered the Leucocryptos-cryptomonad connection with a BP of 93 %. Although we have no precise rationale for the artifactual affinity between Bigelowiella and Leucocryptos, observed in this study, our seven mitochondrial protein phylogeny positively supported the katabrepharid-cryptomonad connection.

Difference in transcriptional regulation between two genes encoding plastid-targeted GAPDH in the dinoflagellate Karenia mikimotoi.

The vast majority of photosynthetic dinoflagellates have plastids containing chlorophylls a+c plus a unique cartioind peridinin. These 'peridinin-type' dinoflagellates possess a single gapdh gene encoding plastid-targeted glyceraldehydes-3-dehydrogenases (GapC1) in their nuclear genomes, so that these GapC1 proteins were synthesized in the cytosol and then transported to the peridinin-type plastids. It has been known that the plastid evolution in dinoflagellates is extremely complex, and plastid replacement took place in multiple lineages during dinoflagellate evolution. The dinoflagellate Karenia mikimotoi is one of the species experienced plastid replacement and bears a non-cannonical plastid derived from a haptophyte. Curiously, two distinct types of gapC1 genes -- 'gapC1-p' vertically inherited beyond the plastid replacement and 'gapC1-fd' seemingly acquired from the endosymbiotic haptophyte that gave rise to the current Karenia plastid. Nevertheless, it remains unclear how the two functionally redundant gapC1 genes are regulated in the Karenia cells.

We here investigated the numbers of the two gapC1 transcripts by using a reverse transcriptase real-time PCR assay. In the assay based on the cDNA synthesized from total RNA, the numbers of the two gapC1 transcripts were nearly equal. However, the assay based on the cDNA synthesized from poly-A+ RNA, the gapC1-p transcripts was >100-fold less abundant than the gapC1-fd transcripts. These results indicate that (i) GapC1-fd works the principal GADH in the Karenia plastid, and (ii) few gapC1-p transcripts are processed into the polyadenylated (mature) mRNA, suggesting that gapC1-p and gapC1-fd genes are in a very early step of orthologous gene replacement associated with plastid acquisition via endosymbiosis.

Intergenomic gene conversion in the evolution of bacterial peptide-chain release factors.

Peptide-chain release factors in bacteria, RF1 and RF2, recognize stop codons, and promote the release of nascentpolypeptides from the ribosomes. RF1 and RF2, which are slightly different from each other in codon specificity, shareapparent sequence similarity, suggesting that they were separated from each other through a single gene-duplication event.The duplication of RF genes likely occurred in the ancestral bacterial genome, as all bacteria primarily possess the twoRFs. Although the two RF families are generally expected to take independent evolutionary paths after the ancestral geneduplication, our maximum likelihood-based test identified intragenomic conversion between RF1 and RF2 genes in fourdistantly-related bacterial lineages so far. For instance, ‘RF1-to-RF2’ and ‘RF2-to-RF1’ gene conversion events likelyoccurred in the genomes of Bacteroidetes and Chloroflexi, respectively. Most significantly, the putative regions involvedin the four gene conversion cases appear to be nearly homologous, indicating these events were severely constrained by thefunctional and/or structural properties of bacterial RFs.

Effective bootstrapping: A new method for estimating accurate credibilities of splits on a phylogenetic tree.

Bootstrap support value (BS) is most commonly used index for evaluating credibilities and uncertainties of splits on a phylogenetic tree. Because tree search effort is insuf?cient and because starting tree topology is distant from global optimum, BS is almost always undercounted or overcounted at large data set. In order to calculate accurate BS, we can use brute force approach or cancel out approach. However, brute force approach requires too many times and/or computing power and cancel out approach needs many replicates. Here, we produce a novel computing method of accurate BS named "effective bootstrapping". We can obtain accurate BS performing less pseudoreplicates in shorter time by using this method. This method gives us a good starting tree that is close to the global optimum by selecting from the resulting trees of shotgunned tree search at the original data set. It will be implemented and released as a part of Phylogears package.

Molecular phylogeny of the amitochondriate lineage, Fornicata, based on multi-gene analysis.

Fornicata is a monophyletic group of microaerophilic/anaerobic fragellates, which consists of three subgroups, diplomonads, retortaonads and Carpediemonas-like organisms (CLOs). Fornicata organisms are considered to possess mitochondrion-like organelles instead of typical mitochondria, and thus Fornicata can be a key to trace an evolutionary history of mitochondrion-related organelles. However, very little has been known for basal phylogenic relationships of Fornicata including CLOs. To infer a robust phylogenetic tree of Fornicata for evolutionary comparison analysis, we here underwent multigene analyses using five conservative genes, SSUrRNA, EF1alpha, HSP90, and alpha- and beta-tubulins. Our analyses demonstrated a resolved Fornicata tree in which a free-living CLO organism, Dysnectes brevis, is positioned at the base of the diplomonads/retortamonads clade that includes a well studied parasite, Giardia intestinalis. Since a highly reduced, mitochondrion-related organelle, ‘mitosome’, is found and characterized in G. intestinalis, while D. brevis has been shown to possess mitochondrion-like organelle, further comparative analyses of these organisms could contribute to elucidate the evolutionary process of the reduction of mitochondria.

新奇真核微生物からの大規模配列データで変貌し続ける，我々の真核生物大系統像／Phylogenomic data from novel eukaryotic microbes can trigger drastic changes on our view on the global eukaryotic phylogeny.

地球上の真核生物がどのような進化的変遷を経て現在の姿に辿り着いたのか，その詳細はいまだに解明されていない．現在認識されている真核大系統群は，進化の初期段階で確立したと推測されるため，大系統群間の系統関係を精度よく解像することは真核生物の初期進化を解き明かすことに他ならない．しかし，大系統群がいくつ存在するのか，それぞれの大系統群がどのような生物種により構成されるかなど，今のところ十分に理解されているとはいえない．

これまで真核生物大系統の作業仮説として，「6スーパーグループ」説が主に検討されてきた（Adl et al. 2005 J Eukaryotic Microbiol 52:399-451）．この仮説では，ほぼ大多数の真核生物は，6つのスーパーグループ，すなわち（i）オピストコンタ，（ii）アメーボゾア，（iii）一次植物（アーケプラスチダ），（iv）クロムアルベオラータ，（v）リザリア，（vi）エクスカバータの何れかに属すると提唱されている．近年では，上記の6スーパーグループ説の是非をはじめとする真核生物の初期進化に関する諸問題は，>100遺伝子をふくむアライメントに基づく「phylogenomic解析」により盛んに検討されている．これは次世代シークエンシング技術により，系統的に広範な生物種から迅速かつ比較的安価に，ゲノムあるいは網羅的発現遺伝子データを取得可能になったためである．一連の研究により，オピストコンタ，アメーボゾア，リザリアの単系統性は確認されているが，一次植物，クロムアルベオラータ，エクスカバータの単系統性については明確な結論が出ていない．

これまでの解析では，真核生物大系統間の系統関係どころか，スーパーグループの妥当性さえ検証しきれていない．この主たる原因は、解析した配列データ中の進化情報が、真核生物の初期進化を精度よく解像するには不十分だったためであろう．それに加え，phylogenomic解析が真核生物の多様性を十分にカバーしきれていないことも大きな問題である．例えば，これまで記載された真核生物種の中に，「orphan生物種」とも呼ぶべき所属不明な生物種が多数存在することは周知の事実である．また自然環境中には，これまで同定・報告されていない膨大な量の新奇生物種が棲息すると考えられる．当然のことながらこれらのorphan生物種や新奇生物種をphylogenomic解析の俎上に載せることはできず，これまでの研究結果は真核生物の多様性・進化の真の姿を十分に反映しているとは言い難い．つまり，真核生物の多様性と主要系統群間の系統関係の推測には，広範な真核生物種を含むphylogenomic解析が必須である．本講演では，クロムアルベオラータの多様性と内部系統に関連したこれまでの研究を概観し，我々の研究グループの最新の研究成果の一部を紹介する．

Palpitomonas bilixは，2006年にパラオ共和国で採取された海水サンプルから単離された新奇従属栄養性原生生物である（Yabuki, Inagaki, Ishida. 2010 Protist 210:523-38）．2010年に発表した記載論文では，我々は細胞形態の観察と分子系統解析を行ったが本種の系統的位置を確定するには至らなかった．従ってPalpitomonasは，現在のところ分類学的位置の不明なorphan生物種として扱われている．また，一次植物類の一部やクロムアルベオラータに属するクリプト藻類との弱い近縁性が示唆されたため，色素体（葉緑体）進化を考察する上でカギを握る原生生物としても注目されている．

我々は最近，次世代シークエンサーを用いたPalpitomonasの網羅的発現遺伝子（EST）解析を行い，約10万リード（合計3.2 Mbp）のESTデータを取得した．このESTデータを用いて作成した159遺伝子アライメントに対する系統解析は，Palpitomonasとクリプト藻類との極めて強い近縁関係を復元した．クリプト藻類はクロムアルベオラータの代表的生物群の1つであるが，同じく光合成性のハプト藻類，ピコビリ藻類，そして従属栄養性のカタブレファリス類，テロネマ類，有中心粒太陽虫類と共に，クロムアルベオラータ内でハクロビアという分類群を形成すると提唱されている（Okamoto et al. 2009 PLoS One4:e7080）．興味深いことに，我々のPalpitomonasをふくむ159遺伝子解析では，ハクロビアのメンバーが一次植物類のメンバーと入り混じったクレードを形成した．この結果はハクロビア，一次植物，クロムアルベオラータのいずれの単系統性も支持せず，これまでこれら2つの｢スーパーグループ」に含まれると考えられてきた生物種の系統関係の大幅な見直しが必要であることを示唆する．