Fazit

Fazit

Das Experiment zum Grün fluoreszierenden Protein war erfolgreich - GFP konnte erfolgreich durch folgende Schritte exprimiert, transformiert und analysiert werden: 

Die Produktion von GFP durch E. Coli erfolgte durch Transformation der Bakterien-Kolonien, wozu bei einigen Kolonien pGLO-Plasmid-DNA hinzugefügt wurde. Daraus resultierte eine hohe GFP-Produktion, wenn Arabinose vorhanden war, eine niedrige Produktion, wenn Arabinose und Glucose vorhanden waren und keine Produktion von GFP, wenn nur Glucose vorhanden war. Diejenigen Kolonien ohne pGLO-Plasmid-DNA konnten kein GFP produzieren, selbst wenn Arabinose vorhanden war. Die durch E. coli hergestellte Plasmid-DNA wurde durch Lyse der Bakterien isoliert. Durch die Restriktionsenzyme wurde die spezifische Nukleotidsequenz pGLO, welche für das GFP codiert, geschnitten. Dieser Vorgang wird auch als Restriktionsverdau bezeichnet. Die Nukleotidsequenzen der Plasmid-DNA von grün fluoreszierenden Bakterien wurden nun anhand ihrer DNA-Fragmente in einem Agarose-Gel aufgetrennt. Die erhaltenen Banden der Nukleotidsequenzen entsprachen den Berechnungen; der Restriktionsverdau war somit erfolgreich.

Die GFP-enthaltenden Bakterien wurden nun lysiert, um das GFP anschliessend mittels Säulenchromatografie aufzureinigen. Mit unterschiedlichen Salzkonzentrationen wurden dabei Proteine mit anderen Eigenschaften als GFP herausgewaschen. Am Ende wurde reines GFP erhalten. Das GFP vor und nach der Säulenchromatografie wurde nun mittels Native-PAGE und SDS-PAGE analysiert. Beim Native-PAGE wurden die Proteine nicht denaturiert, beim SDS-PAGE erfolgte eine Denaturierung der Proteine. Das Native-PAGE war wegen Fehlern in der Versuchsdurchführung nicht aufschlussreich. Das SDS-PAGE wies hingegen die erwarteten Resultate auf. Die aufgereinigte Probe wies weniger Banden für Proteine auf als die ungereinigte Probe. GFP wurde gemäss seinem Molekulargewicht bei 26.9 kDA erhalten.