3 Restriktionsverdau von Plasmid-DNA

Methode

Die sogenannten Restriktionsenzyme können spezifische Nukleotidsequenzen auf einem DNA-Strang erkennen und an diesen Stellen schneiden. Mit ihnen kann ein Plasmid wie pGLO gezielt bearbeitet werden.

Im Experiment 3 wurden das selbst hergestellte und ein gekauftes pGLO-Plasmid mit jeweils zwei Restriktionsenzymen geschnitten.

Folgende Restriktionsenzyme wurden in diesem Experiment angewendet:

• BamH1 (-20 °C); 5'-G^GATCC-3'

• Hind III (-20 °C); 5'-A^AGCTT-3'

• EcoRI (-20°C); 5'-G^AATTC-3'

• Pst I (-20°C); 5'-CTGCA^G-3'

Experimentelles Vorgehen

Das Experiment wurde gemäss Anleitung durchgeführt. Mithilfe der angegebenen Erkennungs- und Schnittsequenzen der ausgewählten Restriktionsenzyme konnten die Schnittstücke von pGLO herausgefunden werden. Dabei war zu beachten, dass sich die pGLO-DNA in einer Kreisstruktur (siehe Abbildung 12) befindet.

Danach wurden zunächst die Reagenzien Plasmid-DNA, 2x-Restriktionspuffer BioRad und deionisiertes H2O in ein Eppendorfröhrchen gegeben und diese Lösung kurz zentrifugiert. Als letzte Komponente wurden die Restriktionsenzyme hinzugegeben. Als Kontrolle wurde eine weitere Probe ohne Restriktionsenzyme hergestellt. Daraufhin wurden die Röhrchen verschlossen, zentrifugiert und anschliessend inkubiert.

Die Proben können im Gefrierfach aufbewahrt werden; vor der Verwendung müssen die Restriktionsenzyme durch Hitze aber wieder aktiviert werden. 

Auswertung

Die Restriktionsenzyme sind für die Isolation von Genen zuständig. Für diese Aufgabe besitzen sie drei wichtige Eigenschaften: das Spalten von DNA-Doppelsträngen, die hohe Spezifität und einen glatten bzw. versetzten Schnitt des DNA-Strangs. Mit einer "Scheren-Wirkung" können sie also aufgetrennte Stränge an Stellen mit gewissen Erkennungssequenzen glatt oder versetzt schneiden. [1]

Zum Schluss dieses Experiments sollten alle Stoffe durch die Restriktionsenzyme geschnitten werden. Diese Enzyme sind jedoch sensibel und sind nur in geringer Menge vorhanden. Werden sie also zu früh zur Probe dazugegeben, könnten sie nach Zugabe der restlichen Komponente bereits denaturiert und dadurch funktionsunfähig werden. Aus diesem Grund wurden sie erst am Schluss dazugegeben.

Als Vergleich mit den geschnittenen Proben wurden Proben ohne Restriktionsenzyme als Kontrolle angesetzt.

Der Restriktionsverdau wurde im Experiment 4 analysiert.