6 Native PAGE
Methode
Durch die Native-PAGE wird ein Proteingemisch in seine Bestandteile aufgetrennt. Die Proteine werden bei diesem PAGE nicht denaturiert, sondern liegen vor als auch nach dem PAGE in ihrer Tertiärstruktur vor. Die Auftrennung erfolgt aufgrund der Proteingrösse und des isoelektrischen Punktes der Proteine.
Experimentelles Vorgehen
Das Experiment wurde gemäss Anleitung durchgeführt. Das Trenngel wurde in die Giessapparatur gegossen und anschliessend polymerisiert. Das Stacking-Gel wurde über das polymerisierte Gel gegossen und ein Kamm hineingesteckt. Das Gel wurde aus der Apparatur genommen und in die Elektrophoreseapparatur eingespannt. Der Kamm wurde entfernt, in die Kammern wurdeElektrophoresepuffer (TBE-Puffer) hineingegeben und die Apparatur gekühlt. Anschliessend wurden Proben von vor und nach der Säulenchromatografie auf das Gel aufgetragen. Die Elektrophorese wurde gestartet. Das Gel wurde nach Betrachtung unter UV-Licht mit Coomassie-Blue eingefärbt.
Resultate
Die Resultate entsprachen nicht den Erwartungen. Im Gel 1 wiesen beide gewaschenen Proben nach der Säulenchromatografie eine fluoreszierende Bande auf (siehe Abbildung 27). Die ungewaschenen Proben wiesen keine Banden auf. Im Gel 2 wiesen sowohl die gewaschenen als auch die ungewaschenen Proben vor der Säulenchromatografie jeweils mehrere fluoreszierende Banden auf (siehe Abbildungen 28 und 30). Die Leiter wies in beiden Gels vier grün fluoreszierende Banden auf (siehe Abbildungen 27-30).
Abbildung 27: Gel 1 unter UV-Licht
Abbildung 28: Gel 2 unter UV-Licht
Legende:
ungewaschen (u)
gewaschen (g)
Abbildung 29: Mit Coomassie-Blue gefärbtes Gel 1
Abbildung 30: Mit Coomassie-Blue efärbtes Gel 2
Auswertung:
Die Native-PAGE ist eine Variante der Gelelektrophorese, die der Auftrennung der Proteine dient. Da beim Native-PAGE die Proteine nicht denaturiert werden, sondern in ihrer Tertiärstruktur vorliegen bleiben, kann diese Analysemethode nicht genau mit dem Proteinstandard (wie beim SDS-PAGE) verglichen werden.
Für die Elektrophorese des Native-Gels wird ein Gel, bestehend aus Trenngel und Stacking-Gel benötigt, wodurch die Proteine hindurchsickern können.
Das Gel besteht aus unterschiedlichen Komponenten:
Acrylamid-BIS: Ein Monomer, das zusammen mit APS polymerisiert wird. Es resultiert eine Fadenbildung, an welchen die Proteine im späteren Verlauf hängenbleiben. Daraus ergibt sich eine elektrophoretische Trennung des zu untersuchenden Proteins.
TBE: Dient der Trennung kleiner DNA-Fragmente und als Laufpuffer in der Elektrophorese
TEMED: Ist ein Polymerisationskatalysator und dient der Weiterleitung der Elektrizität im Gel
10% APS: Dient als Starter der Polymerisation für das Gel
Für das Trenngel und das Stacking-Gel wird eine unterschiedliche Konzentration an Acrylamid-Konzentration verwendet. Die Acrylamid-Konzentration hat einen Einfluss auf die Aufteilung des Proteins. Das Stacking-Gel weist eine niedrigere Acrylamid-Konzentration auf, wodurch die Porengrösse grösser (geringere Fadenbildung) ist und somit die Trennung der Proteine erleichtert. Die höhere Acrylamid-Konzentration des Trenngels bewirkt aufgrund der niedrigeren Porengrösse (erhöhte Fadenbildung) eine Trennung anhand der Grösse der Proteine.
Das zu trennende Proteingemisch wird nun im elektrisch geladenen Gel getrennt. Dabei wandern die Proteine je nach Ladung und Grösse unterschiedlich weit. Durch die niedrige Acrylamid-Konzentration sickern die kürzeren Proteine während der Elektrophorese weiter durch das Gel als die grösseren Proteine, die durch die Fadenbildung von Acrylamid-BIS weiter oben auf dem Gel sichtbar sind. Es bildet sich ein charakteristisches Bandenmuster, das anschliessend durch UV-Licht betrachtet werden kann.
Da die Fluoreszenz des aufgetrennten Proteingemischs nach kurzer Zeit verschwindet, wurde das Gel in einer Färbelösung, bestehend aus Coomassie-Blue eingefärbt. Die aufgetrennten Proteine werden dadurch eingefärbt und sind somit auch ohne UV-Licht erkennbar.
Die Resultate aus den Experimenten entsprachen nicht den Erwartungen. Es wäre zu erwarten gewesen, dass mit der ungewaschenen Probe Banden von verschiedenen Proteinen erhalten werden. Mit der gewaschenen Probe hingegen nur eine Bande für das GFP-Protein. In Abbildung 27 ist das GFP unter UV-Licht zu erkennen. Der Grund für die Ergebnisse liegt in der unsauberen Versuchsdurchführung. In einige Taschen wurde die doppelte und somit zu hohe Konzentration an Probe gegeben, während einige Taschen leer blieben. Die ausbleibenden bzw. schlechten Resultate des Native-PAGE haben keinen Einfluss auf den weiteren Praktikumsverlauf. Dieses PAGE wurde zu didaktischen Zwecken durchgeführt und stellt somit keine Grundlage für Experiment 7 dar.