Phase 2: Vorbereitung der Säule

Methode:

In Phase 1 wurden die leuchtende Bakterienkolonie lysiert. Der entstandene Überstand und die Säule wurde für die Säulenchromatographie in Phase 3 vorbereitet.

Experimentelles Vorgehen:

Das Experiment wurde gemäss Anleitung durchgeführt. Die eingefrorene Probe mit den lysierten Bakterien wurden aufgetaut und zentrifugiert. Die Säule wurde durch hinzufügen von Äquilibrierungspuffer vorbereitet. Ein Teil des Überstandes wurde mit Bindungspuffer ergänzt und wieder in die Gefriertruhe gegeben.

Resultate:

Der Überstand wies nach dem Auftauen und der anschliessenden Zentrifugation eine grüne Fluoreszenz auf (siehe Abbildung 20). Das Pellet wies eine schwache grüne Fluoreszenz auf.

Auswertung:

Durch das Gefrieren und anschliessende Zentrifugieren der lysierten Bakterien aus Phase 1 wurden alle Zellwände der Bakterien zerstört. Die Rückstände der Bakterien (bakterielle Zellwände, Chromosomale DNA, Membrane) befinden sich im Pellet. Das GFP wurde durch die Lyse aus den Bakterien freigesetzt, weshalb sich eine (sehr) geringe Konzentration an GFP im Pellet befindet, wodurch das Pellet nur eine schwache grüne Fluoreszenz aufweist. Der Überstand wies eine grüne Fluoreszenz auf, da das GFP von den Bakterien freigesetzt wurde und in den Überstand gelangte. Das Pellet ist nicht mehr relevant für die Experimente und kann entsorgt werden.

Bevor die Säule für die Auftrennung von GFP verwendet werden kann, muss die Säule mittels Äquilibrierungspuffer äquilibriert werden. Hierzu wurde die Salzkonzentration der Säule auf die des bakteriellen GFP-Lysats angepasst, damit sich ein Gleichgewicht zwischen Säulenmaterial und dem Laufmittel einstellte.

Der Überstand wird nun mit dem Bindungspuffer (sehr hohe Salzkonzentration; 4M) ergänzt. Somit kann im nächsten Schritt (Phase 3) das GFP von den anderen Proteinen getrennt werden. [1]