Phase 3: Transformation von E.coli

Methode

Durch die Transformation wird Plasmid-DNA in Bakterien eingeschleust. Damit die Aufnahme reiner Plasmid-DNA effizienter wird, werden die Bakterien kompetent gemacht. Nach der Aufnahme von Plasmid-DNA werden die Bakterien selektioniert.

Experimentelles Vorgehen

Das Experiment wurde gemäss Anleitung durchgeführt. Eine E. coli Kolonie von der Starter-Platte wurde mit Transformationslösung und CaCl2-Lösung zusammengegeben. Die Lösung wurde anschliessend auf -pGLO und +pGLO beschriftete Eppendorfröhrchen aufgeteilt und ins Eisbad gegeben. Rehydrierte pGLO-PlasmidDNA wurde der Probe mit +pGLO hinzugefügt. Die Proben wurden inkubiert und für den Hitzeschock in ein heisses Wasserbad gegeben. Den Proben wurde LB-Broth hinzugefügt und erneut inkubiert. Die Proben mit +pGLO und -pGLO wurden nun wie folgt auf die in Phase 2 vorbereiteten Platten gegeben:

• LB -pGLO

• LB/Amp -pGLO

• LB/Amp +pGLO

• LB/Amp/ARA +pGLO

• LB/Amp/ARA/GLC +pGLO

Die Agarplatten wurden anschliessend über Nacht inkubiert.

Resultate

Die entstandenen Bakterienkolonien auf den Agarplatten LB/Amp/Ara + pGLO sowie LB/Amp/ARA/GLC + pGLO wiesen unter UV-Licht eine grüne Fluoreszenz auf (siehe Abbildung 7). Auf der Agarplatte von LB/Amp -pGLO wuchs keine Bakterienkolonie. Auf den Agarplaten von LB -pGLO, LB/Amp -pGLO und der Starter-Platte wuchsen nicht-fluoreszierende Bakterienkolonien.

Auswertung

In diesem Schritt wurde Plasmid-DNA in Bakterien eingeschleust. Damit die Bakterien die Plasmid-DNA effizienter aufnehmen können, müssen die Bakterien kompetent gemacht werden. Die Kompetenz erlaubt es den Bakterien im Medium frei vorhandene DNA aufzunehmen, das zur Transformation der Bakterien führt. Die Kompetenz wird durch Behandlung mit CaCl2-Lösung und Hitzeschock-Behandlung erreicht. Dem +pGLO beschrifteten Röhrchen wird rehydrierte pGLO-Plasmid-DNA hinzugefügt, die nach der Inkubation von den Bakterien verarbeitet werden kann. Das hinzugefügte LB-Broth dient als Nährlösung zur Kultivierung von Bakterien.

Das pGLO codiert für GFP und steht unter der Kontrolle von PBAD. PBAD wird durch Anwesenheit von Arabinose im Nährmedium induziert, aber durch die Anwesenheit von Glucose beeinflusst.

Der Abbau von Arabinose erfolgt durch die Transkription des Promotors PBAD. Damit die Transkription stattfinden kann, müssen RNA-Polymerase, AraC und Arabinose vorhanden sein. Ist Arabinose vorhanden, wird die Bindung der RNA-Polymerase an den PBAD-Promotor gefördert. Diese Bindung bewirkt die Transkription des GFP-Gens in die mRNA und die anschliessende Übersetzung in GFP, was sich als grüne Fluoreszenz unter UV-Licht äussert. Ist Arabinose nicht vorhanden, wird das GFP-Gen nicht exprimiert und die Bakterien weisen eine weisse, nicht-grün fluoreszierende Kolonie auf (ein sogenannter Wildtyp Phänotyp). Ist Arabinose als auch Glucose als Kohlenstoffquelle verfügbar, wird GFP in geringen Mengen umgesetzt, was in einer schwächeren grünen Fluoreszenz resultiert.

Ist kein Plasmid vorhanden (-pGLO), weisen die Bakterien keinen Selektionsfaktor auf und weisen keine grüne Fluoreszenz auf.

Die Resultate der erhaltenen (nicht-)fluoreszierenden Bakterienkolonien lassen sich somit wie folgt erklären:

• LB -pGLO: Bakterienkolonie wächst, aber weist keine Fluoreszenz auf. Dies, weil durch -pGLO kein Selektionsfaktor vorhanden ist.

• LB/Amp -pGLO: Bakterienkolonie wächst nicht, da Bakterien nicht resistent sind gegen Ampicillin (Antibiotikum)

• LB/Amp +pGLO: Bakterienkolonie wächst, da Bakterien resistent gegen Ampicillin sind, weisen jedoch keine Fluoreszenz auf, da weder Arabinose noch Glucose vorhanden sind.

• LB/Amp/ARA +pGLO: Wachstum von fluoreszierenden Bakterienkolonien. Dies weil Arabinose vorhanden ist und Gen zur Produktion von GFP eingeschaltet werden kann

• LB/Amp/ARA/GLC +pGLO: Bakterienkolonien weisen eine schwache Fluoreszenz auf. Dies, weil GFP nur gering umgesetzt werden konnte, da Arabinose als auch Glucose vorhanden waren.