Phase 2: Gel-Elektrophorese 

Experimentelles Vorgehen

Das Experiment wurde gemäss Anleitung durchgeführt. 4 µl Ladepuffer wurden zu der geschnittenen Plasmid-DNA aus Experiment 3 in ein Eppendorfröhrchen gegeben. Es wurden 2 Proben hergestellt; mit gekauftem Plasmid und mit selbst gewonnenem Plasmid. Die Proben wurden zentrifugiert und in eine leere Tasche des Agarose-Gels aus Phase 1 pipettiert. Die DNA-Leiter wurde ebenfalls in eine Tasche des Gels gegeben.

Die Elektrophorese wurde mit dem vorbereiteten Gel durchgeführt, wozu sich die Taschen mit den Proben beim Minuspol der Kammer befinden mussten.

Resultate

Auf den Abbildungen 15,16 und 17 (siehe unten) sind fluoreszierenden Banden sichtbar, welche aus den durch Farbe markierten DNA-Strängen bestehen. Die Proben des selbst gewonnenen Plasmids ergaben keine fluoreszierenden Banden. Die Pfeile bei den Abbildungen zeigen die DNA-Leiter. Die Banden sind mit der genauen, in Experiment 3 errechneten Anzahl Basenpaaren (bp) beschriftet: 

• Gel 1 (siehe Abbildung 15)

Verwendete Restriktionsenzyme: BamH1 und HindIII

Entstandene DNA-Fragmente: 4496 bp, 399 bp, 226 bp, 220 bp und 30 bp

• Gel 2 (siehe Abbildung 16)

Verwendete Restriktionsenzyme: BamH1 und Pst I

Entstandene DNA-Fragmente: 3429 bp, 1075 bp, 625 bp, 220 bp, 22 bp

• Gel 3 (siehe Abbildung 17)

Verwendete Restriktionsenzyme: Hind III und EcoRI

Entstehende DNA-Fragmente: 4722 bp, 598 bp, 51 bp

Auswertung

Der Ladepuffer, welcher den Proben hinzugefügt wird, stabilisiert den pH-Wert der Probe. Zudem enthält er wasserlösliche, elektrisch neutrale Moleküle mit einer höheren Dichte, welche die Dichte der Probe erhöhen. So wird sichergestellt, dass die Proben in die Taschen einsinken. Damit man erkennen kann wie weit die Proben bereits liefen und die Elektrophorese rechtzeitig beenden kann, enthalten Probenpuffer zusätzlich auch Farbstoffe. Durch das Anlegen eines elektrischen Feldes in der Elektrophorese-Kammer bewegen sich die negativ geladenen DNA-Fragmente zum Pluspol. Die grösseren DNA-Fragmente bewegen sich weniger weit durch das Gel als die kleineren DNA-Fragmente (siehe Auswertung Phase 1). Daraus resultiert eine Auftrennung der DNA-Fragmente nach der Grösse. [1] Die DNA-Leiter dient als Referenz zur eigenen Probe. Die Längen der darin enthaltenen DNA-Stränge sind bekannt. Durch das Vergleichen der Banden der DNA-Leiter mit denen der eigenen Probe kann dann auf die Länge der DNA-Fragmente der eigenen Probe geschlossen werden.

Die Gel-Elektrophorese ist ab gewissen Werten nicht mehr aussagekräftig. DNA-Fragmente mit kleinen Grössenunterschieden können kaum getrennt werden. So kann im Gel 1 (Abbildung 15) zwischen den Fragmenten mit 226 bp und 220 bp nicht unterschieden werden. Die DNA-Fragmente mit einer kleineren Grösse als 11 bp sind oftmals nicht sichtbar auf dem Gel, weil diese Fragmente bereits unten aus dem Gel herauslaufen oder weil sie aufgrund der geringen DNA-Menge nicht genügend Farbstoffe an die DNA binden kann, damit die Bande ausreichend fluoresziert. Beispielsweise sollte im Gel 2 (Abbildung 16) bei 22bp eine Bande für ein geschnittenes DNA-Fragment sichtbar sein. 

Obwohl mit den selbstgewonnenen Plasmiden keine Resultate erzielt wurden, ist das Experiment dennoch erfolgreich. Dies, weil die Ergebnisse der gekauften Plasmide bis auf geringe Abweichungen den berechneten Werten aus Experiment 3 entsprechen. 

Da bei allen Versuchen mit den selbstgewonnenen Plasmiden keine Resultate erzielt wurden, kann der Fehler nicht in der Versuchsdurchführung liegen. Für die Gewinnung der Plasmide in Experiment 3 wurden ältere Chemikalien und bereits mehrfach benutze Säulen verwendet, was der Grund dafür sein könnte, dass keine Resultate erzielt wurden. Zudem reagieren die Enzyme sehr empfindlich auf Calcium. Enthält ein verwendeter Puffer Spuren von Calcium, kann kein Resultat erzielt werden.