2 Gewinnung von Plasmid-DNA
In diesem Experiment wurde Plasmid-DNA (Minipräp) gewonnen. Es wurde nur die niedermolekulare Plasmid-DNA der Bakterien gereinigt und isoliert.
Theorie
Plasmid-DNA transformierte Bakterien wurden in ein antibiotisches LB-Medium vermehrt, dabei vervielseitigt sich ebenfalls die eingeschleuste Plasmid-DNA. Um die Plasmid-DNA wieder zu isolieren, wurden verschiedene Schritte durchgeführt: die Verdauung der Zellwände und die Zerstörung der Membran durch Detergenzien (erleichtern den Reinigungsprozess). Die Bakterien besitzen neben der Plasmid-DNA ebenfalls ihre hochmolekulare Chromosomen-DNA, welche von der Plasmid-DNA abgetrennt werden musste. Durch Zentrifugation wurde die chromosomale DNA zusammen mit den Zelltrümmern entfernt. Die chromosomale DNA ist noch an der Zellmembran angeheftet. Mittels der Säulen-Chromatographie (Minipräp) wurde die Plasmid- DNA aus dem Überstand gewonnen.
Abbildung 9: Gewinnung von Plasmid DNA.
Experimentelles Vorgehen
Die Übernachtkultur wurde zentrifugiert (siehe Abbildung 10), der Überstand entfernt und Zell-Resuspensions-Lösung sowie Zell-Lyse-Lösung und Neutralisationslösung hinzugegeben. Die Quantum-Prep-Matrix wurde in den Spin-Filter gegeben, in welches anschliessend der erhaltene Überstand aus der Zentrifugation gegeben wurde. Nach dem Ersetzten des Spin-Filters wurde Waschpuffer hinzugefügt und das Eluat erneut zentrifugiert. Abschliessend wurde der Probe deionisiertes H2O hinzugefügt, zentrifugiert und im Kühlschrank gelagert.
Abbildung 10: Proben in der Zentrifuge
Resultate
Nach der Zentrifugation erhielt man ein weisses Pellet (siehe Abbildung 11).
Abbildung 11: Weisses Pellet nach Zentrifugation.
Auswertung
Die Zellsuspension wurde zentrifugiert und in eine Zelllyse-Lösung resuspendiert, die Detergenzien enthielt, welche die Zellmembran aufbrach (siehe Abbildung 9). Nach dem Hinzufügen der Neutralisationslösung und dem anschliessenden Zentrifugieren, hat sich ein weisses Pellet (siehe Abbildung 11) gebildet. So wurde das Plasmid von der restlichen DNA getrennt.
Das Quantum-Prep-Matrix wurde verwendet, um schneller von der Zellkultur zur gereinigten Plasmid-DNA zu gelangen. Der Spin-Filter wurde eingefügt, um Partikel aus der Probe zu entfernen. Der Waschpuffer wurde hinzugefügt, um das Ethanol zu entfernen. Ist Ethanol in der Umgebung der DNA vorhanden, wird der DNA Wasser entzogen, wodurch die Löslichkeit sinkt. Das deionisierte H2O dient dem Herauslösen der Plasmid-DNA aus dem Pellet, sodass sich die Plasmid-DNA durch das Zentrifugieren gut aus dem Pellet eluieren kann.
Diese Plasmid-DNA wurde im Experiment 3 weiterverwendet.