Phase 1: Lyse der Bakterien

Methode

Die transformierten Bakterien in der Flüssigkultur haben durch die Anwesenheit von Arabinose GFP produziert. Die Bakterienzellen werden durch Zentrifugieren pelletiert und anschliessend mit Lysozym lysiert. Anschliessend wird das GFP mittels Säulenchromatografie aufgereinigt gewonnen.

Experimentelles Vorgehen

Das Experiment wurde gemäss Anleitung durchgeführt. Die Bakterienzellen wurden durch Zentrifugation pelletiert und der entstehende Überstand entfernt. Durch Hinzufügen von TE-Puffer wurden die Bakterien suspendiert. Der Bakteriensuspension wurde eine Lysozymlösung hinzugegeben und das Eppendorfröhrchen mit der Probe in die Gefriertruhe gegeben.

Resultate

Das erhaltene Pellet und die Bakteriensuspension wiesen unter UV-Licht eine grüne Fluoreszenz auf (siehe Abbildung 18). Der zu entfernende Überstand wies nach der Zentrifugation keine Fluoreszenz auf (siehe Abbildung 19).

Auswertung

Durch das Zentrifugieren setzen sich die schweren Bestandteile der Zellen (Zellkerne, Mitochondrien, Lysosomen etc.) als Pellet am Boden des Eppendorfröhrchens ab.

Das Pellet wies unter UV-Licht eine grüne Fluoreszenz auf, da sich die GFP enthaltenden Bakterien im Pellet befinden. Durch TE-Puffer bestehend aus dem Puffermittel Tris und dem Chelatbildner EDTA werden die pelletierten Bakterien resuspendiert.

Der Bakteriensuspension wurde Lysozym-Lösung hinzugegeben, die durch ihre bakterizide Wirkung die Zellwand der Bakterien zerstört. Es bewirkt eine Zerstörung der Verbindungen zwischen den Zuckern durch Hydrolyse. Durch diese Zerstörung wird die äussere Zellmembran geschädigt und aufgelöst; der Vorgang wird als Lyse bezeichnet. Neu entstehende Bakterien können keine stabile Zellwand aufbauen und lysieren. Bereits existierende Bakterien werden nur zum Teil abgetötet. Die endgültige Abtötung der Bakterien erfolgt schlussendlich durch die tiefe Temperatur der Gefriertruhe.