7 SDS-PAGE

Methode

Mit einem SDS-PAGE wird ein Proteingemisch in seine einzelnen Proteine aufgeteilt. Die Trennung erfolgt durch das unterschiedliche Molekulargewicht der Proteine. Im Gegensatz zum Native Page werden beim SDS-Page die Proteine denaturiert. Die Proteine weisen eine unterschiedliche Länge auf und sickern dadurch unterschiedlich weit durch das Gel. Längere Proteine sind deshalb im SDS-PAGE eher oben, kürzere Proteine eher unten sichtbar. Daraus entsteht für jedes Proteingemisch eine typische Bandenstruktur, wie sie in Abbildung 32, 33 und 34 dargestellt ist.

Experimentelles Vorgehen

Dieses Experiment wurde gemäss Anleitung durchgeführt. Nach der Herstellung des Gels, bestehend aus Trenngel und Stacking gel, wurde der Elektrophorese-Puffer (Lämmlipuffer) in die Kammern gefüllt. Die vorbereiteten Proben wurden in die Taschen gegeben und die Elektrophorese durchgeführt. Die Gels wurden abschliessend mit Coomassie-Färbelösung eingefärbt. Die Resultate der SDS-PAGE wurde zur Auswertung mit der Sequenzleiter (siehe Abbildung 31) verglichen.

Resultate

Das GFP wies im SDS-PAGE keine Fluoreszenz auf. Das GFP mit einem Molekulargewicht von 26.9 kDa war auf allen 3 Gels als Bande sichtbar. Bei den ungewaschenen Proben befanden sich mehr Banden für Proteine im Gel als in den gewaschenen Proben. Besonders die ungewaschene Probe der Gruppe 3 wies eine hohe Dichte an Banden auf.

Auswertung

Das Trenngel für die SDS-PAGE weist dieselben Komponenten auf wie das Trenngel für die Native-PAGE. Zusätzlich wurden SDS und Tris/HCl hinzugegeben. SDS, ein starkes Detergens, dient der Denaturierung der Proteine, damit sie in der Primärstruktur anstelle der Tertiärstruktur vorliegen. Tris/HCl puffert in einem pH-Bereich von pH 7 bis pH 9 ab und dient der Stabilisierung der Elektrophorese. Auf das Trenngel wird wiederum ein Stacking gel gegeben, das eine niedrigere Acrylamid-Konzentration enthält als das Trenngel (Erklärung siehe Auswertung Experiment 6).

Da die Proteine im SDS-PAGE denaturiert werden, ist die Trennung der Proteine ausschliesslich von der Proteinlänge und dessen Molekulargewichts abhängig. Längere Proteine sickern weniger weit nach unten als kürzere Proteine. Der isoelektrische Punkt hat, anders als beim Native-PAGE, keinen Einfluss auf die Auftrennung, da die Eigenladung der Proteine durch das SDS überdeckt wird.

Da das GFP als auch die anderen Proteine denaturiert werden, geht die Fluoreszenz von GFP verloren. Deshalb wird die SDS-PAGE mit Coomassie-Blue eingefärbt, um die Banden der Proteine sichtbar zu machen.

Der Lämmlipuffer dient als Elektrophoresepuffer. Dabei dienen die Komponenten Tris/HCl als Puffersubstanz, SDS zur Proteindenaturierung und Glycin als Probenverdichter, damit die Proben besser auf das Gel aufgetragen werden können.

Der Probenpuffer mit den Komponenten Tris/HCl, SDS, Glycerol, EDTA als Chelatbildner und Mercaptomethanol dient der Stabilisierung des pH-Wertes. Mercaptomethanol dient dem Aufbrechen der Disulfidbrücken, damit jedes Protein in seiner vollen Länge bzw. Strang vorliegt und die Auftrennung erfolgen kann.

Da die ungewaschenen Proben nicht aufgereinigt wurden, befanden sich mehr Proteine im Proteingemisch.

Dementsprechend sind mehr Banden vorhanden als in der aufgereinigten Probe. Es ist anzunehmen, dass mit einer mehrfach durchgeführten Aufreinigung mittels Säulenchromatografie weniger Banden von andern Proteinen erzielt worden wären. Das GFP weist, wie anhand seines Molekulargewichts erwartet, eine Bande bei 26.9 kDa auf. Die hohe Dichte an Banden der ungewaschenen Probe von Gruppe 3 (siehe Abbildung 34) deutet auf eine deutlich unreinere Probe hin als bei Gruppe 1 und 2 (siehe Abbildung 33 und 32). Ein Grund dafür könnte auch in einer erhöhten Konzentration an ungewaschener Probe liegen.