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Methode
Der GFP enthaltende Überstand wurde mittels Säulenchromatografie aufgetrennt bzw. aufgereinigt. Hierzu wurden die Proteine durch verschiedene Salzkonzentrationen ausgewaschen, wodurch reines GFP erhalten wird.
Experimentelles Vorgehen
Das Experiment wurde gemäss Anleitung durchgeführt. Die Probe mit den lysierten Bakterien und dem Bindungspuffer wurde in die Säule gegeben und die Flüssigkeit in RG 1 gesammelt. Der Säule wurde Waschpuffer hinzugegeben und die Flüssigkeit in RG 2 gesammelt. Nach dem Waschpuffer wurde TE-Puffer hinzugefügt um das GFP herauszuwaschen. Mit UV-Licht wurde beobachtet, wann GFP aus der Säule austrat um eine möglichst hohe Konzentration von GFP in RG 3 zu erhalten.
Resultate
Die Beobachtung der Säule unter UV-Licht zeigte GFP nach hinzufügen von Binding-Puffer als Band am oberen Rand der Säule. Nach hinzufügen des Wash-Puffers war GFP als breites Band am oberen Rand der Säule sichtbar (siehe Abbildung 22 und 23). Nach dem Hinzufügen von Elutions-Puffer floss das GFP als "Ring" von oben nach unten (siehe Abbildung 24) und wurde schlussendlich in RG 3 ausgewaschen (siehe Abbildung 25).
Nur die eluierte Flüssigkeit in RG 3 wies eine grüne Fluoreszenz auf, RG 1 und RG 2 wiesen keine Fluoreszenz auf.
Abbildung 22: GFP eluiert durch die Säule
Abbildung 23: GFP eluiert durch die Säule
Abbildung 24: GFP eluiert durch die Säule
Abbildung 25: Das grün fluoreszierende GFP eluiert aus der Säule
Abbildung 26: Die Eluate aller RG's im Vergleich. Links: RG 1, Mitte: RG 2, Rechts: RG 3
Auswertung
Für die Auftrennung der Proteine wird die hydrophobe Interaktionschromatografie (HIC) verwendet. Die Trennung basiert auf der Wechselwirkung hydrophober Bereiche von Proteinen mit den weniger hydrophoben Bereichen der stationären Phase in der Säulenchromatografie. Das GFP weist hydrophobere Eigenschaften auf als die meisten anderen Proteinen die im Überstand enthalten sind. Durch diese Eigenschaft kann GFP mittels HIC von den anderen Proteinen aufgetrennt werden. Das Salz verursacht eine Konformationsänderung der Proteine, sodass sich die hydrophoben Regionen gegen aussen richten, während sich die hydrophilen Regionen ins Innere des Proteins richten. Mit Puffern unterschiedlicher Salzkonzentrationen können nun die Proteine aufgrund ihrer Hydrophobie ausgewaschen werden:
Durch den Bindungs-Puffer (sehr hohe Salzkonzentration; 4 M) wird GFP an die Säule gebunden und die Salzkonzentration von GFP erhöht; dadurch geschieht eine Konformationsänderung des GFPs,, die in einer Freilegung der hydrophoben Regionen resultiert.
Der Waschpuffer (mittlere Salzkonzentration; 1.3 M) bewirkt die Auswaschung der unerwünschten, weniger hydrophoben Proteine aus der Säule. Durch die sehr hydrophoben Eigenschaften des GFPs verbleibt das GFP in der Säule und wird nicht ausgewaschen. Der Schritt kann beliebig oft mit Waschpuffer durchgeführt werden; wodurch mit jeder Aufreinigung weniger unerwünschte Proteine in der Säule verbleiben.
Der TE-Puffer (niedrige Salzkonzentration; 10 mM) bewirkt die Herauslösung des GFPs aus der Säule. So wird schlussendlich das aufgereinigte GFP in RG 3 erhalten (siehe Abbildung 26).
Das Eluat in RG 3 fluoresziert unter Betrachtung von UV-Licht grün; GFP wurde somit erfolgreich aufgetrennt.
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